姚心怡 陸定其 馮 波 陳麗瑩 何詩雅 王新昌

風濕免疫疾病泛指影響關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉、神經(jīng)、血管及有關(guān)軟組織或結(jié)締組織，在遺傳及表觀遺傳學、環(huán)境等多種因素共同作用下導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能紊亂的一類自身免疫性疾病。目前對風濕性疾病的發(fā)病機制仍缺乏深入認識。風濕性疾病早期診斷困難，精準治療已經(jīng)成為風濕病疾病治療的遠大前景，雖有一些靶向藥物上市，但仍缺乏廉便有效的根治手段。DNA 甲基化（DNA methylation）作為DNA 化學修飾的一種形式，能通過影響DNA 構(gòu)象、DNA 穩(wěn)定性及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等過程影響基因表達。DNA 甲基化大多發(fā)生在基因啟動子區(qū)CpG 島上，基因啟動子區(qū)的DNA 甲基化可抑制基因轉(zhuǎn)錄。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、干燥綜合征（Sjgresyndrome，SS）、類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床最具有代表意義的風濕性疾病，本文就DNA 甲基化在這三種疾病的發(fā)病機制、臨床特征以及藥物治療反應(yīng)三方面的作用，綜述如下。

1 DNA 甲基化

DNA 甲基化是存在于真核細胞中的一種普遍的修飾方式，也是哺乳動物基因表達調(diào)控的主要表觀遺傳學形式，其在胚胎發(fā)育、染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄、基因印跡、X 染色體失活等眾多過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DNA 甲基化是指由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl transferase，DNMT）介導(dǎo)，從S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）到CpG 二核苷酸中胞嘧啶殘基的碳5 位置的甲基轉(zhuǎn)移，生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）的過程。DNA 甲基化過程由DNMT3 建立，并在細胞分裂過程中由DNMT1維持。通常認為基因啟動子區(qū)域中的甲基化CpG 位點通過與甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白（如甲基CpG 結(jié)合域蛋白1、甲基CpG 結(jié)合域蛋白2 和甲基CpG 結(jié)合蛋白2 等）結(jié)合而干擾基因轉(zhuǎn)錄，又稱“基因沉默”，DNA 甲基化可抑制基因轉(zhuǎn)錄，而DNA 去甲基化則激活基因的表達。10 -11 易位（Ten -Eleven -Translocation，TET）蛋白可將DNA 胞嘧啶5 位碳的甲基氧化生成羥基，從而催化5-mC 羥基化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）[1]。在胸腺嘧啶DNA 糖基化酶（thymine DNA glycosylase，TDG）和去甲基酶的共同作用下，5-hmC 可逆轉(zhuǎn)5-mC 修飾。此外，甲基化修飾也是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種形式，組蛋白的甲基化與去甲基化變化能通過干預(yù)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、DNA 的轉(zhuǎn)錄過程，對炎癥因子的產(chǎn)生、免疫環(huán)境的失衡造成影響。組蛋白是負責維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要蛋白質(zhì)，并在基因的動態(tài)和長期調(diào)控中發(fā)揮作用。一般認為，組蛋白修飾與基因的激活與抑制均有關(guān)系，例如：H3 賴氨酸4（H3 Lysine 4，H3K4）的甲基化是活躍轉(zhuǎn)錄DNA 的標志，而H3 賴氨酸9（H3 Lysine 9，H3K9）的甲基化與抑制基因表達有關(guān)[2]。上述的甲基化修飾方式不改變基因序列而參與調(diào)控基因表達，具有一定的穩(wěn)定性與動態(tài)性，因而能使真核細胞生物能在遺傳和環(huán)境的共同作用下參與疾病的發(fā)生和進展。

2 DNA 甲基化揭示風濕性疾病發(fā)病機制

2.1 DNA 甲基化與SLE 發(fā)病機制 SLE 是一種可累及全身多系統(tǒng)的慢性難治性自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡期女性。DNA 甲基化與SLE 疾病發(fā)生和維持相關(guān)，基因啟動子甲基化被提議作為SLE 的生物標志物[3]。

研究證明，DNA 甲基化抑制藥物如普魯卡因胺、肼丙嗪能誘發(fā)野生型小鼠狼瘡樣疾病[4]；幾項全基因組DNA 甲基化研究發(fā)現(xiàn)，SLE 患者存在整體DNA甲基化缺陷，且Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）信號相關(guān)基因的差異甲基化在SLE 發(fā)病中具有重要意義。Busche 等[5]對健康對照和SLE 患者外周血單個核細胞進行全基因組DNA 甲基化分析，發(fā)現(xiàn)85%的CpG位點在SLE 中低甲基化，其中幾種主要的IFN 相關(guān)基 因 如 下 ：MX1、IFI44L、PARP9、DTX3L、IFI44、PLSCR1、IRF7、IFIT1 和RSAD2。除幼稚CD4+T 細胞外，IFN 相關(guān)基因在SLE 患者記憶、幼稚和調(diào)節(jié)性T細胞中均表現(xiàn)出顯著的低甲基化[6]。另有研究表明，SLE 患者B 細胞中IFN 相關(guān)基因低甲基化狀態(tài)與早期B-細胞因子1（recombinant early B-cell factor 1，EBF1）重組蛋白結(jié)合CpG 位點的作用相關(guān)[7]。SLE差異甲基化的基因在先天免疫系統(tǒng)、FasL/CD95L 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、中性粒細胞脫顆粒等生物學過程中富集，差異甲基化基因與風險基因單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了7 個與SNPs 關(guān)聯(lián)的基因座：CD45、MHC-ClassIII、UHRF1BP1、IRF5、IRF7、IKZF3 和 UBE2L3，由此推測SLE 風險位點變異可能通過基因調(diào)控區(qū)的DNA 甲基化改變來影響疾病表型[8]。

2.2 DNA 甲基化與SS 發(fā)病機制 SS 是一種侵犯全身外分泌腺，伴有多系統(tǒng)損害的慢性自身性免疫性疾病。Altorok 等[9]首次報道SS 的表觀基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在SS 患者CD4+T 細胞中主要是淋巴毒素α（lymphotoxin-alpha，LTA）和IFN 誘導(dǎo)基因相關(guān)位點發(fā)生低甲基化，并且編碼溶質(zhì)載體蛋白的基因如SLC11A1、SLC11A2、SLC22A23、SLC25A25 等也呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。美國俄克拉荷馬大學健康科學中心發(fā)現(xiàn)，與SS 最相關(guān)的基因遺傳座存在于主要組織相容性復(fù)合體/人類白細胞抗原（major histocompatibility complex/human leukocyte antigen，MHC/HLA）區(qū)，且與IRF5、BLK、IL12A、TNIP1、CXCR5 等基因密切相關(guān)，證明SS 的發(fā)病與B 細胞活化、通過IFN 的先天免疫系統(tǒng)激活、HLA 敏感性和IL-12-IFNγ 軸反應(yīng)相關(guān)[10]。與此對應(yīng)，在Miceli-Richard 等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，在SS 患者CD19+B 細胞中IFN 誘導(dǎo)基因位點差異甲基化最為顯著，這也進一步佐證了通過IFN的先天免疫系統(tǒng)的激活是SS 的主要發(fā)病機制之一。對SS 患者外周血全基因組DNA 甲基化進行的研究，同樣觀察到IFN 誘導(dǎo)的基因如MX1、IFI44L、PARP9 和IFITM1 等位點存在明顯低甲基化，且TNFRSF10A、IRF8、CXCR5、LTA、SOCS1、TNF、BCL2、PSMB2 和PIK3CD 等基因位點差異甲基化與淋巴瘤有關(guān)[12]。Cole 等[13]對SS 患者的唾液腺進行了全基因組DNA 甲基化研究，發(fā)現(xiàn)了LTA 基因的低甲基化，這與Altorok 等[9]對外周血全基因組甲基化分析的結(jié)論相互印證，提示我們LTA 在SS 發(fā)病過程中的潛在作用，LTA 可能是SS 研究的新靶點。

此外，一些針對SS 具體基因位點DNA 甲基化狀態(tài)的研究也為我們提供了許多有意義的參考。Yu等[14]發(fā)現(xiàn)SS 患者CD4+T 細胞FOXP3 啟動子區(qū)CpG位點DNA 甲基化水平顯著增高，且與FOXP3 mRNA 及蛋白表達呈負相關(guān)，F(xiàn)OXP3 啟動子區(qū)域位點甲基化水平升高可使FOXP3 表達降低，從而促使調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory cells，Treg）發(fā)育受損，進而可能在發(fā)病中起重要作用，揭示了細胞免疫與DNA 甲基化的潛在關(guān)系。

2.3 DNA 甲基化與RA 發(fā)病機制 RA 是一種侵蝕性、進行性破壞關(guān)節(jié)的慢性系統(tǒng)性疾病。RA 患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、B 細胞、T 細胞等都表現(xiàn)出甲基化狀態(tài)的改變[3]。差異基因在T 細胞共刺激、IFN-γ 介導(dǎo)的信號通路和T 細胞受體信號通路等途徑富集，分析蛋白質(zhì)相互作用后發(fā)現(xiàn)了包括MX1、ISG15、IFI44L、DTX3L、PARP9 和STAT3 等在內(nèi)的干擾素互作網(wǎng)絡(luò)，這提示我們同SLE、SS 一樣，IFN 相關(guān)基因及通路在RA 發(fā)病中也占有較為重要的地位。無獨有偶，Chen 等[15]對RA 患者CD4+T 細胞全基因組DNA 甲基化進行了研究，發(fā)現(xiàn)IFN 相關(guān)基因如IFIT1、IRF7、MX1、OAS1、USP18、RSAD2 等與對照組相比存在顯著差異甲基化。IRF5 作為干擾素調(diào)節(jié)因子家族之一，參與了Toll 樣受體信號通路，在急慢性炎癥過程中具有重要作用，IRF5 的單核苷酸多態(tài)性與RA 的疾病易感性相關(guān)，且在RA 患者中存在IRF5 啟動子區(qū)低甲基化狀態(tài)[16]，這提示我們IRF5 啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)可作為RA 的潛在標志物。

除外周血的DNA 甲基化研究外，還有一些研究專注于RA 患者滑膜細胞的DNA 甲基化改變。Ai等[17]對RA 患者成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）的全基因組DNA 甲基化、RNA 轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)進行了綜合分析，差異基因提示Huntingtin 信號通路在RA 發(fā)病中具有重要作用，并且發(fā)現(xiàn)參與網(wǎng)狀蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Huntingtin 相互作用蛋白1（huntingtin interacting protein 1，HIP1）能夠調(diào)節(jié)RA 的FLS 對基質(zhì)的侵襲。Ham 等[18]發(fā)現(xiàn)在RA 患者的滑膜細胞中，差異甲基化基因涉及GLI1、RUNX2 和TFAP2A/C 等，與創(chuàng)傷反應(yīng)、組織發(fā)育、膠原纖維組織和轉(zhuǎn)化生長因子-β受體信號通路相關(guān)。由此可見，DNA 甲基化能夠參與調(diào)控RA 靶組織中滑膜細胞的損傷、修復(fù)過程，從而影響RA 的疾病發(fā)生。

3 DNA 甲基化與風濕性疾病臨床特征

3.1 DNA 甲基化與SLE 臨床特征 SLE 的DNA 甲基化狀態(tài)與臨床特征、疾病活動度有關(guān)。SLE 具有較高的異質(zhì)性，在不同種族人群中具有明顯差異。一項將非裔美國人與歐洲裔美國人進行比較的研究確定了原始CD4+T 細胞中DNA 甲基化模式的種族特異性[5]，種族差異的甲基化可能與我們臨床觀察到的SLE 不同種族的發(fā)病率、結(jié)局和疾病表現(xiàn)的差異有關(guān)。DNA 甲基化與SLE 發(fā)病的環(huán)境因素也密切相關(guān)。陽光的照射可誘發(fā)SLE 病情活動，暴露在紫外線、香煙煙霧、二氧化硅和其他壓力源等環(huán)境中會刺激活性氧的產(chǎn)生，進而通過破壞MAPK/ERK 途徑而導(dǎo)致SLE 患者T 細胞中DNMT1 失調(diào)和整體DNA脫甲基[19]。SLE 患者差異甲基化基因如TNK2、DUSP5、MAN1C1、PLEKHA1、IRF7、HIF3A、IFI44 和PRR4 與狼瘡性腎炎相關(guān)；IFIT1、IFI44L、MX1、RSAD2、OAS1、EIF2AK2 和RABGAP1L 與更高的疾病活動性和腎臟疾病以及自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)[20]。同時，狼瘡患者的DNA 甲基化圖譜可以區(qū)分不同皮損表現(xiàn)和器官的受累情況[21-23]，如顴部皮疹與盤狀皮疹，腎臟與非腎臟受累，關(guān)節(jié)與非關(guān)節(jié)受累等。DNA 甲基化改變與臨床表現(xiàn)的特異性相關(guān)，這提示我們特定基因甲基化狀態(tài)可能成為診斷標志物和治療的新靶標。

3.2 DNA 甲基化與SS 臨床特征 DNA 甲基化變化與SS 疾病活動和進展、疾病流行和嚴重程度的人群差異相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在抗SSA 和/或抗SSB 抗體陽性的SS 患者中，IFN 誘導(dǎo)基因的低甲基化更明顯[11-12]，并且基因位點的DNA 甲基化水平與ESSDAI 評分密切相關(guān)，高ESSDAI 評分患者與低ESSDAI 評分患者相比，DNA 甲基化差異更為顯著。慢性疲勞在具有相同疾病和疾病活動的個體之間差異很大，可能與基因序列或遺傳調(diào)控因素發(fā)生變化有關(guān)。Norheim 等[24]通過研究高疲勞和低疲勞SS 患者的單核苷酸多態(tài)性變異來探究DNA 甲基化在SS 患者疲勞中的可能作用，研究發(fā)現(xiàn)高疲勞狀態(tài)SS 患者與SLC25A40 基因DNA 甲基化水平具有更高的關(guān)聯(lián)度。Braekke Norheim 等[25]也對此進行了研究，發(fā)現(xiàn)高疲勞與低疲勞SS 患者之間的差異甲基化位點，與參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的活化T 細胞核因子（nuclear factor of activated Tcells，NFAT）、T 淋巴細胞磷脂酶C 及IL-1 通路中參與Nur77 信號傳導(dǎo)的基因相關(guān)。這些結(jié)果揭示了先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫功能與SS 患者疲勞表現(xiàn)具有一定的關(guān)聯(lián)。Karagianni 等[26]發(fā)現(xiàn)，SS患者唾液腺H19 位點印記控制區(qū)的DNA 甲基化減少，并與C4 血清補體水平呈負相關(guān)，由此我們推測H19ICR 基因DNA 甲基化水平可以作為監(jiān)測SS 的一個表觀遺傳學標記。

3.3 DNA 甲基化與RA 臨床特征 RA 的疾病過程與環(huán)境風險、遺傳風險的疊加作用相關(guān)，而DNA 甲基化在其中具有潛在的調(diào)節(jié)作用。一項基于瑞典RA患者的研究顯示，MHC 區(qū)域的cg21325723 位點DNA 低甲基化水平與抗抗環(huán)瓜氨酸（anti-cyclic peptide containing citrulline，CCP）抗體陽性RA 發(fā)生的風險增加相關(guān)[27]。環(huán)境風險因素如吸煙等對該位點的DNA 甲基化水平有一定的影響。同時，RA 風險基因位點rs6933349 轉(zhuǎn)錄水平受到cg21325723 位點DNA 甲基化水平調(diào)控。DNA 甲基化的動態(tài)變化貫穿RA 疾病過程，與RA 患者疾病活動評分、RA 關(guān)節(jié)損害評分、sharp 評分、病程等因素相關(guān)。研究表明，雙特異性磷酸酶 22（dual -specificity protein phosphatase 22，Dusp22）啟動子區(qū)DNA 甲基化水平與RA 患者的糜爛性疾病改變相關(guān)；細胞色素P450家族2 亞家族E 成員1（recombinant cytochrome P450 2E1，CYP2E1）啟動子區(qū)DNA 甲基化水平與RA 疾病活動度相關(guān)[28]。Ai 等[29]對RA 患者膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)的DNA 甲基化進行了研究，發(fā)現(xiàn)IL-6 信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因位點存在顯著差異甲基化，且驗證后表明RA 髖關(guān)節(jié)中IL-6 的表達比膝關(guān)節(jié)高10.8倍，這提示IL-6 通路相關(guān)基因位點的DNA 甲基化水平可能有助于區(qū)分RA 的發(fā)病部位。

4 DNA 甲基化與風濕性疾病藥物治療反應(yīng)

DNA 甲基化的動態(tài)變化與風濕性疾病的藥物治療反應(yīng)存在一定關(guān)聯(lián)。一項混合性結(jié)締組織病全基因組DNA 甲基化研究發(fā)現(xiàn)，在PARP14、SPATS2L、DDX58、OAS2、PLSCR1、HLA-F、LGALS3B 基因位點上存在與免疫抑制劑治療相關(guān)的差異DNA 甲基化表現(xiàn)[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在SLE 患者中存在與糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤治療有關(guān)的CpG 位點[20]，在腫瘤研究領(lǐng)域，已有部分研究開展對靶向藥物療效與DNA 甲基化相關(guān)性的探索，而目前對風濕性疾病治療藥物和DNA 甲基化的研究稍顯不足。就現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，某些特定基因位點的DNA 甲基化的狀態(tài)，可能是預(yù)測臨床療效、制定更為合理的治療方案的潛在指標。

5 展 望

風濕性疾病的診斷和治療有效性仍是現(xiàn)階段面臨的難題。各種風濕性疾病獨特的DNA 甲基化圖譜在一定程度上能夠為診斷提供新指標。多種風濕性疾病均存在IFN 相關(guān)基因低甲基化這一共性，提示風濕性疾病類似的發(fā)病機制，同時調(diào)節(jié)IFN 相關(guān)基因甲基化狀態(tài)可能成為未來治療的新思路；基于DNMT 等甲基化相關(guān)蛋白作用，我們推測未來使用DNMT 活性調(diào)節(jié)劑治療風濕性疾病具有一定的可行性；風濕性疾病臨床表現(xiàn)、藥物治療與DNA 甲基化動態(tài)變化之間的聯(lián)系也為疾病發(fā)展、預(yù)后和療效預(yù)測等方面的研究提供了新參考。目前DNA 甲基化與風濕性疾病的研究有待進一步發(fā)展，漢族人群的DNA 甲基化圖譜研究仍相對欠缺，期待在不遠的將來能涌現(xiàn)更多的相關(guān)研究，為風濕性疾病的臨床診斷、治療和預(yù)后提供更多的表觀遺傳學依據(jù)。