吳菁菁，張文明，周秦鵬，張新晴，陸 沖**

（1.華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院生態(tài)材料研究室，上海 200237；2.上海誼眾藥業(yè)股份有限公司，上海，201401）

0 前言

PLA由于其良好的物理和化學(xué)性能，作為1種生物可降解聚酯被廣泛應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［1］，如醫(yī)療器械、藥物輸送載體和再生工程支架等。PLA的降解性能對(duì)于其應(yīng)用來說至關(guān)重要，其降解機(jī)理也一直都是被廣泛研究的主題。PLA的降解受到自身特性和外部環(huán)境的共同影響［2］，除了分子量及分布［3］、分子結(jié)構(gòu)與組成［4］、結(jié)晶度［5?6］以外，環(huán)境中的 pH 值［7?8］和改性方法［9?11］都是十分重要的影響因素。

Jong等［7］通過對(duì)接枝PLA的降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLA的水解與介質(zhì)的pH值有關(guān)，并且PLA的末端羥基起到了關(guān)鍵作用［8］?！澳┒私到鈾C(jī)理”是當(dāng)樣本在中性或堿性介質(zhì)中時(shí)，PLA末端的羥基氧原子在介質(zhì)離子的作用下親核能力增強(qiáng)，進(jìn)而與鏈末端倒數(shù)第2個(gè)羰基形成穩(wěn)定六元環(huán)中間體，降解時(shí)生成丙交酯，進(jìn)而水解為二聚乳酸。當(dāng)介質(zhì)酸性增加，質(zhì)子化作用使得羥基末端基與相鄰羰基間形成分子內(nèi)氫橋，進(jìn)而使得末端的羰基碳氧雙鍵斷裂生成乳酸單體。

PLA的改性方法對(duì)PLA的降解行為同樣影響很大。PLA改性方法主要有2種：1種是物理共混，主要通過添加增塑劑或其他共混材料來改變PLA的宏觀組成［12?14］；另一種是化學(xué)共聚，即通過分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，采用共接枝等化學(xué)方法來改變PLA的微觀分子結(jié)構(gòu)［11，15?19］。PEG是1種具有良好的親水性的聚合物，也是1種重要的PLA改性材料［20］。Wang等［21］采用固溶法制備了一系列PLA/PEG共混物，通過降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEG的引入有利于PLA的熱降解，并且在一定程度上改變了PLA的熱降解機(jī)理。由于PEG的親水性，PEG/PLA共混物的水解性比純PLA更快。同樣，PEG也可以通過化學(xué)共聚的方式來改性PLA。PEG?PLA共聚物分子量較高，具有優(yōu)良的力學(xué)性能［22］，在水解的過程中速度比PLA更快［23］，分子量呈雙峰分布［24］。與此同時(shí)，由于親水性的大大提高和良好的生物降解性［25?26］，PEG?PLA在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景［27］。臨床試驗(yàn)表明［28］，相比于溶劑型紫杉醇制劑，以PEG?PLA共聚物為輔料制備的紫杉醇聚合物膠束制劑具有更優(yōu)越的療效、更好的安全性及更低的致敏性。

采用聚乙二醇單甲醚與丙交酯共聚制備的mPEG?PLA作為1種兩親性共聚物，可以在水溶液中自組裝形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的膠束，親水端PEG鏈段在水中伸展形成膠束的殼，疏水端PLA鏈段包裹難溶于水的紫杉醇形成膠束的核。本文研究的是mPEG?PLA共聚物作為藥物載體的降解行為與穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料

mPEG2000、D，L?丙交酯、辛酸亞錫，純度>95%，美國Sigma?Aldrich公司；

紫杉醇、無水二氯甲烷、無水乙醇，分析純，上海泰坦科技有限公司；

1.2 主要設(shè)備及儀器

高壓液相色譜儀（HPLC），Agilent126，美國安捷倫科技有限公司；

凝膠滲透色譜儀（GPC），Waters 1515，美國Wa?ters公司；

差示掃描量熱儀（DSC），PE/DSC8500，德國珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 樣品制備

mPEG?PLA共聚物制備：mPEG?PLA通過mPEG和D，L?丙交酯在異辛酸亞錫的催化下聚合得到；將15 g mPEG（分子量為2×103，7.5 mmol）加入schlenk瓶中，通入氮?dú)馀疟M瓶內(nèi)空氣，130℃真空攪拌2 h脫除其中水分；在手套箱中加入18 g丙交酯和0.9 mL辛酸亞錫的無水二氯甲烷溶液（0.02 g/mL），用氮?dú)獯祾?，在高溫高真空環(huán)境中去除二氯甲烷2 h；然后將真空密封的反應(yīng)瓶置于130℃的恒溫磁力攪拌器中反應(yīng)15～24 h，用10倍劑量的無水乙醇回收沉淀物，用真空干燥箱干燥24 h，所得固體產(chǎn)物即mPEG?PLA共聚物，該嵌段聚合物的分子量為2 000～1 800。

mPEG?PLA紫杉醇載藥膠束制備：mPEG?PLA紫杉醇載藥膠束采用固體分散?薄膜水化法制備；將30 mg紫杉醇和150 mg mPEG?PLA置于圓底燒瓶中，加入5 mL無水乙醇溶解，然后45℃旋蒸去除有機(jī)溶劑，留下均勻混合的mPEG?PLA和紫杉醇薄膜；取下燒瓶，加入5 mL預(yù)熱的PBS緩沖液，充分水化至薄膜完全溶解，得到DMs溶液；使用聚偏氯乙烯過濾器（0.22 μm）過濾形成的膠束溶液，此類制劑通常含有約16.7%的紫杉醇和83.3%的mPEG?PLA；在凍干機(jī)中凍干后，得到了膠束凍干粉，膠束的平均粒徑在20 nm以內(nèi)。

1.4 性能測試與結(jié)構(gòu)表征

降解實(shí)驗(yàn)：將樣品分組密封后，分別置于不同溫度恒溫恒濕箱中，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)采集樣品，采用GPC測定樣品的重均分子量（Mw）和分子量分散指數(shù)（PDI）、采用HPLC測定主要降解產(chǎn)物（包括丙交酯和乳酸）和水分的變化，不同溫度下的降解實(shí)驗(yàn)如表1所示；

表1 降解實(shí)驗(yàn)參數(shù)Tab.1 Data for degradation experiments

凝膠滲透色譜分析：稱取樣品約20 mg置于10 mL容量瓶中，用四氫呋喃定容作為供試品溶液，用GPC檢測，實(shí)驗(yàn)溫度25℃，溶液流速1.0 mL/min，用GPC軟件計(jì)算供試品的Mw、數(shù)均分子量（Mn）及分子量分布；

丙交酯含量測定：取樣品約0.15 g置于10 mL容量瓶中，加入乙腈使其溶解作為供試品溶液；精密稱定丙交酯標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用乙腈溶解制成400 μg/mL的丙交酯儲(chǔ)備液，分別稀釋10、20、40、80倍作為對(duì)照品；十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，以水溶液和乙腈為流動(dòng)相，檢測波長為210 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，洗脫時(shí)間30 min；取供試品溶液和對(duì)照溶液各10 μL，分別注入HPLC，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算丙交酯含量；

乳酸含量測定：取樣品約0.15 g置于10 mL容量瓶中，加水8.0 mL使其溶解，置于60℃水浴中1 h，冷卻到室溫后，定容至10 mL，104r/min離心15 min后，上清液作為供試品；精密稱定乳散標(biāo)準(zhǔn)品22 mg，加水溶解制成 400 μg/mL 儲(chǔ)備液，分別稀釋 10、20、50、100倍作為對(duì)照品；采用ZORBAX SB?Aq柱（4.6 nm×250 mm×5 μm），以1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）H3PO4水溶液和乙腈為流動(dòng)相，檢測波長210 nm，流速1.0 mL/min，柱溫40℃，洗脫時(shí)間25 min；取供試品溶液和各對(duì)照溶液各10 μL，分別注入HPLC，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計(jì)算乳酸含量；

水分測定：依照《中國藥典》2015年版四部通則0832水分測定法，取適量樣品精密稱定，再迅速轉(zhuǎn)移至滴定杯中直接測定；

熔點(diǎn)測定：取mPEG?PLA 5～10 mg于鋁制樣品皿中，采用DSC以10℃/min升溫至100℃，保溫3 min后，以10℃/min降溫至-30℃，在-30℃保溫3 min后以10℃/min速率二次升溫至100℃，記錄測定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 外觀形態(tài)變化

mPEG?PLA聚合物和DMs在不同溫度下的形態(tài)變化如表2所示。在初始狀態(tài)下，mPEG?PLA為淡黃色固體，而DMs則為白色凍干塊。在60℃的高溫降解實(shí)驗(yàn)中，mPEG?PLA和DMs的形態(tài)在短時(shí)間（5 d）內(nèi)就發(fā)生了顯著改變，mPEG?PLA變成無色半透明黏稠狀物，DMs變成透明的微黃色熔融物。在4℃、長達(dá)24個(gè)月的穩(wěn)定性降解實(shí)驗(yàn)中，mPEG?PLA和DMs都能保持形態(tài)的穩(wěn)定性，無明顯變化。在2組長達(dá)6個(gè)月的加速降解實(shí)驗(yàn)中，mPEG?PLA和DMs在25℃的環(huán)境下都能保持形態(tài)的穩(wěn)定性，而在40℃下mPEG?PLA和DMs的形態(tài)都在1個(gè)月內(nèi)發(fā)生改變，mPEG?PLA變成微黃色半透明半凝固物，DMs變成半透明熔融物。通過DCS表征和分析，得出mPEG?PLA的熔點(diǎn)均值約為40℃，由此可以得出mPEG?PLA和DMs在較低溫度（4℃和25℃）下可以維持較穩(wěn)定的性狀，當(dāng)溫度超過40℃時(shí)，mPEG?PLA和DMs都會(huì)開始熔融，物理性狀上會(huì)發(fā)生明顯變化，溫度越高變化越明顯，并且由于膠束的粒徑小，DMs的熔點(diǎn)應(yīng)當(dāng)略低于聚合物，因此DMs在40℃下的熔融程度高于mPEG?PLA。當(dāng)環(huán)境溫度為60℃時(shí)，mPEG?PLA和DMs都能完全熔融。

表2 樣品在不同溫度下的形態(tài)變化Tab.2 Morphological changes of samples at different temperature

2.2 長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

圖1是mPEG?PLA聚合物和DMs在長期（24個(gè)月）低溫（4℃）環(huán)境中各項(xiàng)數(shù)據(jù)變化情況。mPEG?PLA的Mw和多分散性（PDI）的變化情況如圖1（a）所示，mPEG?PLA的Mw在前6個(gè)月略有下降，在接下來的18個(gè)月Mw變化趨勢逐漸平緩；與此同時(shí)mPEG?PLA的PDI一直都低于1.1，數(shù)值保持在1.05到1.06之間，這表明mPEG?PLA在低溫環(huán)境下具有較高的穩(wěn)定性，即使在較長時(shí)間段內(nèi)，也可以保持長鏈的高分子結(jié)構(gòu)。圖1（b）和圖1（c）分別展示了4 ℃下mPEG?PLA和DMs中的丙交酯、乳酸和水的含量變化情況。作為聚合物分子鏈末端降解的2種可能產(chǎn)物，丙交酯和乳酸在mPEG?PLA和載藥膠中的含量都無明顯變化。與此同時(shí)，水作為聚合物降解的最終產(chǎn)物，含量在2種樣品中也幾乎保持恒定不變。由此可推測出DMs和mPEG?PLA的降解反應(yīng)在低溫下活性很低。

圖1 mPEG?PLA和DMs在4℃下的降解Fig.1 Degradation of mPEG?PLA and DMs at 4℃

2.3 加速降解實(shí)驗(yàn)

圖2（a）展示了mPEG?PLA在25℃和40℃下的Mw變化情況，可以觀察到：在前3個(gè)月，mPEG?PLA的Mw相比于4℃有了明顯的下降，并且40℃的折線圖更陡峭。通過數(shù)據(jù)分析，可以得出：mPEG?PLA在40℃下的分子量損失約為20%，在25℃下則約為10%。在圖2（b）中，mPEG?PLA的PDI在40℃下由1.05逐漸增加至1.14，在25℃下由1.05增加至1.07。由此可以證明：mPEG?PLA分子量下降的速率與溫度的升高呈正關(guān)，mPEG?PLA的降解反應(yīng)活性會(huì)隨著溫度的升高而增加。圖2（c）展示了mPEG?PLA中的丙交酯和乳酸含量分別在25℃和40℃下的變化情況。在6個(gè)月內(nèi)，mPEG?PLA中的丙交酯含量一直都很低（0.05%以內(nèi)），不僅都沒有增加，反而減少至零（未檢測出）。由此可以證明：丙交酯化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，極易轉(zhuǎn)化成二聚乳酸進(jìn)而解聚生成乳酸。與此同時(shí)，mPEG?PLA中的乳酸含量在兩種溫度環(huán)境下都有所增加，通過百分比數(shù)值的分析，可以得出：乳酸含量在40℃環(huán)境中增加了近0.8%，在25℃下增加了約0.2%。由此可以推斷：mPEG?PLA在高溫下更容易發(fā)生降解，此降解反應(yīng)會(huì)伴隨著乳酸的生成。

圖2 mPEG?PLA在25℃和40℃下的降解Fig.2 Degradation of mPEG?PLA at 4℃ and 25℃，respectively

圖3表示了mPEG?PLA和DMs中的水、丙交酯、乳酸分別在25℃和40℃環(huán)境中的變化情況。如圖3（a）所示，無論是在25℃還是40℃下，在mPEG?PLA和DMs樣本中，水的含量都無明顯變化，通過與4℃下的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，也沒有發(fā)現(xiàn)較明顯的差異。可以得出，雖然mPEG?PLA在更高溫度環(huán)境下分子量降低幅度更大，但最終生成的水含量幾乎無差別。因此，mPEG?PLA在25℃和40℃下的降解主要是以嵌段聚合物分子鏈的隨機(jī)斷裂為主，并不會(huì)產(chǎn)生大量的水分。圖3（b）和圖3（c）分別為在25℃和40℃下mPEG?PLA和DMs樣本中的丙交酯和乳酸含量的變化情況。可以觀察到無論在25℃還是40℃下，mPEG?PLA和DMs中的丙交酯含量在6個(gè)月內(nèi)變化都很小，折線走勢平坦。與此同時(shí)，在mPEG?PLA中，乳酸含量在0、1、3、6個(gè)月時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)分別為0.005%、0.033%、0.088%、0.233%（25℃）和0.005%、0.062%、0.256%、0.781%（40℃）。在DMs中，乳酸含量在0、1、3、6個(gè)月時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)分別為0.055%、0.083%、0.061%、0.060%（25℃）和 0.055%、0.118%、0.961%、4.2%（4℃）。通過數(shù)值分析可以得出，在25℃下，DMs的乳酸含量變化不大，mPEG?PLA的乳酸含量變化更為顯著。然而在40℃下，DMs的乳酸含量顯著增加，增長量為4.145%，遠(yuǎn)超過相同溫度下mPEG?PLA的情況。由此推測，當(dāng)溫度在40℃時(shí)，mPEG?PLA會(huì)出現(xiàn)部分熔融，而DMs由于熔點(diǎn)略低會(huì)全部熔融，導(dǎo)致膠束原有的規(guī)則結(jié)構(gòu)出現(xiàn)坍塌，膠束內(nèi)部的磷酸鹽會(huì)對(duì)降解產(chǎn)生催化作用。根據(jù)“末端降解機(jī)理”，在中性或堿性條件下，嵌段聚合物PLA末端的羥基氧原子與鏈末端倒數(shù)第2個(gè)羰基形成穩(wěn)定六元環(huán)中間體，降解時(shí)生成丙交酯，進(jìn)而水解為二聚乳酸，最終造成乳酸含量顯著增加。

圖3 mPEG?PLA和DMs降解產(chǎn)物對(duì)比Fig.3 Comparison of degradation products between mPEG?PLA and DMs

2.4 高溫降解實(shí)驗(yàn)

為了更好了解mPEG?PLA聚合物和DMs的降解情況，本文在60℃下進(jìn)行了高溫降解實(shí)驗(yàn)，各項(xiàng)數(shù)據(jù)如表3所示，展示了mPEG?PLA的Mw和PDI的變化情況及60℃下丙交酯和乳酸含量分別在mPEG?PLA和DMs的變化情況。在60℃下，mPEG?PLA的分子量顯著降低，PDI顯著升高。通過數(shù)據(jù)分析，分子量在10 d內(nèi)損失超過30%，PDI也從大約1.05增加到大約1.36，可以得出mPEG?PLA在此溫度下發(fā)生了劇烈的降解反應(yīng)，進(jìn)一步證明了mPEG?PLA降解反應(yīng)活性隨溫度的升高而增強(qiáng)。mPEG?PLA中的乳酸含量由0.005%變化為零（未檢測出），丙交酯含量由0.05%變化為零（未檢測出），都無明顯變化，由此可以推斷mPEG?PLA分子量的顯著降低主要是因?yàn)榉肿渔溕硝ユI的無規(guī)則斷裂，產(chǎn)物以多聚體居多，不遵循“末端降解機(jī)理”。而在DMs中，丙交酯和乳酸的含量都有明顯的增加，在僅10 d的時(shí)間里，DMs中的乳酸含量就增長了將近4倍，由此可以推測60℃環(huán)境中，mPEG?PLA和DMs都發(fā)生了全部熔融，高溫會(huì)加速mPEG?PLA和DMs的降解，但兩者降解機(jī)理有所不同。mPEG?PLA分子量的顯著降低主要是因?yàn)榉肿渔溕硝ユI的無規(guī)則斷裂，不遵循“末端降解機(jī)理”，產(chǎn)物以多聚體居多，丙交酯的乳酸生成量很少。膠束由于磷酸鹽的催化，遵循“末端降解機(jī)理”，發(fā)生了嵌段共聚物PLA端分子鏈末端的解聚，產(chǎn)生較多的丙交酯和乳酸。

表3 mPEG?PLA和DMs在60℃下的降解Tab.3 Degradation of mPEG?PLA and DMs at 60℃

3 結(jié)論

（1）在較低溫度（4℃）下，mPEG?PLA和DMs都能在長時(shí)間段（24個(gè)月）內(nèi)保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，不發(fā)生降解；

（2）隨著溫度的升高，mPEG?PLA和DMs的降解反應(yīng)都越來越強(qiáng)烈，但降解機(jī)理有所不同；

（3）在較高溫度（40℃與60℃）下，mPEG?PLA的降解以鏈段內(nèi)部的無規(guī)則斷裂為主，主要產(chǎn)物為乳酸多聚體，DMs則更多遵循了“末端降解機(jī)理”，主要產(chǎn)物為丙交酯和乳酸；造成這種差異的原因是，膠束在高溫下物理性狀突變?yōu)槿廴趹B(tài)，同時(shí)內(nèi)部的磷酸鹽起到了催化的作用。