楊 盈，蔣良君，李 衛(wèi)

（1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽 421002）

據(jù)WHO 國際癌癥研究機(jī)構(gòu)2020 年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）在我國惡性腫瘤發(fā)病率中位居第5 位，死亡率位居第2 位[1]。盡管可供肝癌患者選擇的治療手段有手術(shù)治療、化療、靶向治療、免疫治療、介入治療等，但肝癌早期癥狀不典型，大多數(shù)人發(fā)現(xiàn)已處于晚期，此時可選擇的治療方案有限，因此亟需尋找新的生物標(biāo)志物及治療方法來提高肝癌的早期診斷和治療效果，以期改善肝癌的生存率及不良臨床結(jié)局。近年來，屬于表觀遺傳調(diào)控方式的m6A RNA 甲基化在惡性腫瘤方面的作用越來越受到研究者的重視，本文將著重闡述m6A 甲基化相關(guān)蛋白組成、作用方式及在肝癌中作用機(jī)制的研究進(jìn)展，為指導(dǎo)肝癌的早期診斷及治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 m6A 甲基化的概念與組成

1.1 概念 m6A RNA 甲基化是真核生物中最普遍的一種RNA 修飾方式，存在超過7000 多個RNA 轉(zhuǎn)錄本中，沉積位點(diǎn)主要聚集在編碼序列（CDS）、3’非翻譯區(qū)起始端（3’UTR）及終止密碼子附近，主要發(fā)生在RRACH 基序上，影響RNA 的轉(zhuǎn)錄、剪切、輸出、翻譯、定位、穩(wěn)定性等生物學(xué)過程[2]。m6A 甲基化被認(rèn)為是一個動態(tài)可逆的過程[3]，可以在時間及空間上以不同形式進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)。甲基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成m6A甲基化的“作家”（writer），能夠促進(jìn)RNA 的m6A 甲基化作用。去甲基酶則被認(rèn)為是m6A 修飾過程的“橡皮擦”（eraser），能夠逆向調(diào)節(jié)甲基化過程，發(fā)揮去甲基化作用。YTH 結(jié)構(gòu)域家族蛋白被發(fā)現(xiàn)能夠特異性識別和選擇性結(jié)合mRNA 非編碼區(qū)上m6A 甲基化位點(diǎn)，被稱作為m6A 甲基化的“讀者”（reader）?！白骷摇薄跋鹌げ痢焙汀白x者”，三者相互作用共同影響m6A 的甲基化過程。

1.2 甲基化轉(zhuǎn)移酶 m6A RNA 甲基化過程主要是通過甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（MTC）發(fā)揮生物學(xué)功能。MTC位于細(xì)胞核中，核心成分包括METTL3、METTL14、WTAP。METTL3 與METTL14 以1∶1 化學(xué)計(jì)量比結(jié)合形成二聚體，再與WTAP 結(jié)合形成穩(wěn)定的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，在細(xì)胞m6A 沉積位點(diǎn)中發(fā)揮作用。METTL 3 是MTC 的主要催化中心，而METTL14 發(fā)揮支架作用，不僅使復(fù)合物更加穩(wěn)定，而且還能增強(qiáng)其活性，提高m6A 甲基化效率。WTAP 雖然不具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但能與METTL3/METTL14 二聚體相結(jié)合，影響MTC 活性及在核斑點(diǎn)的定位。

KIAA1429 被認(rèn)為是MTC 的最大組成成分，作為協(xié)調(diào)RNA 底物上核心成分的支架，其在3’UTR及終止密碼子附近進(jìn)行特定甲基化。另外有研究表明，RNA 結(jié)合基序蛋白15/15B（RBM15/RBM15B）在mRNA 轉(zhuǎn)錄組中與甲基化的RRACH 序列相鄰，能夠結(jié)合METTL3-WTAP 復(fù)合物，并且被招募到特定位點(diǎn)發(fā)揮甲基化作用[4]，也被認(rèn)為是甲基轉(zhuǎn)移酶。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)[5]，敲除小鼠胚胎干細(xì)胞中的ZC3H13，mRNA 的m6A 水平顯著降低，ZC3H13 在細(xì)胞核中保留ZC3H13-WTAP-virilizer-hakai 復(fù)合物來調(diào)節(jié)m6A 甲基化，是一個新的甲基化調(diào)控因子。另外，有研究新發(fā)現(xiàn)[6]，METTL16 能修飾U6 snRNA A43 的m6A 甲基化，屬于人類細(xì)胞中的一種具有活性的甲基化轉(zhuǎn)移酶，其能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)SAM 的穩(wěn)態(tài)。

1.3 去甲基化酶 去甲基化酶主要是由FTO、ALKBH5 組成。FTO 最初被認(rèn)識是與肥胖、2型糖尿病、BMI 等高代謝疾病密切相關(guān)。2011 年在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 的活性能夠影響m6A 去甲基化水平[7]，是第一個被發(fā)現(xiàn)的去甲基化酶，該研究也首次證明了m6A 甲基化是一個可逆的動態(tài)修飾過程。FTO 屬于α 酮戊二酸依賴的雙加氧酶ALKB 家族，定位于核斑點(diǎn)。在發(fā)現(xiàn)FTO 不久后，ALKBA5 被鑒定為第二種具有生物學(xué)功能的去甲基化轉(zhuǎn)移酶，屬于非血紅素鐵（Ⅱ）/α 酮戊二酸依賴的雙加氧酶ALKB 家族，表達(dá)活性依賴于鐵，也定位于核斑點(diǎn)，在大多數(shù)生物中表達(dá)，與核斑點(diǎn)共定位并影響mRNA 的輸出及代謝過程[8]。FTO 和ALKBH5 在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、復(fù)發(fā)、血管生成起著重要作用。大黃酸及一種非甾體抗炎藥甲氯芬胺酸（MA），屬于FTO 抑制劑[9]，能競爭性結(jié)合FTO 位點(diǎn)，抑制FTO的去甲基化水平。未來，可以從FTO 抑制劑著手，通過調(diào)控m6A 甲基化水平進(jìn)而控制腫瘤進(jìn)展，以為惡性腫瘤的化學(xué)藥物治療提供新的靶點(diǎn)。

1.4 識別蛋白 人類基因組中YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2 是目前已知的5 種具有YTH 結(jié)構(gòu)域家族的蛋白，被證明能夠特異性識別及選擇性結(jié)合m6A 甲基化位點(diǎn)，調(diào)節(jié)mRNA 轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平，在m6A 甲基化過程中發(fā)揮“讀者”作用。YTHDF2 是第一個發(fā)現(xiàn)并且深入研究的識別蛋白，能夠招募前體mRNA 的剪切因子，調(diào)節(jié)mRNA的剪切和衰變。已有研究表明[10]，YTHDF1、YTHDF2調(diào)節(jié)m6A 修飾的RNA 翻譯過程，并且能夠介導(dǎo)其降解；YTHDF3 與YTHDF1 協(xié)同在翻譯起始階段發(fā)揮重要作用。YTHDC1 和YTHDC2 屬于細(xì)胞核中的YTH 結(jié)構(gòu)域蛋白，能夠影響m6A 修飾的RNA 剪切和核輸出過程。YTHDC2 是最大的含YTH 結(jié)構(gòu)的蛋白，具有ATP 依賴的RNA 解旋酶活性，能夠正向調(diào)控mRNA 翻譯[11]。此外，RNA 結(jié)合蛋白HNRNP A2B1 被鑒定為另一類核識別蛋白，在體內(nèi)及體外與核RNA 上包含RGm6AC 的位點(diǎn)結(jié)合，與micRNA微處理器蛋白DGCR8 相互作用，介導(dǎo)靶基因的選擇性剪切作用[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)[13]，屬于胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白家族（IGF2BPs）的IGF2BP2 能夠結(jié)合m6A 甲基化位點(diǎn)并發(fā)揮識別蛋白作用，維持靶mRNA 的穩(wěn)定性并防止其降解。

除上述研究相對較多的識別蛋白外，還有FMRP、PRRC2A 等其他的RNA 識別蛋白對RNA 的生物學(xué)功能也發(fā)揮調(diào)控作用，但具體機(jī)制及作用還需進(jìn)一步深入探索。

2 m6A 甲基化與肝癌

2.1 m6A 甲基化促進(jìn)肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞失去極性，獲得侵襲性，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞的過程，賦予腫瘤細(xì)胞具有癌癥干細(xì)胞的特性，促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及化學(xué)耐藥等。E-鈣黏蛋白E-cadherin 功能的缺失被認(rèn)為是EMT 的標(biāo)志之一，snail 蛋白被認(rèn)為是EMT 轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)劑，啟動EMT 過程。Lin XY 等[14]發(fā)現(xiàn)，敲除METTL3 能夠顯著降低肝癌細(xì)胞中snail 的表達(dá)，減緩癌內(nèi)轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)展。Li JX 等[15]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGFβ1）也是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)劑，該研究發(fā)現(xiàn)在METTL3 缺失的條件下EMT過程不能被誘導(dǎo)，抑制MEETL3 的水平能夠抑制TGFβ1誘導(dǎo)的EMT 過程，m6A 甲基化在該過程中通過阻斷TGFβ1二聚體的形成調(diào)節(jié)TGFβ1mRNA 的衰減及翻譯，同時激活TGFβ1因子、促進(jìn)snail 的翻譯，正向調(diào)控EMT 過程。

除研究相對較多的METTL3 外，其他m6A 調(diào)節(jié)蛋白也在EMT 過程中起關(guān)鍵作用。Bian SY 等[16]發(fā)現(xiàn)，YTHDF1 與肝癌患者惡性臨床病理特征密切相關(guān)；敲除YTHDF1 后，EMT 標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin 的表達(dá)受到抑制，E-cadherin 上調(diào)，YTHDF1可能通過激活A(yù)KT/GSK-3β/β-catenin 信號通路和促進(jìn)EMT 來增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。總之，snail 蛋白及E-cadherin 的表達(dá)水平是EMT 的關(guān)鍵，m6A 修飾調(diào)節(jié)蛋白可以通過多種方式和不同的分子機(jī)制調(diào)控snail 及E-cadherin 的表達(dá)，從而調(diào)控肝癌的EMT。未來，調(diào)控m6A 調(diào)節(jié)蛋白對EMT 關(guān)鍵分子的表達(dá)可能會為肝癌的作用機(jī)制及治療靶點(diǎn)的研究提供新方向。

2.2 m6A 甲基化影響肝癌的惡性生物學(xué)行為 m6A甲基化調(diào)節(jié)蛋白通過對目的mRNA 進(jìn)行m6A 修飾，可以充當(dāng)原癌基因或抑癌基因，調(diào)控腫瘤的惡性生物學(xué)行為。METTL3 被發(fā)現(xiàn)在人類肝癌中發(fā)揮促癌作用，其可通過抑制SOCS2 的表達(dá)以m6A/YTHDF2 依賴的方式促進(jìn)肝癌的增殖及轉(zhuǎn)移[17]。Ma JZ 等[18]研究表明，METTL14 在肝癌組織中低表達(dá)，miR-126 是METTL14 的下游靶基因，METTL14與微處理器蛋白DGCR8 相結(jié)合，以m6A 依賴的方式正向調(diào)節(jié)pri-miR-126，促進(jìn)成熟miR-126 的產(chǎn)生，進(jìn)一步調(diào)控肝癌的轉(zhuǎn)移。目前已有大量關(guān)于METTL3 和METTL14 影響肝癌生物學(xué)行為不同機(jī)制的研究，但WTAP 在肝癌中的作用少有報(bào)道，2019 年有研究首次報(bào)道了WTAP 在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可影響肝癌的預(yù)后。降低WTAP 的表達(dá)時，下游靶基因腫瘤抑制因子ETS1 蛋白顯著上調(diào)；上調(diào)WTAP 的表達(dá)，其能夠以RNA 穩(wěn)定劑HuR 的方式使ETS1 蛋白轉(zhuǎn)錄后抑制，ETS1 以p21/p27 依賴的模式調(diào)控WTAP 介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞周期，從而形成WTAP-HuR-ETS1-p21/p27 軸促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[19]。此外，Lan T 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，KIAA1429 在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，GATA3 是KIAA1429 的直接下游靶點(diǎn)，KIAA1429 能夠誘導(dǎo)GATA3 pre-mRNA 3’UTR 上的m6A 甲基化，促使GATA3 pre-mRNA 與RNA 結(jié)合蛋白HuR 分離，降解GATA3 pre-mRNA，發(fā)揮癌基因作用促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。

同樣，去甲基化酶和識別蛋白通過轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控mRNA 的功能，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密不可分。部分研究認(rèn)為，F(xiàn)TO 作為m6A 的去甲基化酶，在肝癌中上調(diào)，與肝癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)。Li J 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 在肝癌中發(fā)揮促癌作用，敲除FTO 的表達(dá)，肝癌的生長及肝癌細(xì)胞的增殖受到抑制，并誘導(dǎo)G0/G1期的阻滯。相反，Mittenbühler MJ 等[22]通過研究指出，F(xiàn)TO 充當(dāng)抑癌基因在肝癌發(fā)生中起保護(hù)作用，并發(fā)現(xiàn)在HCC 啟動過程中，F(xiàn)TO 依賴的Cul4a mRNA 去甲基化參與此過程并降低Cul4a 的表達(dá)，進(jìn)而阻斷肝癌的細(xì)胞周期及增殖。ALKBH5 在肝癌組織中低表達(dá)，其調(diào)節(jié)的m6A 能夠被IGF2BP1所識別，通過破壞其下游靶點(diǎn)LYPD1 的表達(dá)從而發(fā)揮抑制肝癌生長的作用[23]。此外，miRNA145 在肝癌患者中表達(dá)下調(diào)，miRNA145 能夠作用于肝癌細(xì)胞中YTHDF2 mRNA 3’UTR 調(diào)節(jié)m6A 的甲基化水平，從而影響肝癌患者的總生存期[24]。

越來越多的研究顯示，m6A 甲基化調(diào)控蛋白影響著肝癌的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)過程，但目前關(guān)于m6A甲基化調(diào)控蛋白在肝癌中扮演癌基因或抑癌基因角色具有矛盾性，可能和研究者們采取的實(shí)驗(yàn)方法、標(biāo)本以及標(biāo)本數(shù)量不同有關(guān)，其中的具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步探索。

2.3 m6A 甲基化參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的腫瘤干性 腫瘤干細(xì)胞（CSCs）是指腫瘤中存在一小部分與干細(xì)胞有相似生物學(xué)作用的未分化的細(xì)胞亞群，具有自我更新、多向分化和致瘤能力，是癌癥發(fā)生增殖、轉(zhuǎn)移、化療耐藥、復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。越來越多的證據(jù)顯示，m6A 甲基化在腫瘤干細(xì)胞干性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，能夠促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化及維持腫瘤細(xì)胞多能性。大量研究報(bào)道，m6A 甲基化在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[25]、急性髓系白血病[26]、結(jié)腸癌[27]、卵巢癌[28]、乳腺癌[29]等中能促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞干性及自我更新能力，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（OCT4）最初被證明是調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞多能性的一種轉(zhuǎn)錄因子，在人類癌癥及多能干細(xì)胞中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)Nanog 是OCT4 的下游靶點(diǎn)。Yin X 等[30]發(fā)現(xiàn)，OCT4 和Nanog共表達(dá)調(diào)控著轉(zhuǎn)錄激活因子3（stat3）的激活，其主要通過snail 通路來促進(jìn)肝癌的EMT 及肝癌干細(xì)胞干性，影響肝癌的發(fā)生發(fā)展及不良臨床結(jié)局。研究表明[31]，在肝癌患者體內(nèi)，YTHDF2 的表達(dá)與OCT4 mRNA m6A 及OCT4 的表達(dá)水平呈正相關(guān)，YTHDF2 能夠調(diào)控OCT4 mRNA 5’UTR 的甲基化過程，使OCT4 表達(dá)增加，促進(jìn)肝癌干細(xì)胞表型及轉(zhuǎn)移。肝癌干細(xì)胞是肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵，m6A 甲基化可以通過調(diào)控基因表達(dá)介導(dǎo)肝癌干細(xì)胞的干性過程，這為揭示肝癌的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)靶向藥物奠定了理論基礎(chǔ)，未來有望通過抑制肝癌干細(xì)胞從而抑制肝癌的進(jìn)展，提高肝癌患者的生存率。

2.4 m6A 甲基化參與肝癌化學(xué)耐藥 m6A 甲基化在腫瘤耐藥及腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著不可替代的作用。索拉菲尼是美國FDA 批準(zhǔn)的用于治療晚期肝細(xì)胞癌的一線用藥，可以抑制Raf 激酶、血小板源性生長因子受體、血管內(nèi)皮生長因子受體等靶點(diǎn)。索拉菲尼能提高肝癌晚期患者的生存率，但容易出現(xiàn)獲得性化學(xué)耐藥，使索拉菲尼的在臨床上的應(yīng)用受到限制。Liang C 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下可觀察到索拉菲尼治療的肝癌細(xì)胞存在自噬過程，同時激活了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄應(yīng)激因子FOXO3a 并誘導(dǎo)其磷酸化及核定位，進(jìn)而調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的自噬過程，降低肝癌細(xì)胞對索拉菲尼的敏感性。Lin ZY 等[33]基于此研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下消耗METTL3，從而激活FOXO3 信號通路介導(dǎo)的自噬過程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的血管生成及增強(qiáng)索拉菲尼耐藥。此外，有研究報(bào)道[34]，METTL14 依賴的m6A 甲基化能夠介導(dǎo)肝細(xì)胞癌患者肝細(xì)胞核因子3（HNF3γ）下調(diào)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞的分化，增加肝癌患者對索拉菲尼治療的耐藥。Xu JJ 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，屬于非編碼RNA 的circRNA-SORE 中m6A 水平升高，增加circRNASORE 的穩(wěn)定性，且在索拉菲尼耐藥的肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，能夠發(fā)揮ceRNA 作用隔離miR-103a-2-5p和miR-660-3p，競爭性激活Wnt/β-catenin 通路，促進(jìn)索拉菲尼耐藥性。這些研究證實(shí)了m6A 甲基化參與索拉菲尼耐藥機(jī)制，后續(xù)探索及闡明m6A 甲基化與化學(xué)耐藥之間的作用機(jī)制，可能是改善肝癌患者獲得性化學(xué)耐藥的一種有前景的方向，并為研發(fā)逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥的藥物提供了可能。

3 m6A 甲基化在其他腫瘤中的作用

除肝癌外，m6A 在其他惡性腫瘤中也扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)[36]，METTL3 能夠通過上調(diào)酪氨酸激酶AXL 翻譯水平促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展。Yue B 等[37]發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者中，METTL3 表達(dá)上調(diào)，通過依賴閱讀蛋白HuR 信號通路促進(jìn)其靶點(diǎn)ZMYM1 的mRNA 的表達(dá)，招募并結(jié)合CTBP/LSD1/CoREST 復(fù)合物，抑制E-cadherin 的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的EMT 過程及胃癌的轉(zhuǎn)移。此外，METTL14 被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌患者中低表達(dá)，下調(diào)METTL14 能降低下游靶點(diǎn)lncRNA XIST的m6A 水平，使致癌基因lncRNA XIST 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST 的m6A 甲基化過程能被YTHDF2 識別，介導(dǎo)XIST 的降解[38]。

4 總結(jié)與展望

近年來，RNA 的表觀遺傳學(xué)在腫瘤學(xué)中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)，m6A 屬于RNA 表觀遺傳修飾的一種，參與細(xì)胞生物學(xué)的各種過程。肝癌在我國屬于高發(fā)腫瘤，惡性程度及死亡率極高，嚴(yán)重影響著患者的生存周期及生活質(zhì)量，尋找新的診斷標(biāo)志物及治療方案是目前亟需解決的問題。目前大量研究已表明，m6A 修飾在肝癌進(jìn)展過程中起著不可或缺的作用，但相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的具體作用及作用機(jī)制尚未完全明確，且有些調(diào)節(jié)蛋白在同一腫瘤中扮演抑癌或致癌雙重身份，未來需要進(jìn)一步去探索其具體作用，以為肝癌的早期診斷及晚期治療提供更多的可能性，期望未來研發(fā)出靶向治療藥物提高肝癌患者的生存率及生活質(zhì)量。