孫爍爍，韋曉，陳國芳，劉超

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院a.內(nèi)分泌科，b.癭病證治重點研究室，南京 210028)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是世界范圍內(nèi)常見的慢性肝病，疾病譜主要包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)。NASH可發(fā)展為更嚴(yán)重的肝臟疾病，如肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。除單獨(dú)發(fā)病外，NAFLD還易合并其他代謝性疾病，如肥胖、糖尿病和血脂異常，對人類健康造成嚴(yán)重威脅[2]。因此，積極防治NAFLD，延緩病情進(jìn)展具有重要的臨床意義。NAFLD的治療主要通過生活方式干預(yù)聯(lián)合藥物治療，迄今尚無有效的治療手段。NAFLD患者可通過減重緩解病情，但長期堅持飲食和運(yùn)動干預(yù)是一項巨大挑戰(zhàn)，易出現(xiàn)體重反彈。目前尚無治療NAFLD的特效藥，主要治療藥物包括抗氧化藥物、胰島素增敏劑、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體激動劑、保肝藥、降脂藥、微生態(tài)制劑、膽汁酸受體激動劑等，但臨床療效有限，且存在相關(guān)不良反應(yīng)，故未在臨床廣泛應(yīng)用。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其主要發(fā)病機(jī)制是脂肪在肝臟的異常沉積，異常堆積的脂類物質(zhì)會誘導(dǎo)炎癥和纖維化的發(fā)生，導(dǎo)致肝細(xì)胞形態(tài)和功能的損傷[3]，通過調(diào)節(jié)脂類代謝紊亂可延緩NAFLD進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，生長分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF15)在脂類代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，可緩解NAFLD過程中的肝細(xì)胞損傷[4-6]。NAFLD動物模型中血清和肝臟GDF15表達(dá)水平代償性升高[7]，故GDF15可能是治療NAFLD的潛在靶點。探討GDF15高表達(dá)的調(diào)控因素及其在NAFLD中的作用，可為治療NAFLD提供科學(xué)依據(jù)。

1 GDF15概述

1.1GDF15的結(jié)構(gòu)與分布 GDF15是轉(zhuǎn)化生長因子-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白超家族的成員[8]，也是一種應(yīng)激反應(yīng)細(xì)胞因子，又稱NSAID激活基因-1、巨噬細(xì)胞抑制細(xì)胞因子1，與多種生物學(xué)過程和疾病有關(guān)[4,9]。GDF15與其他家族成員類似，具有單個保守的鏈間二硫鍵，通常以224個氨基酸的二聚體蛋白形式分泌，分子量約為25 000[5]。GDF15以二聚體發(fā)揮作用，故其翻譯后修飾過程十分重要，分別形成前GDF15、GDF15二聚體、成熟的GDF15二聚體，后者被認(rèn)為是GDF15的活性形式；且不同物種GDF15的表達(dá)部位和豐度存在差異[4]。研究發(fā)現(xiàn)，犬和小鼠肝、肺和腎臟中GDF15呈高表達(dá)[4]，且高脂環(huán)境下小鼠肝細(xì)胞GDF15表達(dá)水平顯著升高[10]。Kim等[7]發(fā)現(xiàn)，GDF15基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的NASH表型，其肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化加重，肝損傷和代謝惡化，而GDF15過表達(dá)小鼠上述表型改善。由此可見，GDF15高表達(dá)可緩解NASH進(jìn)展。然而，關(guān)于人體各臟器中GDF15表達(dá)的研究較少。有資料顯示，胎盤中GDF15呈高表達(dá)，而結(jié)腸、腎臟和前列腺中GDF15表達(dá)較低，且肝臟中GDF15呈差異性表達(dá)；但有研究認(rèn)為，人肝臟中不表達(dá)GDF15[4-5]。因此，GDF15與人類NAFLD和NASH的關(guān)系尚不明確。

1.2GDF15的生物學(xué)功能 GDF15被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員，但其特異性受體尚不清楚。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子α樣受體(glial cell-derived neurotrophic factor receptor alpha-like，GFRAL)具有很高的親和力，可與GDF15特異結(jié)合，是GDF15發(fā)揮生理活性的關(guān)鍵要素[11]。GFRAL的表達(dá)主要局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是小鼠、大鼠、猴子及人類的腦干[12]極后區(qū)和孤束核。GFRAL下游途徑的激活需要輔助受體，原癌基因酪氨酸蛋白激酶受體RET是GFRAL的輔助受體，在極后區(qū)、孤束核和下丘腦的多個區(qū)域中表達(dá)[11]。多項研究表明，GDF15抑制攝食的作用依賴GFRAL的介導(dǎo)，GDF15與GFRAL結(jié)合，誘導(dǎo)輔助受體RET的激活和磷酸化，進(jìn)而激活蛋白激酶B、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和磷脂酶C，減少食物攝入、促進(jìn)體重減輕和改變能量穩(wěn)態(tài)[5,11-14]。

β-抑制蛋白1(β-arrestin 1，ARRB1)在GDF15與GFRAL的激活中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)GDF15的成熟。ARRB1最初被認(rèn)為是G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子，現(xiàn)已證實，其作為分子支架與其他伴侶蛋白相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，并參與多種生理過程，ARRB1可下調(diào)脂肪生成相關(guān)基因，且ARRB1可通過GDF15調(diào)控相應(yīng)基因及蛋白的表達(dá)[15-16]。此外，激素受體樣激酶5-轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅱ復(fù)合物也介導(dǎo)GDF15在各種組織和細(xì)胞中的作用，提示GDF15可能通過其他受體以及GFRAL發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用[7,17]。目前，GDF15/GFRAL的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不完全清楚，需要進(jìn)一步研究GDF15受體與成熟GDF15生物學(xué)活性之間的關(guān)系，以進(jìn)一步探索GFRAL或激素受體樣激酶5-轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅱ復(fù)合物在GDF15改善NAFLD中的作用。

2 GDF15在肝臟中的表達(dá)

肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肝細(xì)胞雌激素受體的激活、線粒體氧化磷酸化功能降低、DNA甲基化修飾等因素可調(diào)控GDF15在高脂環(huán)境下的表達(dá)。

2.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)GDF15表達(dá) 肝臟脂質(zhì)堆積會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的出現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激長期存在會導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)途徑的激活[10]。UPR途徑由肌醇需求酶1α、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、激活轉(zhuǎn)錄因子6α三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜壓力傳感器協(xié)同激活。肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)GDF15表達(dá)水平升高。Li等[10]通過誘導(dǎo)小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活UPR途徑的研究發(fā)現(xiàn)，血清和肝臟GDF15水平均顯著升高。

2.2雌激素受體(estrogen receptor，ER)α誘導(dǎo)GDF15表達(dá) ERα是能量和糖代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是預(yù)防NAFLD的相關(guān)分子靶點。多項研究發(fā)現(xiàn)，ERα是預(yù)防脂肪變性的重要因素，在雌激素對高脂環(huán)境的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-21]。GDF15與ERα相互關(guān)聯(lián)。Guillaume等[21]發(fā)現(xiàn)，選擇性ER調(diào)節(jié)劑通過激活肝細(xì)胞中的ERα促進(jìn)小鼠肝臟和血清中GDF15的表達(dá)；進(jìn)一步研究證實，肝細(xì)胞ERα誘導(dǎo)的GDF15持續(xù)表達(dá)足以對抗肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥。

2.3線粒體氧化磷酸化功能降低誘導(dǎo)GDF15表達(dá) 線粒體氧化磷酸化功能缺陷可由線粒體遺傳性疾病引起，在代謝性疾病(如肥胖、2型糖尿病)患者中很常見。Choi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)的脂肪細(xì)胞線粒體氧化磷酸化功能降低小鼠的GDF15表達(dá)水平升高，可保護(hù)飲食誘導(dǎo)的肥胖相關(guān)代謝缺陷。既往研究認(rèn)為，各種炎癥性疾病中GDF15的誘導(dǎo)作用是機(jī)體對線粒體激活的應(yīng)激反應(yīng)信號通路的適應(yīng)[23]。Chung等[24]報道，GDF15調(diào)節(jié)全身能量穩(wěn)態(tài)，并在肌肉線粒體功能障礙和線粒體UPR激活的情況下抑制飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗。類似于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)UPR，線粒體UPR也可上調(diào)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)GDF15表達(dá)。

2.4DNA甲基化修飾影響GDF15表達(dá) 與正常對照小鼠相比，NAFLD模型小鼠的肝臟GDF15表達(dá)降低，且NAFLD模型小鼠肝臟整體DNA甲基化水平升高，包括GDF15基因啟動子區(qū)域，而GDF15啟動子區(qū)域的CpG島存在高甲基化修飾，提示DNA的甲基化修飾可抑制GDF15的表達(dá)，且這種DNA甲基化的表觀遺傳修飾具有潛在傳遞性，可影響NAFLD模型小鼠子代的GDF15表達(dá)；但是，DNA甲基化修飾對不同模型小鼠GDF15表達(dá)影響的研究結(jié)果不一致，如短期高脂飲食喂養(yǎng)小鼠中GDF15表達(dá)水平升高，而高脂飲食db/db或ob/ob小鼠的GDF15表達(dá)水平降低[25]。

3 GDF15與NAFLD

GDF15在NAFLD中的高表達(dá)促使其發(fā)揮代償性保護(hù)作用，可通過降低體重、促進(jìn)肝臟脂肪代謝、抑制肝臟肥大、降低炎癥反應(yīng)、抑制肝纖維化延緩NAFLD的發(fā)生發(fā)展。

3.1GDF15降低體重 肥胖患者體內(nèi)GDF15代償性升高，與體質(zhì)指數(shù)高度相關(guān)[6,26]。與野生型小鼠相比，GDF15基因缺陷小鼠的體重和脂肪含量略有增加；異種移植DU-145前列腺腫瘤細(xì)胞小鼠體內(nèi)可見GDF15表達(dá)，且小鼠體重、脂肪組織含量及食物攝入量均偏低；肥胖小鼠模型GDF15高表達(dá)，小鼠體重降低、脂肪組織堆積減輕；給予高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6肥胖小鼠模型外源性GDF15，可預(yù)防肥胖和肝脂肪變性[4]。

GDF15對體重和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制包括依賴神經(jīng)系統(tǒng)的抑制食欲機(jī)制和不依賴神經(jīng)系統(tǒng)的增加能量消耗機(jī)制[4]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，GDF15與其受體的結(jié)合通過控制進(jìn)食量減輕體重。有研究發(fā)現(xiàn)，GFRAL基因敲除小鼠與野生型小鼠的體重或脂肪含量無明顯差異[6,13]，但高脂飲食GFRAL基因敲除小鼠的體重和脂肪含量更高[12]。因此，GFRAL在體重減輕中發(fā)揮重要作用，GDF15可通過激活GFRAL介導(dǎo)的攝食減少導(dǎo)致體重下降[12-13,27]。此外，表達(dá)GDF15異種移植小鼠的白色脂肪組織中的脂解基因表達(dá)以及棕色脂肪組織中的產(chǎn)熱基因表達(dá)均增加[4]。以上研究提示，GDF15作為一種體重調(diào)節(jié)器，可能通過減少食物攝入或增加氧化代謝發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，B16/F10黑色素瘤細(xì)胞異種移植的肥胖C57BL/6小鼠體重隨著腫瘤的生長和血清GDF15水平的升高而降低，但其進(jìn)食量并無變化[28]，提示存在其他食欲非依賴性的調(diào)控機(jī)制。

3.2GDF15促進(jìn)肝臟脂肪代謝 GDF15可促進(jìn)肝臟脂肪酸β氧化[29]，增加肝臟的脂質(zhì)消耗，減少脂肪積聚，減輕脂肪變性，延緩NAFLD的進(jìn)展。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下，肌醇需求酶1α催化編碼X盒結(jié)合蛋白1(X-box-binding protein 1，XBP1)的信使RNA非常規(guī)剪接，產(chǎn)生一種活性剪接形式——XBP1s[30]。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)，GDF15的表達(dá)受肌醇需求酶1α-XBP1s調(diào)控，并在禁食時促進(jìn)小鼠肝脂肪酸β氧化和生酮作用。XBP1s可通過結(jié)合GDF15的啟動子區(qū)激活其轉(zhuǎn)錄，使肝內(nèi)GDF15的表達(dá)水平升高。除肌醇需求酶1途徑外，激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶途徑也可上調(diào)GDF15表達(dá)。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶激活可磷酸化真核翻譯起始因子eIF2的α亞基，磷酸化的真核翻譯起始因子eIF2的α亞基進(jìn)一步促進(jìn)激活轉(zhuǎn)錄因子4的表達(dá)，從而驅(qū)動C/EBP同源蛋白的表達(dá)。C/EBP同源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下促使肝臟GDF15的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸β氧化，減少肝臟脂質(zhì)積聚，減緩肥胖小鼠肝臟脂肪變性的進(jìn)展。

此外，Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)，ARRB1可通過調(diào)節(jié)原代肝細(xì)胞中的GDF15抑制脂肪酸成脂相關(guān)蛋白，促進(jìn)β氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，且ARRB1基因的敲除或過表達(dá)影響磷酸化激活的RET、蛋白激酶B、胞外信號調(diào)節(jié)激酶等的表達(dá)；該研究還顯示，ARRB1-GDF15-GFRAL-RET軸與肝細(xì)胞中脂肪酸的β氧化顯著相關(guān)，ARRB1可促進(jìn)GDF15向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)和成熟。

由上所述，XBP1s及轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白可與啟動子結(jié)合激活GDF15轉(zhuǎn)錄，使肝內(nèi)GDF15高表達(dá)，促進(jìn)肝臟脂肪酸β氧化，減少肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)積聚[10,26]。ARRB1可通過調(diào)節(jié)GDF15抑制脂肪酸成脂相關(guān)蛋白的表達(dá)，并誘導(dǎo)β氧化相關(guān)蛋白表達(dá)的增加[15]。

3.3GDF15抑制肝臟肥大 Kim等[7]對蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，在飲食喂養(yǎng)后，GDF15基因敲除小鼠肝臟重量(調(diào)整體重和血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平)增加，提示GDF15可調(diào)節(jié)NASH時的肝臟大小，抑制肝臟肥大。Choi等[22]也發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食8周后，與單純脂肪細(xì)胞線粒體氧化磷酸化功能降低小鼠相比，脂肪細(xì)胞線粒體氧化磷酸化功能降低合并GDF15基因敲除小鼠的肝臟脂肪堆積更明顯，表明脂肪細(xì)胞線粒體氧化磷酸化功能降低可使GDF15增加，對抑制肝臟肥大起到代償性保護(hù)作用。

3.4GDF15降低炎癥反應(yīng) 免疫細(xì)胞在肝臟炎癥、脂肪性肝炎和肝纖維化疾病的發(fā)展中起重要作用[23,31]，故抑制免疫細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子是治療慢性肝病的重要靶點[23]。在活化的組織巨噬細(xì)胞中，GDF15表達(dá)明顯增加[32]。Chung等[23]發(fā)現(xiàn)，GDF15是一種負(fù)性肝臟炎癥調(diào)節(jié)因子，可能通過抑制肝內(nèi)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)肝臟免疫微環(huán)境。在與人NASH具有相似代謝特征的NASH小鼠模型中，GDF15可通過減少巨噬細(xì)胞的募集改善炎癥狀態(tài)[7,33]。體外實驗亦證實，GDF15可降低巨噬細(xì)胞對高糖高脂刺激的炎癥反應(yīng)[34]。

3.5GDF15抑制肝纖維化 在NASH中，GDF15可調(diào)節(jié)骨橋蛋白及肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。有文獻(xiàn)報道，骨橋蛋白在人類和小鼠NASH中均被誘導(dǎo)，且蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)NASH小鼠模型肝纖維化加重[7,35]。Kim等[7]發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸和膽堿缺乏飲食喂養(yǎng)GDF15基因敲除小鼠肝臟中與纖維化相關(guān)的基因(Tgfb1、Col1a1、Timp1和Acta2)及骨橋蛋白基因的表達(dá)均增加，且GDF15可通過抑制肝星狀細(xì)胞的活化發(fā)揮抗纖維化作用，與其他GDF15對酒精性肝損傷抗纖維化作用的研究[23]結(jié)果一致。但有研究報道，GDF15可使肝星狀細(xì)胞纖維化基因表達(dá)增加[32]，與上述研究結(jié)果不一致。

Smad家族蛋白2和Smad家族蛋白3在肝星狀細(xì)胞激活和纖維化發(fā)生中起關(guān)鍵作用。Koo等[32]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，GDF15可通過增加Smad家族蛋白2和Smad家族蛋白3的磷酸化激活人肝星狀細(xì)胞并誘導(dǎo)纖維化。GDF15可能是NAFLD晚期纖維化的一個新的生物標(biāo)志物，與NAFLD患者的晚期纖維化風(fēng)險相關(guān)[32,36]。此外，肝脂質(zhì)積聚和炎癥可觸發(fā)NASH進(jìn)展中的纖維化反應(yīng)，尚不能排除GDF15抗纖維化作用部分繼發(fā)于肝脂質(zhì)積聚和炎癥減少的可能性[7]。因此，GDF15緩解NAFLD纖維化的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4 小 結(jié)

NAFLD中GDF15的高表達(dá)和保護(hù)作用提供了NAFLD的潛在治療靶點及新的治療策略，并有利于NAFLD及相關(guān)代謝紊亂的藥物研發(fā)，且多項GDF15受體的研究正在開展[11-14,37]。重組GDF15或GDF15受體調(diào)節(jié)劑是治療或預(yù)防代謝性疾病的潛在臨床手段[22]。然而，目前對于GDF15在NAFLD中表達(dá)水平升高的機(jī)制尚不明確，GDF15在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中的具體功能和重要性尚未得到驗證，且現(xiàn)階段研究多集中于動物實驗，較少涉及臨床研究，故GDF15在NAFLD發(fā)生發(fā)展和防治中的作用和意義尚需進(jìn)行更多研究。