王 信，黃 蓉，肖 殷

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科，貴州 遵義 563099，中國；2.美國杜克大學(xué) 骨科研究中心，北卡羅來納州 達(dá)勒姆市，27701，美國；3.昆士蘭科技大學(xué) 骨組織工程研究中心，昆士蘭 布里斯班，4059，澳大利亞)

骨形成過程中會(huì)伴隨多種細(xì)胞的作用(如成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等)，其中成骨細(xì)胞是骨形成的主要細(xì)胞，破骨細(xì)胞刺激骨的吸收，內(nèi)皮細(xì)胞負(fù)責(zé)血管的形成(新生血管的長入積極促進(jìn)成骨)。雖然每種細(xì)胞都在骨形成中發(fā)揮獨(dú)立作用，但免疫系統(tǒng)強(qiáng)的旁分泌作用會(huì)影響到上述所有細(xì)胞，免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)之間的串?dāng)_形成了新的研究方向，即骨免疫學(xué)[1]。在過去的幾十年里，研究者們發(fā)現(xiàn)生物材料能引起巨噬細(xì)胞發(fā)生極化效應(yīng)，且極化后的巨噬細(xì)胞會(huì)進(jìn)而影響到后序的骨形成，因此，本文重點(diǎn)關(guān)注巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的骨免疫調(diào)控作用及機(jī)制。隨著各種生物材料在骨組織工程學(xué)中的大量運(yùn)用，材料界面和細(xì)胞之間的各種生物活動(dòng)也成為了熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。而在生物材料-免疫系統(tǒng)的交叉反應(yīng)中，研究發(fā)現(xiàn)材料的化學(xué)物理特性也可以在損傷部位引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)又會(huì)對骨形成產(chǎn)生積極(骨折早期炎癥階段釋放細(xì)胞因子促進(jìn)成骨細(xì)胞生成等)或消極(白介素1、TNF-α促進(jìn)破骨細(xì)胞生成等)的影響。因此，詳細(xì)討論了如何利用生物材料調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來控制骨形成中各種事件，如成骨細(xì)胞產(chǎn)生和破骨細(xì)胞的發(fā)生。旨在更好地理解生物材料與骨免疫系統(tǒng)的關(guān)系，避免產(chǎn)生不良的炎癥反應(yīng)及破骨細(xì)胞形成的刺激。

1 生物材料與骨免疫

1.1 生物材料植入引起免疫反應(yīng) 過去認(rèn)為作為骨替代物的生物材料是可以觸發(fā)宿主免疫的異物，故設(shè)計(jì)材料時(shí)都在通過制造惰性材料來最小化免疫反應(yīng)[3]。然而近幾年骨免疫學(xué)的提出，拓展了生物材料的應(yīng)用范圍。研究發(fā)現(xiàn)生物材料的特性(如外形、粗糙度、孔隙率、孔隙大小、親水性、表面電荷等)都可以對免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響，從而干擾骨骼系統(tǒng)[4]。因此，目前的骨組織工程方法更加側(cè)重于生物材料的表面特性，它可以在骨組織再生過程中調(diào)節(jié)各種反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展(如免疫反應(yīng)、凝血反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等)。生物材料表面合理設(shè)計(jì)的目的是為了更好地發(fā)揮其生物相容性，以致和宿主骨組織能更好地結(jié)合在一起[4]。

生物材料植入會(huì)引發(fā)宿主的反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)的吸附、免疫細(xì)胞的招募以及細(xì)胞因子的分泌[5]。材料植入后，蛋白質(zhì)和補(bǔ)體因子會(huì)迅速吸附到材料表面，形成富含細(xì)胞因子和金屬蛋白酶(MMP)的血凝塊，隨后招募中性粒細(xì)胞[6]。隨后單核細(xì)胞聚集并分化成為有活性的巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞會(huì)分泌各種炎癥和抗炎細(xì)胞因子，并且黏附到材料表面形成纖維蛋白基質(zhì)，將生物材料吞噬清除[7]。骨的愈合開始于炎癥反應(yīng)階段，一旦植入材料無法被巨噬細(xì)胞吞噬時(shí)，會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)延遲，并且纖維蛋白會(huì)包裹到材料表面將其與周圍組織隔離開來，導(dǎo)致植入失敗[8]。因此骨生物材料植入后發(fā)揮的效應(yīng)，很大程度上取決于免疫反應(yīng)。

1.2 巨噬細(xì)胞的作用與極化 巨噬細(xì)胞不僅是天然免疫的重要組成成分，而且在骨形成過程中也起到關(guān)鍵作用[9]。研究表明巨噬細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的相互作用能影響骨愈合，并且由巨噬細(xì)胞發(fā)生極化反應(yīng)后，能顯著加速或抑制骨組織的修復(fù)進(jìn)程[10-11]。也有研究表明，將骨髓基質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，觀察到堿性磷酸酶功能增強(qiáng)和Ⅰ型膠原蛋白水平升高，表明巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[12]。此外，Champagne等[13]也證明包括來自于單核/巨噬細(xì)胞譜系的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)在內(nèi)的成骨因子也具有誘導(dǎo)骨形成的作用。

巨噬細(xì)胞兩種主要的分型是M1和M2型巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞因子的分泌對骨再生部位的微環(huán)境產(chǎn)生影響。有趣的是巨噬細(xì)胞的兩種表型可以相互轉(zhuǎn)換，來適應(yīng)不同微環(huán)境。M1型巨噬細(xì)胞是促炎性的，可以通過脂多糖(LPS)單獨(dú)極化或者與Th1細(xì)胞因子(如INF-γ、GM-CSF)結(jié)合而極化，并產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α等[14]。IL-1β和TNF-α?xí)种瞥晒羌?xì)胞合成堿性磷酸鹽，并抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和礦化[15]。M2巨噬細(xì)胞具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，被Th2細(xì)胞因子(如IL-4、IL-13)極化，并產(chǎn)生IL-10、TGF-β、IL-1RA等抗炎細(xì)胞因子[14]。TGF-β通過調(diào)控下游骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的產(chǎn)生，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的作用[16]。而IL-1RA是IL-1的抑制劑，通過抑制IL-1的作用間接促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[17]。此外，M1和M2之比會(huì)影響到植入材料的作用，升高的M1和缺乏的M2會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的異物反應(yīng)和慢性炎癥，免疫時(shí)間延長使得組織愈合延遲導(dǎo)致生物材料整合失敗[18]。

2 生物材料調(diào)控骨免疫影響骨形成

近年來，生物材料對骨組織工程領(lǐng)域的快速發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)。但由于目前對于生物材料與骨免疫系統(tǒng)之間缺乏必要的認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致生物材料很難轉(zhuǎn)化為人體臨床實(shí)驗(yàn)。骨折愈合過程往往伴隨急性炎癥，其中有多種免疫細(xì)胞的相互作用。而在不同的免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞不僅作用于免疫防御，它的極化狀態(tài)在骨愈合中起關(guān)鍵作用[11]。越來越多的研究表明，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對生物材料的化學(xué)物理特性高度敏感。而目前生物材料的研究進(jìn)展使得我們可以很好地控制材料特性。所以可以利用生物材料介導(dǎo)骨免疫從而調(diào)節(jié)骨形成進(jìn)程，而其對于骨形成、破骨細(xì)胞生成以及炎癥的調(diào)控都有一定的作用，故研究人員可以將這些策略用于將來的骨組織工程研究。

2.1 生物材料的免疫調(diào)節(jié) 生物材料植入到體內(nèi)會(huì)引起復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，而這些炎癥反應(yīng)會(huì)觸發(fā)多種生物化學(xué)信號(hào)，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞招募到植入生物材料的區(qū)域。其中被招募的單核細(xì)胞被分化為巨噬細(xì)胞，黏附在植入的材料上，而不同性質(zhì)的材料會(huì)影響巨噬細(xì)胞的可塑性從而影響骨愈合過程[19]。研究表明，生物材料引起的免疫反應(yīng)可能是由于材料與各種蛋白質(zhì)之間的相互作用，不同的材料可能改變蛋白質(zhì)吸附的類型、濃度和模式等，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化[19]。此外，Hu等[20]發(fā)現(xiàn)植入生物材料中，纖維蛋白原在生物材料上的吸附和變性暴露了纖維蛋白原D域的短序列(即γ190-202、P1和γ377-395、P2)，它們與免疫細(xì)胞的整合素Mac-1相互作用，使其產(chǎn)生促炎癥反應(yīng)。而可溶性纖維蛋白原沒有這種效應(yīng)。這表明免疫細(xì)胞的粘附受體與這些粘附蛋白之間的相互作用是各種信號(hào)級(jí)聯(lián)的主要介質(zhì)。

研究表明植入材料的生物、物理、化學(xué)特性具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞反應(yīng)的能力。如從透明質(zhì)酸中提取的生物材料具有很好的抗炎特性[21]。硫酸海藻酸鹽促進(jìn)人THP-1單核細(xì)胞的M2樣極化，并抑制其它促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[22]。此外，生物材料表面的化學(xué)修飾可以影響蛋白質(zhì)的吸附和免疫細(xì)胞下游信號(hào)的傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，碳納米離子體表面與碳、氮和氧官能團(tuán)聚合，氧官能團(tuán)的存在增加了巨噬細(xì)胞的粘附性和激活[23]。而具有親水性/中性表面的聚對苯二甲酸乙二醇酯膜會(huì)抑制巨噬細(xì)胞的黏附和融合，但這些巨噬細(xì)胞比疏水和親水性/離子物質(zhì)產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子和趨化因子[24]。這表明各種化學(xué)特征如官能團(tuán)類型、表面電荷、親水性等都對免疫反應(yīng)有著重要影響。

2.2 生物材料調(diào)控巨噬細(xì)胞影響骨形成 巨噬細(xì)胞在骨再生進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，M1和M2型巨噬細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子影響骨再生部位微環(huán)境，控制骨髓干細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞的功能[25]。許多研究利用生物材料控制成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨再生，同時(shí)也有許多研究使用生物材料通過免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)骨形成。但由于細(xì)胞因子的復(fù)雜特性，研究主要集中于使用材料控制巨噬細(xì)胞和細(xì)胞因子的傳遞來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能。

目前研究認(rèn)為材料親水性的增加可以增強(qiáng)植入物與骨的整合。Vlacic-Zischke等[26]發(fā)現(xiàn)親水性Ti測得TGF-β/BMP信號(hào)水平升高，并且在10% 過氧化氫溶液中制備親水Ti盤24 h后，測得小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的生長明顯增加。這些結(jié)果表明在親水性表面上，成骨細(xì)胞的細(xì)胞因子受體表達(dá)有所增強(qiáng)。而在材料中引入親水性也會(huì)影響巨噬細(xì)胞的活性。在對相同類型的巨噬細(xì)胞研究中，Hamlet等[27]發(fā)現(xiàn)在親水性Ti上培養(yǎng)，巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1α、IL-1β和趨化因子(如Ccl-2)的分泌下調(diào)。這表明材料親水性有利于巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用，從而增強(qiáng)成骨過程。

表面電荷在材料表面性能調(diào)節(jié)中也起著重要作用。Brodbeck等[28]通過改變聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)材料表面電荷，發(fā)現(xiàn)陰離子底物促進(jìn)IL-10并減少IL-8的分泌，而陽離子底物則抑制了IL-10和IL-1RA的產(chǎn)生。這表明材料的陰離子表面可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能，而陽離子表明則抑制成骨細(xì)胞的激活。此外，近期研究使用Ca和Sr等二價(jià)陽離子修飾Ti植入物培養(yǎng)巨噬細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物水平增加[29]。這表明二價(jià)陽離子表面可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的功能。此外，研究發(fā)現(xiàn)含有β-磷酸三鈣(β-TCP)的鎂可以加速巨噬細(xì)胞分泌BMP-2和IL-1RA，并且在鎂-磷酸鈣水泥(MCPC)上的巨噬細(xì)胞分泌更多的TGF-β1和更少的TNF-α和IL-6[30]，表明可能使用生物礦化材料來增強(qiáng)成骨形成。因此，生物材料不僅可以直接促進(jìn)成骨細(xì)胞形成，也可以影響免疫細(xì)胞來促進(jìn)骨形成。

2.3 生物材料對破骨細(xì)胞形成的影響 盡管生物材料用于增強(qiáng)骨形成已經(jīng)廣泛研究，但是生物材料對破骨細(xì)胞生成的作用最近才逐漸被認(rèn)識(shí)。研究表明材料表面的化學(xué)特性對破骨細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。Bang等[31]使用親水和非親水鈦，在RNAKL和M-CSF的存在下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞進(jìn)行破骨細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)所有的破骨細(xì)胞標(biāo)記物如抗酒石酸酸磷酸酶(TRAP)、破骨細(xì)胞相關(guān)的免疫球蛋白樣受體(OSCAR)、MFATc1和c-Fos在親水性表面都被下調(diào)。這表明材料的親水性增加可能降低破骨細(xì)胞活性。此外，Bose等[32]分別使用正常TCP和加入Mg2+的TCP培養(yǎng)破骨細(xì)胞前體RAW264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)加入Mg2+的沒有分化為具有單核特性的破骨細(xì)胞，也沒有肌動(dòng)蛋白環(huán)(破骨細(xì)胞標(biāo)記)的產(chǎn)生。這表明鎂修飾表面材料也會(huì)抑制破骨細(xì)胞的生成。

研究表明材料的生物化學(xué)成分也會(huì)影響破骨細(xì)胞形成。在骨組織工程研究領(lǐng)域，易溶性的β-磷酸三鈣(β-TCP)和難溶性的羥基磷灰石(HA)得到很多研究者的青睞。早期Yamada等[33]使用不同的HA和β-TCP比率研究材料溶解度對破骨細(xì)胞吸收的影響，發(fā)現(xiàn)HA/β-TCP比率為25/75破骨細(xì)胞吸收作用最強(qiáng)。隨后，Botelho等[34]將硅結(jié)合到HA上，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化標(biāo)記物表達(dá)明顯升高，表明Si-HA會(huì)刺激破骨細(xì)胞形成且具有更高的破骨細(xì)胞活性。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)材料表面的粗糙度也會(huì)影響破骨細(xì)胞形成。如粗糙的噴砂鈦表面TRAP活性和破骨細(xì)胞數(shù)量明顯高于拋光表面。Brinkmann等[35]發(fā)現(xiàn)鈦的酸蝕刻和噴砂/酸蝕刻表面上形成的破骨細(xì)胞與原生破骨細(xì)胞形成相似，而光滑的表面上觀測到的破骨細(xì)胞數(shù)量大大減少。所以破骨細(xì)胞的形成可以通過材料修飾來調(diào)節(jié)，同時(shí)也會(huì)被材料表面的粗糙度影響。而在親水性表面，破骨細(xì)胞分化會(huì)被下調(diào)。因此，了解材料對破骨細(xì)胞的影響會(huì)有助于我們設(shè)計(jì)出成骨性能更突出的生物材料。

3 展望

隨著對骨免疫系統(tǒng)的深入研究以及免疫系統(tǒng)和骨骼相互影響的新發(fā)現(xiàn)，使得我們對骨免疫學(xué)領(lǐng)域的了解迅速提升。近年來對生物材料和骨免疫系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，極化的巨噬細(xì)胞不僅可以單獨(dú)促進(jìn)成骨，而且其與生物材料的作用也對成骨形成產(chǎn)生積極的影響。此外，材料的化學(xué)特性(如親水性，表面電荷等)和物理特性(如粗糙度、形狀、孔隙率和孔隙大小等)都會(huì)通過骨免疫系統(tǒng)從而影響骨形成。

目前生物材料的研究方向主要致力于通過材料的表面修飾來微調(diào)免疫系統(tǒng)，以期通過調(diào)控免疫細(xì)胞及其分泌的多種細(xì)胞因子，如TNF、IL-6、IL-1等[36]，來更好更快地幫助骨形成進(jìn)程。但針對一些復(fù)雜的、多因素的、多重感染的骨感染臨床病例，我們?nèi)匀沃氐肋h(yuǎn)，研發(fā)具備抗多重感染能力的功能性生物材料仍然是骨科醫(yī)生面臨的一大難題。