張岱權(quán)，黃黎，金棕杰，唐詩琪，羅佳瑞，李林，趙雷，曹新梅

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院重大疾病的免疫機制及治療瀘州市重點實驗室（瀘州646000）；3.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（瀘州 646000）

體液免疫的基礎(chǔ)是B 細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）的多樣性，BCR多樣性主要由BCR基因V（D）J重組形成，V（D）J重組發(fā)生于B細(xì)胞發(fā)育的早期階段，首先是proB 細(xì)胞的BCR 重鏈可變區(qū)基因發(fā)生V（D）J 重組，隨后preB 細(xì)胞發(fā)生BCR 輕鏈重組。V（D）J 重組是由重組激活基因（recombination activating gene，RAG）產(chǎn)物RAG1和RAG2介導(dǎo)的。通過重組，將基因組中原本分隔的V、D和J基因連接在一起。V、D和J基因都帶有一段保守的DNA 序列—重組信號序列（recombination signal sequences，RSSs）。RAG1/2 能夠識別RSSs 并且在此處切割DNA，形成一個發(fā)卡狀的編碼末端和一個信號末端[1]。斷裂的DNA由DNA依賴性蛋白激酶、Ar?temis、Ku70、Ku86、X 射線修復(fù)交叉互補蛋白5（X-ray repair cross-complementing protein 5，XRCC5）和XRCC4等非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）因子進行修復(fù)[2-3]。其中，編碼末端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，重新連接，形成編碼連接（coding joint，CJ）；信號末端直接連接形成環(huán)狀，即信號連接（signal joint，SJ），并從基因組中刪除[1]。

為了保證重組后形成有功能的BCR基因，同時防止破壞基因組DNA，V（D）J 基因重組有著嚴(yán)密的調(diào)控機制，如RAG表達的時空性[4]以及RAG1在細(xì)胞核的分布[5]，染色質(zhì)可及性[6]，轉(zhuǎn)錄因子[如E2A[7]、成對盒5（paired box 5，Pax5）[8]等]，以及基因轉(zhuǎn)錄[9-10]在BCR基因V（D）J 重組中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。此外，黏連蛋白介導(dǎo)的DNA環(huán)擠壓[11]也會影響VH-DHJH重組[12-13]。

不均一核糖核蛋白U（heterogeneous nuclear ribonu?cleoprotein U，hnRNPU），即核基質(zhì)結(jié)合因子A（scaffold attachment factor A，SAFA），屬于不均一核糖核蛋白亞家族成員，是核基質(zhì)的主要成分之一，其結(jié)構(gòu)分為：N端的DNA 結(jié)合區(qū)、中間區(qū)和C 端的RNA 結(jié)合區(qū)[14-15]。hnRNPU 具有多種生物學(xué)功能，主要包括：調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄[16]，參與RNA 代謝[17-18]，修復(fù)DNA 的氧化損傷[19]，調(diào)控有絲分裂[20]和細(xì)胞增殖[21]，調(diào)控mi?croRNA的胞外囊泡運輸[22]等。Ye等[17]的研究顯示，條件性敲除小鼠心臟中的hnRNPU基因，小鼠發(fā)生嚴(yán)重的擴張性心肌病，并在出生后2 周死亡。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，hnRNPU突變的兒童表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇及小腦癥等[23-24]。有趣的是，在小鼠模型中，淋巴細(xì)胞發(fā)育異常時，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育也受到影響[25]。hnRNPU是否調(diào)控V（D）J重組及B細(xì)胞發(fā)育，尚未見相關(guān)報道。本研究旨在構(gòu)建和鑒定hnRNPU-KD 的preB細(xì)胞株，從而為后續(xù)研究hnRNPU對早期B細(xì)胞V（D）J重組的調(diào)控作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞株 A70 細(xì)胞（v-Abl 小鼠preB 細(xì)胞）用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（BasalMedia）、β-巰基乙醇、青霉素、鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基（ATCC 改良型）（BasalMedia）培養(yǎng)。HEK293T 細(xì)胞用含10%FBS（BasalMedia）、青霉素、鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基（BasalMedia）培養(yǎng)。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2。

1.1.2 主要材料 pLKO.1-EBFP-PURO 質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞DH5α購于中國擎科生物公司。Age I、EcoR I購于上海寶生物公司。T4 DNA ligase 購自美國NEB 公司。針對小鼠hnRNPU基因的shRNA序列（gaccggtCCGGCC TGGGAAATACAACATTCTTTTCAAGAGAAAGAATGT TGTATTTCCCAGGTTTTTGgaattcc）由擎科生物公司合成。rabbit anti-hnRNPU 購自abcam 公司，mouse anti-GAPDH 購 自proteintech 公司，goat anti-rabbit IgG 和goat anti-mouse IgG 購自Thermo 公司。包裝慢病毒的質(zhì)粒pMDL、VSVG和pRSV-Rev，由本課題組保存。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀、高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）、熒光倒置顯微鏡（德國萊卡公司）、凝膠成像儀（美國Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1hnRNPUshRNA 表達質(zhì)粒的構(gòu)建 利用Age I、EcoR I雙酶切pLKO.1-EBFP-PURO 質(zhì)粒和靶向hnRNPU基因的shRNA 干擾序列。酶切的質(zhì)粒經(jīng)電泳檢測酶切成功后，回收純化。純化的質(zhì)粒和插入片段，經(jīng)T4 DNA ligase，室溫連接10 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，接菌，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆、搖菌，測序檢測。測序正確的單克?。麨閜LKO.1-hnRNPUshRNA-EBFP-PURO）用于后續(xù)實驗。

1.2.2 表達hnRNPUshRNA的慢病毒的包裝HEK293T細(xì)胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿。當(dāng)細(xì)胞融合度達到70%左右，用聚醚酰亞胺（polyetherimide，PEI）進行轉(zhuǎn)染，其中質(zhì)粒（μg）: PEI（μg）=1∶2，每一皿細(xì)胞轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒為pLKO.1-hnRNPUshRNA-EBFP-PURO 或者pLKO.1-EBFP-PURO（μg）∶pMDL（μg）∶pRSV-Rev（μg）∶VSVG（μg）=8∶4∶4∶4。轉(zhuǎn)染4～6 h后，棄去轉(zhuǎn)染試劑，補充含10%FBS 的DMEM 的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集含病毒的培養(yǎng)基，將其置于4 ℃，以500 g 離心4 min。吸出上清，用0.45 μm 的過濾器過濾后分裝，凍于-80 ℃。

1.2.3hnRNPU-KD 的A70 細(xì)胞株的構(gòu)建 收集A70 細(xì)胞2管，每管1×106。取凍存的表達hnRNPUshRNA和空載的病毒上清各1 mL，在冰上融化后，加入polybrene至終濃度5 μg/mL，混勻。吸出病毒混懸液，分別加入到兩管A70 細(xì)胞，混勻，將其吸出至6 孔板。將其置于室溫，以1 800 rpm 離心90 min。隨后，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2。第2 d換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞是否有藍色熒光，判斷感染效果。將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含2 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7 d左右（每2 d換1次液），直至陰性細(xì)胞全部死亡。Western blot 檢測hnRNPU 表達的情況。將細(xì)胞進行有限稀釋，接種于96 孔板，每孔1 個細(xì)胞，用含2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至形成單細(xì)胞克隆。每個單細(xì)胞克隆取一部分進行Western blot檢測，其余的凍存于-80 ℃。hnRNPU-KD 的細(xì)胞克隆則繼續(xù)培養(yǎng)擴增，并用于后續(xù)實驗。

1.2.4 Western blot檢測hnRNPU蛋白的表達 用1×蛋白上樣緩沖液裂解細(xì)胞，100 ℃煮10 min。再將其置于4 ℃，以13 000 rpm 離心20 min。吸取上清，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sul?fate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。隨后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫快速封閉15 min，加入一抗（rabbit anti-hnRNPU、mouse anti-GAPDH）4 ℃孵育過夜。TBST 洗3 次后，加入二抗（goat anti-rabbit IgG、goat anti-mouse IgG）室溫孵育1 h。TBST洗3次。膜上滴加顯影液后，利用凝膠成像儀曝光。

2 結(jié)果

2.1 電泳檢測pLKO.1-EBFP-PURO質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

pLKO.1-EBFP-PURO 質(zhì)粒經(jīng)Age I、EcoR I雙酶切后電泳。結(jié)果顯示質(zhì)粒已被切開，見圖1，可以用于后續(xù)實驗。

圖1 pLKO.1-EBFP-PURO質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的鑒定Figure 1 Identification of double digested production of pLKO.1-EBFPPURO

2.2 測序鑒定重構(gòu)的pLKO.1-hnRNPU shRNAEBFP-PURO質(zhì)粒

重構(gòu)的pLKO.1-hnRNPUshRNA-EBFP-PURO 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板，培養(yǎng)過夜。挑取細(xì)菌單克隆測序。結(jié)果顯示目的片段已經(jīng)插入到質(zhì)粒中，見圖2，提示pLKO.1-hnRNPUshRNA-EBFP-PURO構(gòu)建成功，可以用于包裝病毒。

圖2 pLKO.1-hnRNPU shRNA-EBFP-PURO質(zhì)粒的測序結(jié)果Figure 2 The sequencing result of pLKO.1-hnRNPU shRNA-EBFPPURO

2.3 熒光顯微鏡檢測感染病毒的A70細(xì)胞

慢病毒感染A70 細(xì)胞72 h后，細(xì)胞內(nèi)可以觀察到藍色熒光，見圖3，說明病毒已經(jīng)成功感染細(xì)胞。

圖3 感染病毒的A70細(xì)胞的檢測（×400）Figure 3 Identification of A70 cells infected by viruses（×400）

2.4 hnRNPU蛋白的檢測

病毒感染A70 細(xì)胞72 h后，用嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞，提取總蛋白，利用Western blot檢測hnRNPU的表達。如圖4A、B所示，雖然各組間hnRNPU表達的差異性未達到統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但與對照組相比，實驗組的hnRNPU 減少了大約一半。將實驗組的細(xì)胞進行有限稀釋，培養(yǎng)成單細(xì)胞克隆，利用Western blot 檢測hnRNPU 的表達。結(jié)果顯示，細(xì)胞克隆1和克隆2的hnRNPU抑制率達到60%～70%，見圖5A、B，可以用于后續(xù)實驗。

圖4 hnRNPU蛋白表達的檢測Figure 4 Identification of hnRNPU expression

圖5 hnRNPU基因穩(wěn)定敲低的細(xì)胞株的篩選Figure 5 Selection of stable hnRNPU-KD cell lines

3 討論

早期研究表明，在proB 細(xì)胞中，增強子Eμ可以引導(dǎo)DHJH基因群的轉(zhuǎn)錄[9]。Eμ引導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，可能對于DHJH區(qū)域染色質(zhì)的開放至關(guān)重要[26]。OSIPOVICH等[10]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)換/蔗糖不發(fā)酵復(fù)合物（switching/sucrose nonfermenting，SWI/SNF）是啟動整個Igh基因反義轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)，當(dāng)proB 細(xì)胞缺失SWI/SNF時，Igh基因不發(fā)生轉(zhuǎn)錄，VH、DH和JH基因片段也不能重組。以上研究均提示，V（D）J重組與基因轉(zhuǎn)錄息息相關(guān)。hnRNPU能夠結(jié)合actin和Pol II等，在轉(zhuǎn)錄的起始和延伸階段發(fā)揮調(diào)控作用[16，27]。因此，我們假設(shè)hnRNPU 可能調(diào)控V（D）J重組。

本研究成功構(gòu)建了靶向小鼠hnRNPU基因的shRNA 的表達載體及慢病毒。但由于hnRNPU具有多種生物學(xué)功能[14，16，20，28]，對于細(xì)胞的生存至關(guān)重要[29]，在用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株時，我們沒有獲得hnRNPU-knockout 的單細(xì)胞克隆，只篩選到hnRNPUKD的克隆。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了hnRNPU基因穩(wěn)定敲減的A70細(xì)胞株，為探討hnRNPU在V（D）J重組及早期B細(xì)胞發(fā)育中的調(diào)控奠定了實驗基礎(chǔ)。

（利益沖突：無）