段紹琪 孫 杰 劉鳳君

1 川北醫(yī)學(xué)院國際教育交流學(xué)院，四川省南充市 637000； 2 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科

結(jié)核病，是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所引起的一種嚴(yán)重危害人民健康的慢性傳染病，是目前已知傳染病中最致命的傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織《2020年全球結(jié)核病報(bào)告》，2019年全球約有1 000萬人患結(jié)核病，特別是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家未能實(shí)現(xiàn)“終止結(jié)核病策略”既定目標(biāo)[1]，尋找高效、準(zhǔn)確、簡便的診斷方法是控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵。目前已知的細(xì)菌學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測和病理診斷受結(jié)核分枝桿菌本身特性及卡介苗廣泛接種的影響，靈敏度和特異性較低，尚不能達(dá)到理想的診斷率。1998年結(jié)核分枝桿菌基因序列公布，針對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的檢測方法越來越受到國內(nèi)外研究者的重視，張敦熔在2000年《現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)》也指出：如果我們掌握了結(jié)核分枝桿菌主要蛋白質(zhì)的氨基酸序列,就可以合成一系列多肽，用單克隆抗體作為探針鑒定的具有免疫優(yōu)勢的抗原決定簇, 其診斷的敏感性、特異性分別高達(dá)90%、100%[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，目前已報(bào)道的結(jié)核分泌抗原多達(dá)800多種，但其中只有13種被確定為主要結(jié)構(gòu)[3]。因此，選擇特異性和敏感性均高的抗原是重中之重。本文就已報(bào)道的具有重要診斷意義的結(jié)核分枝桿菌分泌性抗原在結(jié)核檢測方法中的應(yīng)用研究進(jìn)展情況加以概括。

1 結(jié)核分枝桿菌菌屬抗原

1.1 Ag85復(fù)合體 Ag85復(fù)合體又稱為MPT54，屬于胞外蛋白，是存在于結(jié)核桿菌對數(shù)生長期早期濾液中的主要組成成分，是分枝桿菌共有抗原，由Ag85-A、Ag85-B、Ag85-C3種相對分子質(zhì)量相近，且抗原性有交叉的蛋白質(zhì)組成的異三聚體復(fù)合物[4]。其中，Ag85-A和Ag85-B具有較強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫活性，由于其具有多種T細(xì)胞的抗原決定因子，可誘導(dǎo)產(chǎn)生皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)和保護(hù)性免疫應(yīng)答。Ag85復(fù)合體參與MTB細(xì)胞壁脂質(zhì)的生物合成、補(bǔ)體介導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌吞噬作用以及結(jié)核分枝桿菌侵襲力的組成[5]，Ag85復(fù)合體屬于纖連結(jié)合蛋白，其受體是人類細(xì)胞表面纖連蛋白，在結(jié)核病的急性感染期產(chǎn)生重要作用[6]。

姬祥等[7]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病人血清中，以Ag85A+Ag85B或Ag85C血清IgG抗體陽性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用ELISA法檢測血清結(jié)核分枝桿菌IgG抗體敏感性和特異性分別為60.4%和86.1%，提示Ag85復(fù)合體對結(jié)核病血清學(xué)診斷具有一定的臨床意義。Ernst JD等[8]采用ELISA法研究發(fā)現(xiàn)Ag85B在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體不同的菌株和譜系分泌具有顯著差異，在結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠的肺細(xì)胞勻漿中可以找到大量的Ag85B，這些差異可能影響T細(xì)胞反應(yīng)的頻率和幅度，提示Ag85B不僅可以鑒別活動性結(jié)核病、既往感染、卡介苗接種人群，還可能參與調(diào)節(jié)細(xì)菌環(huán)境以促進(jìn)新宿主細(xì)胞的感染。滿昌軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)Ag85復(fù)合體免疫組化染色(IHC)對腎結(jié)核的敏感度為100%，特異性為69.38%，提示Ag85復(fù)合體可以作為診斷腎結(jié)核的補(bǔ)充檢查。車南穎等[10-11]通過免疫組化法檢測石蠟包埋組織標(biāo)本中Ag85B的表達(dá)，并與Ziehl-Neelsen染色進(jìn)行比較。結(jié)果表明，Ag85B的表達(dá)位點(diǎn)和表達(dá)強(qiáng)度與抗酸桿菌的分布位點(diǎn)和數(shù)量一致，且Ag85B免疫組化產(chǎn)生的信號及免疫組化的敏感性明顯強(qiáng)于Ziehl-Neelsen染色，提示Ag85B免疫組化在結(jié)核的病理診斷中具有良好的應(yīng)用價值。而且，免疫組化還具有不需使用油鏡觀察結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，大大提高了病理醫(yī)生的診斷速度，是一種簡便、靈敏的結(jié)核病理診斷方法。

1.2 16Ku蛋白 16Ku蛋白屬于膜蛋白，是hsp X基因編碼的早期分泌蛋白，它是一種小分子熱休克蛋白，可耐高溫，是結(jié)核分枝桿菌處于靜息期時分泌的主要膜蛋白。在高溫環(huán)境中，轉(zhuǎn)錄因子Rv3133v/dosR通過與16Ku蛋白的核心功能區(qū)crystallin結(jié)合發(fā)揮其抑制熱凝集功能。16Ku蛋白不僅能激活B細(xì)胞，還能誘導(dǎo)T細(xì)胞引導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，其獨(dú)特之處在于它具有不依賴ATP分子伴侶的活性，這對結(jié)核桿菌的穩(wěn)定性和存活起著重要的作用。

在85%肺結(jié)核病人的血清中都可以檢測到16Ku蛋白。Raja A等[12]研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用ELISA法檢測聯(lián)合檢測結(jié)核病患者血清中IgA和IgG的16Ku，敏感度可達(dá)到82%，特異性可達(dá)到97%,提示16Ku蛋白在結(jié)核病的血清學(xué)診斷中具有臨床應(yīng)用價值。有研究發(fā)現(xiàn)，對于結(jié)核病患者檢測16Ku和PPD抗體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在卡介苗陽性患者中，16Ku的特異性較高，提示16Ku可區(qū)分結(jié)核患者和卡介苗接種者。

1.3 38Ku蛋白 38Ku蛋白(pab)屬于膜蛋白，是由Pst S基因編碼的一種早期分泌蛋白，占比為10%，為一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，僅在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)和部分卡介苗中。38Ku蛋白含有T和B淋巴細(xì)胞的抗原決定因子，其中有2種特異的B細(xì)胞原決定簇，對應(yīng)于單克隆抗體TB71和TB72[13]，可刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，抗原性較強(qiáng)，能誘導(dǎo)早期反應(yīng)。

38Ku血清學(xué)活性較強(qiáng)，與其他抗體相比，痰涂陽性的結(jié)核病患者，抗38Ku陽性率最高，但總結(jié)目前已報(bào)道的研究結(jié)果，其敏感度為16%～89%，特異性為93%～100%，結(jié)果不全一致，在痰涂陰性結(jié)核病患者種敏感度仍有明顯局限，提示抗38Ku蛋白仍需與其他敏感度較高的抗體聯(lián)合檢測以提高診斷率。Ihama Y等[14]對采用福爾馬林固定石蠟包埋的腸道結(jié)核組織樣本使用38-kDa抗原的單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示除了經(jīng)典的檢查方法外，結(jié)核分枝桿菌單克隆抗體免疫組化染色可能是一種有效和簡單的診斷工具。

2 卡介苗缺失抗原

2.1 MPT64蛋白 MPT64蛋白(MPB64)屬于胞內(nèi)蛋白，是結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液(ST-CF)的主要組成成分，是一種分泌蛋白，占8%，是最早被發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌特異抗原，只存在于MTBC中，卡介苗菌株在傳代過程中丟失了編碼該蛋白的MPT基因。在人類特異性T細(xì)胞應(yīng)答中，MPT64蛋白是最重要的結(jié)核分枝桿菌抗原之一，T細(xì)胞決定簇分布在整個蛋白分子序列中，包含CD4+和CD8+細(xì)胞表位[15]。MPT64對宿主細(xì)胞具有抗凋亡的功能。

在結(jié)核病或PPD陽性患者中，天然和重組MPT64均能誘導(dǎo)其產(chǎn)生T細(xì)胞反應(yīng)和DTH，而卡介苗接種者或環(huán)境分枝感染患者對MPT64皮膚試驗(yàn)無應(yīng)答。丁志鑫[16]發(fā)現(xiàn)，采用ELISA法檢測結(jié)核性胸腔積液樣本中IgG抗體的敏感性為26.3%，特異性為95.6%；MPT64-Rv1958c融合蛋白的敏感性和特異性分別為54.9%和91.2%，提示MPT64作為單一抗原診斷結(jié)核病的敏感性低于其與Rv1958c結(jié)合的融合蛋白。楊瑜等[17]發(fā)現(xiàn)利用膠體金免疫層析法(GICA)檢測MPT64可在7d時準(zhǔn)確、快速地鑒定結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況。Purohit MR等[18]通過免疫組化法檢測采用福爾馬林固定的腹部結(jié)核和淋巴結(jié)結(jié)核標(biāo)本中MPT64的表達(dá)，其總體敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為92%、97%、98%和85%，表明MPT64免疫組化技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌感染建立早期和特異性診斷是一種簡單、敏感的技術(shù)。

2.2 ESAT-6 ESAT-6蛋白屬于胞內(nèi)蛋白，是從ST-CF中分離出的另一種早期分泌蛋白，由卡介苗缺失的基因片段R1區(qū)的Rv3875基因編碼[19]，Harboe等研究證實(shí)ESAT-6蛋白僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中，而不存在于卡介苗等非致病性結(jié)核分枝桿菌中。因此，ESAT-6是鑒別致病性結(jié)核分枝桿菌、非致病性結(jié)核分枝桿菌和卡介苗的最佳抗原之一。ESAT-6是一種重要的T細(xì)胞抗原，能在感染的早期識別有免疫活性的T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主特異性 CD4+T細(xì)胞、CD8+CTL增殖及γ干擾素的大量產(chǎn)生，具有免疫保護(hù)作用。ESAT-6與結(jié)核分枝桿菌的溶細(xì)胞活性相關(guān)，是抗結(jié)核分枝桿菌記憶免疫應(yīng)答的主要配體，具有免疫記憶作用。ESAT-6亦具有B淋巴細(xì)胞的抗原決定簇，能刺激特異性免疫球蛋白的產(chǎn)生，但由于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞膜上沒有ESAT-6信號肽序列，其分泌到胞外的機(jī)制暫不明確，結(jié)核病患者血清中ESAT-6含量較低。

目前臨床上廣泛應(yīng)用的IGRA檢測就是利用結(jié)核分枝桿菌表達(dá)的ESAT-6和CFP10可刺激結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)大量分泌γ干擾素的特性，在采集血樣后12～18h檢測γ干擾素含量，相對于結(jié)核皮膚試驗(yàn)，IGRA具有較高的敏感性和特異性，且不受卡介苗接種和大多數(shù)非致病分支感覺的影響。朱雅娟等[20]觀察結(jié)核性腦膜炎(TBM)患者腦脊液中ESAT-6的動態(tài)變化及其診斷意義，結(jié)果表明，不管是治療前還是治療1、2、4周后，TBM患者腦脊液中ESAT-6均高于非TBM患者，且腦脊液中ESAT-6水平隨病情改善而逐漸下降，提示早期檢測疑似TBM患者腦脊液中的ESAT-6具有一定的診斷意義，且動態(tài)檢測TBM患者腦脊液中的ESAT-6可評估患者病情變化。孫立[21]通過檢測腎結(jié)核患者腎組織中ESAT-6表達(dá)，探討ESAT-6在腎結(jié)核早期診斷中的意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎結(jié)核患者腎組織中ESAT-6表達(dá)增強(qiáng)，ESAT-6免疫組化染色的敏感性和特異性分別為100%和83%，與Ag85相似但高于Ag85。Ag85為75%，提示抗ESAT-6抗體免疫組化可作為腎結(jié)核早期診斷的輔助試驗(yàn)，特異性高于抗Ag85抗體。

2.3 CFP10 CFP10由缺失卡介苗基因片段R1區(qū)的Rv3874基因編碼[19]，是另一種從ST-CF中分離出來的早期分泌蛋白,僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中，不存在于卡介菌等非致病性結(jié)核分枝桿菌。編碼CFP10的基因位于編碼ESAT-6的基因的上游，兩個基因序列同源性為25%的，且兩個基因是共同轉(zhuǎn)錄，有研究發(fā)現(xiàn)CFP10和ESAT-6形成1∶1的緊密復(fù)合物來發(fā)揮作用[22]。CFP10是重要的T淋巴細(xì)胞靶抗原，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T淋巴細(xì)胞增殖活化，亦能刺激PBMC產(chǎn)生大量γ干擾素。同ESAT-6類似，CFP10具有免疫保護(hù)和免疫記憶功能。

有研究指出，CFP10還具有特異性的穿孔素，可作為一種基于細(xì)胞免疫的兒童結(jié)核病患者的新診斷標(biāo)志，并有可能區(qū)分ATB和LTBI[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，CFP10抗原單獨(dú)檢測結(jié)核患者血清中相應(yīng)抗體的敏感性并不理想。以ESAT-6和CFP10融合抗原為特異性抗原的新型皮膚測試(EC)在1.0μg/0.1ml的劑量下具有較高的特異性和敏感性，與T-SPOT.TB相當(dāng)，且EC皮膚測試不受卡介苗接種影響[24],其安全性能可，在測試觀察過程中沒有出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)事件。以ESAT-6和CFP10融合作為特異性抗原對外周單克隆細(xì)胞具有良好的活化能力，不但能產(chǎn)生大量γ干擾素，其主要優(yōu)勢在于不受接種卡介苗的影響，避免假陽性。

綜上所述，種類繁多的結(jié)核分枝桿菌分泌特異性抗原在結(jié)核診斷中的應(yīng)用尚未確定，但可以肯定的是，結(jié)核分枝桿菌分泌特異性抗原可以作為檢測和區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性感染的重要手段。目前以血液、肺泡灌洗液為標(biāo)本關(guān)于結(jié)核分枝桿菌分泌特異性抗原檢測的研究已較多，而以結(jié)核病灶組織為標(biāo)本進(jìn)行相對較少，且僅以單一抗原為檢測對象，效果不夠理想。因此，以結(jié)核病灶組織為標(biāo)本，檢測相關(guān)抗原蛋白的融合表達(dá)或多種抗原的聯(lián)合應(yīng)用是未來結(jié)核病診斷的發(fā)展方向。