王仲楠，董大明

外傷性脊髓損傷（spinal cord injuries，SCI）是一類嚴(yán)重的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)為損傷節(jié)段以下軀體感覺、自主運(yùn)動(dòng)及括約肌舒縮功能部分或完全喪失。我國(guó)現(xiàn)有外傷性SCI患者超過200萬，每年新增10～14 萬人，且主要為年輕患者[1]。SCI后的軸突再生極其有限，常導(dǎo)致患者永久性神經(jīng)功能損傷，至今沒有方法能完全修復(fù)SCI[2]。SCI 早期，首先出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡壞死、組織血管破壞，并可能伴有脊髓神經(jīng)束斷裂；繼發(fā)出現(xiàn)微環(huán)境改變，脊髓和周圍組織水腫，受損組織缺血加重；后期損傷區(qū)域空洞及膠質(zhì)瘢痕形成，阻礙軸突再生[3]。

近年來，有關(guān)治療SCI的研究主要集中在組織工程、基因和藥物治療等方面。組織工程作為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的分支學(xué)科，是當(dāng)下研究熱點(diǎn)。組織工程支架能創(chuàng)造適合種子細(xì)胞生存的微環(huán)境，橋接損傷缺損、抑制膠質(zhì)瘢痕形成，為軸突再生提供接觸引導(dǎo)；同時(shí)限制局部炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡；還可促進(jìn)神經(jīng)再生，軸突生長(zhǎng)等作用[4]。合格的組織工程支架至少應(yīng)具備良好的生物相容性、可降解性、一定的力學(xué)性能、可充當(dāng)載體等性質(zhì)。本文從多角度對(duì)近年來組織工程化治療SCI 涉及的各類型支架研究進(jìn)行回顧總結(jié)，并討論該技術(shù)的發(fā)展前景。

1 支架材料

支架材料是組織工程支架的基礎(chǔ)，理想的支架材料需要具備：良好的生物相容性、降解性，能夠引導(dǎo)細(xì)胞遷移、抑制膠質(zhì)瘢痕形成，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子傳遞等。而修復(fù)SCI 的支架材料還應(yīng)滿足特殊要求：結(jié)構(gòu)符合脊髓的構(gòu)造特點(diǎn)，能夠營(yíng)造適宜的再生微環(huán)境[5]。生物支架材料分為天然和合成材料兩類：天然材料具有良好的生物相容性、可降解性、低毒性、固有生物性能等優(yōu)點(diǎn)，有多種材料應(yīng)用于臨床；合成材料則擁有諸多特質(zhì)，如可控的生物降解性、可定制的物理學(xué)和機(jī)械學(xué)特性，還可以定制具有獨(dú)特性質(zhì)的生物材料。應(yīng)用合成材料制作支架同樣能夠用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷并產(chǎn)生較好的治療效果[3]。

1.1 天然材料

1.1.1 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA） HA是細(xì)胞外基質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)成分，具有良好的生物相容性、降解性和非免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，臨床上已有廣泛應(yīng)用[6]。Liming Li等[7]以HA和粘附肽為載體構(gòu)建出多肽栓系水凝膠支架，可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)。Geissler等[8]發(fā)現(xiàn)HA可釋放使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞保持未分化狀態(tài)的信號(hào)。利用該特性研制出一種三維仿生水凝膠支架，通過移植后HA的緩釋，或許可以阻止SCI引起的脫髓鞘反應(yīng)，由此達(dá)到促進(jìn)修復(fù)損傷脊髓的目的。

1.1.2 殼聚糖 殼聚糖有良好的細(xì)胞黏附力，能夠促進(jìn)細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)，無生物毒性，是較理想的支架材料，缺點(diǎn)是降解速度過快，且溶脹性高。鄭華斌等[9]研制的殼聚糖-藻酸鹽復(fù)合三維支架有良好的細(xì)胞黏附性和較低毒性；構(gòu)建的組織工程化脊髓與宿主脊髓橋接緊密，抑制炎性反應(yīng)及瘢痕、空洞形成，移植3 周后實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腂BB 評(píng)分明顯提高。Ji 等[10]提出設(shè)想，殼聚糖的不足可以被絲素蛋白彌補(bǔ)，制成的復(fù)合支架能夠避免2 種材料的排他性限制，同時(shí)具有優(yōu)異的力學(xué)性能，有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.1.3 纖維蛋白 纖維蛋白是參與止血和組織再生最重要的蛋白質(zhì)之一。三叉神經(jīng)節(jié)的再生過程中，細(xì)胞沿著纖維蛋白定向遷移、增殖；在SCI中表現(xiàn)為促進(jìn)軸突的再生。Yao 等[2]將纖維蛋白水凝膠（aligned fibrin hydrogel，AFG）支架植入大鼠SCI模型，術(shù)后2 周觀察到實(shí)驗(yàn)組軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)顯著高于對(duì)照組。Nazari 等[11]證實(shí)，AFG 支架能夠提高細(xì)胞活力，誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，促進(jìn)SCI的修復(fù)。

1.1.4 唾液酸 聚唾液酸（polysialic acid, PSA）通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)來控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，可以抑制Iba1 陽性的小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞活化，減少TNF-α和IL-6的釋放和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 的表達(dá)，在保護(hù)神經(jīng)元、抑制繼發(fā)損傷，促進(jìn)SCI后軸突生長(zhǎng)、髓鞘形成和神經(jīng)功能恢復(fù)方面具有積極的影響[12]，是PSA應(yīng)用于組織工程治療SCI的重要依據(jù)。

1.1.5 膠原蛋白 膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，有良好的生物相容性和生物降解性，在醫(yī)用生物材料方面有廣泛應(yīng)用。但其缺乏一定的力學(xué)性能，難以塑形，且體內(nèi)降解速度過快[13]，近年來更多集中于復(fù)合支架的研究，如膠原/絲素蛋白[14]、膠原蛋白/殼聚糖[15]復(fù)合支架等，彌補(bǔ)單純材料支架的不足。

1.1.6 多肽 多肽在組織工程支架中主要的表現(xiàn)形式為水凝膠，具有一定強(qiáng)度，水溶性較好，微觀呈現(xiàn)為多孔納米結(jié)構(gòu)，具有一定的載藥和控緩釋能力，于人體無毒害副作用，生物相容性優(yōu)秀[16]。Zhai Hong 等[17]構(gòu)建的RADA16 雜化水凝膠支架在保留了多肽納米結(jié)構(gòu)的同時(shí)提高了機(jī)械穩(wěn)定性并降低了降解速度，在動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中獲得了明顯成效。

1.2 合成/復(fù)合材料

合成材料的原料來源廣泛，更容易根據(jù)需要調(diào)整材料性能，在臨床及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，最具代表性的有聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、聚乙二醇等。

1.2.1 聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL） PCL 有良好的生物相容性、高度可加工性，生物活性較低，是優(yōu)秀的細(xì)胞載體。Zhou 等[18]構(gòu)建的PCL 支架能夠促進(jìn)組織重塑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌，動(dòng)物模型運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)明顯。Babaloo等[19]將PCL和明膠結(jié)合，提高細(xì)胞黏附性和降解率，一定程度上能夠促進(jìn)神經(jīng)元和髓鞘再生，促進(jìn)SCI修復(fù)。

1.2.2 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） Kong 等[20]通過回顧分析研究，總結(jié)PEG 可生物降解，具有良好的生物相容性和較低的免疫原性；可抑制空洞、瘢痕形成；能夠阻止神經(jīng)纖維化，抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡；可用作受損軸突髓鞘的密封劑，促進(jìn)神經(jīng)電信號(hào)的傳遞，是組織工程化脊髓支架的優(yōu)秀材料。

1.2.3 導(dǎo)電生物材料 SCI 后，損傷部位的組織細(xì)胞中有多種帶電分子的濃聚和運(yùn)動(dòng)，這些局部電學(xué)性質(zhì)的變化產(chǎn)生了胞外內(nèi)生電場(chǎng)，其具有引導(dǎo)細(xì)胞遷移、促進(jìn)組織修復(fù)的能力，而在嚴(yán)重SCI的情況下，電流傳導(dǎo)受阻，抑制了損傷脊髓的自我修復(fù)[21]。有研究證明，導(dǎo)電材料支架如導(dǎo)電聚吡咯（polypyrrole，PPy）可以通過傳導(dǎo)電刺激促進(jìn)神經(jīng)再生，聚乳酸-羥基乙酸導(dǎo)電纖維可以促進(jìn)PC12細(xì)胞分化及海馬神經(jīng)元細(xì)胞突起黏附、延伸[22]。王玲玲等[22]評(píng)估聚苯胺-聚乳酸（polylactic acid，PLA）支架能夠促進(jìn)嗅鞘細(xì)胞黏附與增殖，具有良好生物相容性，但還需進(jìn)一步研究不同電刺激下細(xì)胞在支架表面的各種行為改變，為后期體內(nèi)試驗(yàn)提供支持。Raynald等[23]構(gòu)建出PPy-PLA復(fù)合支架，植入支架后實(shí)驗(yàn)組表達(dá)更多NF 陽性信號(hào)，突觸數(shù)量較對(duì)照組更多。Shu等[21]研究表明：PPy-PLA支架可以抑制繼發(fā)性損傷，植入后期軸突再生顯著增加，推測(cè)與支架植入后恢復(fù)電信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。Shu等與Raynald團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相仿，表明PPy-PLA支架等導(dǎo)電生物材料在組織工程化修復(fù)SCI 方面的潛在可能、電信號(hào)傳導(dǎo)在SCI修復(fù)機(jī)制中占據(jù)的地位。

1.3 納米材料

近年發(fā)現(xiàn)石墨烯材料在記錄、刺激神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)方面有巨大潛力，特別是在神經(jīng)再生領(lǐng)域，然而關(guān)于該類材料的毒性尚無定論[24]?；谏窠?jīng)組織與碳納米材料接觸時(shí)的生物學(xué)反應(yīng)，Ankor G.M.等[24]探究還原氧化石墨烯（reduced graphene oxider，rGO）選擇性基質(zhì)的潛力，發(fā)現(xiàn)rGO支架在模型體內(nèi)可以促進(jìn)細(xì)胞黏附而不發(fā)生局部亞急性毒性跡象；rGO對(duì)膜電參數(shù)、脊髓密度和突觸活動(dòng)有重大影響，它的電學(xué)性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不可忽視。

2 制備工藝

2.1 水凝膠制備工藝

水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)極為親水，含水量可控且結(jié)構(gòu)可控性高，與細(xì)胞外基質(zhì)的組成相似。大多數(shù)天然材料都可制備成水凝膠，來源廣泛價(jià)格低廉，美國(guó)FDA 批準(zhǔn)認(rèn)證了多種水凝膠材料。然而水凝膠機(jī)械性能的保持、溶脹性過高等問題仍需解決。3D、4D（增加時(shí)間維度）打印帶來了希望，有待通過迭代優(yōu)化循環(huán)實(shí)現(xiàn)最佳設(shè)計(jì)[25]。Cai 等[26]構(gòu)建的三維水凝膠支架能顯著提高神經(jīng)干細(xì)胞的黏附和存活，并能協(xié)同生長(zhǎng)因子的釋放，促進(jìn)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元組織，促進(jìn)SCI 的修復(fù)。Zhou 等[27]開發(fā)的導(dǎo)電聚合物水凝膠能夠激活損傷區(qū)域內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生，并促進(jìn)其向神經(jīng)元分化，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育。Nazari等[11]研究顯示干細(xì)胞在纖維蛋白水凝膠中的存活率比在組織培養(yǎng)板中顯著提高，得益于水凝膠與細(xì)胞外基質(zhì)相似的特性。Wan 等[28]的研究表明自聚肽水凝膠支架有良好相容性，適宜的力學(xué)性能、較低的毒性；SCI模型實(shí)驗(yàn)觀察到移植區(qū)域有大量軸突再生，實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢關(guān)節(jié)功能恢復(fù)明顯。水凝膠的三維結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞存活，是優(yōu)秀的材料制備工藝。

2.2 靜電紡絲工藝

靜電紡絲是高聚物溶液或熔融體在電場(chǎng)力作用下，形成帶電噴射流，從噴口噴出形成固體纖維的過程，是制備納米纖維材料的主要途徑[29]。納米纖維可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能，有良好的生物相容性。電紡纖維還有更多相關(guān)應(yīng)用，如研究受損中樞神經(jīng)生物學(xué)過程、SCI中軸突再生的相關(guān)機(jī)制等[30]。

余等[31]利用靜電紡絲制備得到聚丙交酯-乙交酯/FTY720紡絲膜，該支架能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化，對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)有積極作用；應(yīng)用該工藝可以避免全身應(yīng)用FTY720 引起不良反應(yīng)，并抑制神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。Yao等[2]表征的纖維蛋白納米纖維支架，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示新生組織密度明顯高于對(duì)照組，組織分層排列的纖維結(jié)構(gòu)可能是連接病變部位的橋梁。這些結(jié)果提示組織支架的定向排列可以促進(jìn)細(xì)胞遷移和組織再生，正是靜電紡絲工藝的優(yōu)勢(shì)。

靜電紡絲工藝能在納米纖維中摻入從蛋白質(zhì)到低分子親脂性藥物和核酸等各種物質(zhì)。一種新型的三維定向納米纖維水凝膠支架[32]可高效精準(zhǔn)地遞送生物分子和miRNA 并沿纖維均勻分布，有效促進(jìn)軸突再生和髓鞘形成。該研究利用靜電紡絲工藝的優(yōu)勢(shì)，在原料固有優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，發(fā)掘生物支架的潛在能力，使其具備定向輸送能力。

2.3 脫細(xì)胞技術(shù)

大多組織工程支架材料無生物活性，自身的免疫原性難免會(huì)激活機(jī)體的免疫炎性反應(yīng)。脫細(xì)胞技術(shù)將具備生物活性的組織經(jīng)由物理或化學(xué)等方法，制成無或低免疫原性的支架材料，解決了這一難點(diǎn)。Sandeep K.V.等[33]研制的腦膜組織脫細(xì)胞支架具有完整的三維微結(jié)構(gòu)和友好的微環(huán)境，富含幾種關(guān)鍵的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有利于細(xì)胞的長(zhǎng)期生存活動(dòng)和功能發(fā)揮；有完整的血管結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)，能夠修復(fù)受損軸突的物理和生物離斷，為人源化功能神經(jīng)結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。然而，合適、足量的生物組織來源是限制這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用發(fā)展的最大困境。Sandeep等[34]后續(xù)研究的腦膜凍存技術(shù)一定程度上解決了這一難題。Xing等[35]提高了脫細(xì)胞脊髓支架制備效率，使其具備更好的生物學(xué)特性，聯(lián)合特定神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、增殖和分化，彌補(bǔ)了技術(shù)的部分不足。

3 支架形貌/形態(tài)

3.1 微通道/多通道支架

組織工程支架有引導(dǎo)軸突定向生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞黏附再生的作用，支架的開放體積對(duì)此影響尤為顯著。研究表明60%以上的開放體積可以有效促進(jìn)軸突定向生長(zhǎng)，減少膠質(zhì)瘢痕的形成。Shahriari 等[36]引入微米級(jí)孔隙設(shè)計(jì)，將PCL 制備成多孔大容量微通道支架，開放體積最高可達(dá)85%。Chen等[37]關(guān)于功能性多通道支架的研究表明，支架均勻的孔隙和平行排列結(jié)構(gòu)提供引導(dǎo)通道，生物材料的大量填充促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞或新神經(jīng)元附著等，均有助于神經(jīng)元和軸突再生。

灰質(zhì)再生需要更大空間允許細(xì)胞遷移和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成，白質(zhì)則更需要線性通道支持軸突延伸。Chen等[38]以此為基礎(chǔ)，在支架管壁上增加縱軸微通道，整合單H型中心管制成仿脊髓型支架。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該形態(tài)支架能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞遷移及橫向連接，支架壁上的定向微通道利于白質(zhì)軸索線性延伸；復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后能夠促進(jìn)軸突再生，提高SCI治療效率。

3.2 支架表面形貌

Christopher[39]的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，靜電紡絲過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)，水蒸氣在纖維表面冷凝再蒸發(fā)，在凝結(jié)位置留下凹坑，形成獨(dú)特的支架形貌。他們利用纖維表面納米拓?fù)湫g(shù)研究電紡纖維支架納米形貌對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)和紐蛋白表達(dá)的影響。雖然沒有得到預(yù)期結(jié)果，但也取得了積極進(jìn)展，如光滑纖維會(huì)促進(jìn)軸突延伸；淺凹痕形貌的支架一定程度上會(huì)導(dǎo)致GFAP 和紐蛋白的低表達(dá)等。該研究提示了支架表面形貌影響SCI修復(fù)的可能性，與微通道形態(tài)同是精確修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。

3.3 3D仿生打印技術(shù)

3D打印的主要原理是預(yù)先構(gòu)建計(jì)算機(jī)數(shù)字化模型,運(yùn)用可黏合材料通過3D打印機(jī)逐層打印三維實(shí)物模型[40]，5年前我國(guó)已有3D打印脊椎代替病椎的案例報(bào)道[41]?，F(xiàn)3D打印技術(shù)已能承擔(dān)相當(dāng)精度和復(fù)雜度的制造任務(wù)，利用該技術(shù)制造出高精細(xì)度的仿生脊髓支架，可以使SCI的修復(fù)更加便捷高效。

Koffler 等[42]報(bào)道了使用微型連續(xù)投影打印法（μCPP）構(gòu)建中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)用于脊髓再生的治療研究。μCPP無層打印不會(huì)影響機(jī)械完整性，可以根據(jù)需求進(jìn)行縮放和個(gè)體化定制。他們表征的3D仿生水凝膠支架可使膠質(zhì)細(xì)胞沿支架軸線排列，明顯促進(jìn)軸突定向延伸。孫凱等[43]利用3D 打印技術(shù)研究復(fù)合支架孔隙率、吸水膨脹率、力學(xué)及孔徑等性能，也取得了較大進(jìn)展。

4 總結(jié)與展望

組織工程化治療SCI 處于迅猛進(jìn)步的階段，該領(lǐng)域的深度廣度相較5、6 年前已有顯著增加。由于支架材料的易獲取性、可控性等優(yōu)勢(shì)，其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有相當(dāng)?shù)难芯繚摿Α＝M織工程支架的生物相容性、低毒性、可降解性等經(jīng)過多年的研究探索已成為支架基本屬性，今后研究方向應(yīng)更多集中在三要素之間的重疊細(xì)化領(lǐng)域上，如支架作為遞送或控緩釋系統(tǒng)與生物活性分子的共同作用；支架三維/微觀結(jié)構(gòu)對(duì)種子細(xì)胞生長(zhǎng)分化、突觸延伸的影響；支架材料參與調(diào)控組織或細(xì)胞活動(dòng)等。

總而言之，組織工程支架是一項(xiàng)有巨大研究潛力和應(yīng)用價(jià)值的課題，目前的研究成果證明這是一條可行的道路。關(guān)于修復(fù)SCI 的研究目標(biāo)，其一是盡可能提高SCI 的治療效率和神經(jīng)功能的恢復(fù)；其二是診斷標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)分、治療方案的臨床應(yīng)用等，距離實(shí)現(xiàn)目標(biāo)還有很長(zhǎng)的道路。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多具有潛力的研究方向不斷出現(xiàn)，相信經(jīng)過世界學(xué)者們的不斷努力與探究，會(huì)有更多成果早日應(yīng)用于臨床，為SCI患者帶來福音。