王 昊，王 然，巴 乾

上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025

二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）是一種具有強(qiáng)力著色能力的白色、無(wú)味粉末，在自然界以銳鈦礦、板鈦礦和金紅石3 種礦物形式存在，在食品領(lǐng)域其作為色素添加劑被廣泛應(yīng)用［1-2］。在聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）編寫的一份報(bào)告中，提到了1927、1928、1950、1955 和1963 年發(fā)表的5 項(xiàng)研究和1962 年的一項(xiàng)未發(fā)表研究，及其對(duì)動(dòng)物攝入TiO2后的吸收和毒性作用的評(píng)估［3］。根據(jù)這些研究結(jié)果JECFA 得出結(jié)論，由于TiO2具有不可溶性、惰性、無(wú)毒性作用等特點(diǎn)，無(wú)需設(shè)立TiO2的可接受日攝入量［4-5］。因此在1969 年，TiO2被歐盟批準(zhǔn)為食品添加劑并編號(hào)為E171，且未對(duì)其使用量進(jìn)行限制［2］。在美國(guó)，食品藥品監(jiān)督管理局于1966 年批準(zhǔn)TiO2作為食品添加劑，并規(guī)定其用量不應(yīng)超過(guò)產(chǎn)品總重量的1%［6］。而在2021 年，歐洲食品安全局對(duì)E171 進(jìn)行了重新評(píng)估，且認(rèn)為TiO2作為食品添加劑是不安全的［7］。目前，市面上的食品添加劑中TiO2顆粒的尺寸范圍為1～1 000 nm，其中納米尺寸顆粒（0.1～100 nm）占有一定的比例。PROQUIN 等［8］發(fā)現(xiàn)E171 由39%的納米尺寸顆粒和61%的微米尺寸顆粒組成。CHEN 等［9］對(duì)上海市售的6種口香糖中的TiO2進(jìn)行分離，并通過(guò)透射電子顯微鏡對(duì)其粒徑進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)27.7%～43.7%的TiO2顆粒尺寸在100 nm 以下。同時(shí)，一項(xiàng)針對(duì)2010—2012 年間荷蘭人群的TiO2日攝入量的研究［10］發(fā)現(xiàn)，7 歲以上人群的攝入范圍為0.06～0.17 mg/kg，2～6歲兒童則達(dá)到0.67 mg/kg。另外，在15 名死者的尸檢中也發(fā)現(xiàn)，其肝、脾、腎、空腸和回腸樣本中的總Ti 含量范圍在0.01～2.0 mg/kg 之間，其中顆粒狀TiO2占總Ti 質(zhì)量的80%［11］。因此，這種長(zhǎng)期的TiO2膳食暴露以及膳食TiO2中含有的TiO2納米顆粒（TiO2nanoparticles，TiO2NPs）對(duì)人體可能產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)及毒性作用逐漸引起了我們的關(guān)注。

已有較多研究［12-13］發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群對(duì)調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境、控制腸道炎癥反應(yīng)發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而TiO2NPs經(jīng)口攝入會(huì)直接影響消化道組織以及腸道微生物群的豐度和代謝水平并破壞腸道微環(huán)境的平衡。本文對(duì)TiO2NPs被攝入后對(duì)消化道內(nèi)細(xì)胞組織及微生物群的影響以及該顆粒在腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的促炎作用進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步完善TiO2納米材料在食品領(lǐng)域中應(yīng)用的安全性研究提供參考。

1 TiO2 NPs對(duì)消化道的影響

1.1 TiO2 NPs對(duì)口腔的影響

TiO2NPs經(jīng)口腔攝入體內(nèi)時(shí)，首先會(huì)與口腔黏膜直接接觸。TEUBL 等［14］使用NM100（金紅石，普通尺寸）、NM105（金紅石，22 nm）、NM101（金紅石，7 nm）TiO2NPs處理豬頰黏膜模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏膜細(xì)胞活力和黏膜完整性均未受到影響，其中NM100 和NM105 穿透了頰黏膜上部和下部，而NM101 僅能穿透頰黏膜上部，且NM105 可導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，TEUBL等［15］又研究了親水性（NM103，金紅石，20 nm）和疏水性（NM104，金紅石，20 nm）TiO2NPs對(duì)相同體外模型的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)疏水性顆粒存在于囊泡結(jié)構(gòu)中，親水性顆粒則自由分布在細(xì)胞質(zhì)中，其中親水性顆粒比疏水性顆粒具有更強(qiáng)的引發(fā)毒性作用的潛力（如導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生）。

研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 與唾液接觸過(guò)程中能夠?qū)Ζ?淀粉酶的活性產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)唾液中的黏蛋白會(huì)迅速吸附在TiO2NPs表面，改變顆粒間的膠體相互作用，從而降低顆粒聚集及形成團(tuán)聚體的趨勢(shì)。這種變化會(huì)影響TiO2NPs 進(jìn)入胃腸道的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響其穿透胃腸道的黏液層、被上皮細(xì)胞吸收和與腸道微生物相互作用的能力［16］。

1.2 TiO2 NPs對(duì)胃腸道的影響

1.2.1 TiO2NPs影響胃腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收 小腸是食物消化和吸收的主要場(chǎng)所，其中小腸固有層和上皮共同凸向腸腔所形成的葉狀結(jié)構(gòu)為小腸絨毛，其主要目的是增大腸道的表面積，利于小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。微絨毛是絨毛上的刷狀緣結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞質(zhì)的突起。當(dāng)TiO2NPs進(jìn)入小腸時(shí)，會(huì)通過(guò)破壞腸上皮細(xì)胞的絨毛和微絨毛，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，DUDEFOI 等［18］使用TiO2NPs 對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞排列不規(guī)則且小腸絨毛變長(zhǎng)；KWON 等［19］使用TiO2NPs 處理大型蚤后，觀察到其腸上皮細(xì)胞的突起和胞質(zhì)內(nèi)含物的擴(kuò)張，且微絨毛形狀變得不規(guī)則。在模擬小腸環(huán)境的體外模型實(shí)驗(yàn)［12，20-22］中發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 沉積可減少腸上皮細(xì)胞的微絨毛數(shù)量，并破壞微絨毛的正常組織形態(tài)。而該種破壞會(huì)直接影響金屬元素（如鐵、鋅）［20］、脂質(zhì)［20］、葡萄糖［22］和氨基酸［23］的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收；同時(shí)，GUO等［20］還發(fā)現(xiàn)TiO2NPs暴露可使腸上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，這提示TiO2NPs 影響了細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。鑒于TiO2自身的化學(xué)惰性，人們常認(rèn)為微絨毛的破壞與TiO2NPs的物理沉降有關(guān)；但FAUST等［21］通過(guò)創(chuàng)造出微重力條件，消除了TiO2NPs物理沉降的因素，分析其對(duì)細(xì)胞微絨毛的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TiO2NPs仍然能通過(guò)生物學(xué)效應(yīng)對(duì)微絨毛造成破壞。

除了通過(guò)破壞小腸絨毛和微絨毛來(lái)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收外，TiO2NPs還可以通過(guò)其他途徑影響脂質(zhì)的消化及吸收［24-25］。LI 等［25］發(fā)現(xiàn)脂肪酶會(huì)吸附在TiO2NPs表面，從而減少水解脂質(zhì)的脂肪酶含量；同時(shí)，該顆粒還會(huì)吸附在脂滴表面，從而減少脂滴暴露于脂肪酶的表面積。但目前，尚未有研究報(bào)道TiO2NPs的粒徑大小與脂質(zhì)消化、吸收有直接關(guān)聯(lián)。

1.2.2 TiO2NPs促進(jìn)胃腸道炎癥的發(fā)生與發(fā)展 TiO2NPs可通過(guò)多個(gè)方面促進(jìn)胃腸道炎癥的發(fā)生與發(fā)展。一方面，TiO2NPs的暴露會(huì)引起腸道形態(tài)的變化，主要表現(xiàn)為病理性炎癥浸潤(rùn)損傷［26-27］和線粒體異常［27］。PINGET 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠攝入TiO2NPs 會(huì)上調(diào)其腸上皮細(xì)胞的黏蛋白基因表達(dá)水平。LIMAGE等［29］發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 暴露會(huì)增加體外胃腸道模型（由Caco-2/HT29-MTX-E12 細(xì)胞模擬）的黏液層厚度及黏液分泌量，從而使其酸性和中性黏蛋白的分泌增加，并使二者的比例發(fā)生變化；且另有報(bào)道［30-31］證實(shí)，胃腸道的炎癥和癌癥的發(fā)生往往與酸性、中性黏蛋白的分布及比例的改變相關(guān)。值得關(guān)注的是，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［32］中研究者卻發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 的攝入會(huì)顯著降低小鼠小腸黏液的厚度，并下調(diào)腸道中重組黏蛋白2（recombinant mucin 2，MUC2） 的 表 達(dá) 水 平，而MUC2是腸杯狀細(xì)胞分泌的腸黏液中的重要成分，對(duì)維持腸黏膜保護(hù)屏障起到了重要的作用［33］。因此，TiO2NPs對(duì)消化道及相關(guān)細(xì)胞的分泌和代謝的影響還有待后續(xù)研究加以探索。另一方面，消化道及相關(guān)細(xì)胞暴露于TiO2NPs的環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致炎癥相關(guān)因子的增加。研究顯示，TiO2NPs的暴露會(huì)上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達(dá)和Caco-2 細(xì)胞中的IL-8 的表達(dá)［34］，還可上調(diào)結(jié)腸中的IL-1α、IL-6、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α， TNF-α） 和IL-17A 等 炎 癥 因 子 的 表達(dá)［32，35］。同 時(shí)，多 項(xiàng) 研 究 發(fā) 現(xiàn)，TiO2NPs 會(huì) 導(dǎo) 致ROS 的積累［34，36-37］及超氧化物的生成［37］，進(jìn)而引起腸道炎癥的發(fā)生與發(fā)展。

另外，TiO2NPs的暴露還會(huì)影響細(xì)胞活力及其代謝水平。研究顯示，TiO2NPs暴露可下調(diào)Caco-2細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)DNA 發(fā)生氧化損傷［36］，且細(xì)胞活力呈劑量依賴性下降［34］。同樣地，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［38］發(fā)現(xiàn)，向大鼠腹腔注射TiO2NPs可顯著降低其腎臟、肝臟和脾臟中的谷胱甘肽水平和抗氧化酶活性。CHEN等［27］對(duì)小鼠的糞便進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TiO2NPs 暴露后增加的代謝物以N-乙酰組胺、己內(nèi)酰胺和甘油磷膽堿為主，而減少的代謝物以4-甲基-5-噻唑乙醇、L-組氨酸和L-鳥(niǎo)氨酸為主。MU 等［39］研究還發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs的長(zhǎng)期暴露會(huì)顯著減少腸系膜淋巴結(jié)中CD4+T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。綜上所述，膳食中攝入TiO2NPs會(huì)影響胃腸道細(xì)胞的生理功能和代謝水平，干擾體內(nèi)免疫系統(tǒng)的平衡并導(dǎo)致胃腸道炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

2 TiO2 NPs對(duì)腸道微生物群影響

2.1 TiO2 NPs對(duì)腸道微生物群多樣性的影響

許多研究證實(shí)TiO2NPs對(duì)于微生物群整體多樣性的 影 響 較 為 有 限［17，39-40］，但CHEN 等［41］通 過(guò)16S rDNA 測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)大鼠亞慢性暴露于TiO2NPs 的膳食環(huán)境中可導(dǎo)致其腸道微生物群多樣性呈劑量依賴性增加。KOLBA 等［42］發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs 暴露可導(dǎo)致雞的盲腸質(zhì)量/體質(zhì)量比顯著增加，而盲腸質(zhì)量的增加提示細(xì)菌總量有所增加［43］。目前，TiO2對(duì)微生物群的研究主要為體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，且多以中短期的暴露為主。因此長(zhǎng)期攝入TiO2NPs對(duì)于人體腸道微生物群多樣性的影響尚不清楚，仍需開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

2.2 TiO2 NPs對(duì)腸道微生物群豐度的影響

與人體細(xì)胞不同，腸道微生物菌群雖能阻隔納米材料的細(xì)胞壁，但缺乏特定的主動(dòng)攝取機(jī)制（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有的內(nèi)吞作用）。因此，TiO2NPs 影響腸道微生物菌落的機(jī)制與人體細(xì)胞主動(dòng)攝取TiO2NPs的機(jī)制間存在較大差異。目前，納米材料的抗微生物作用主要?dú)w因于該材料解離出的離子，由于不同微生物群對(duì)離子的敏感性存在差異，使得納米材料對(duì)微生物群的影響有較大的種屬差異性，進(jìn)而其也會(huì)給微生物群的豐度帶來(lái)一定影響［12，44］。

研究［45］表明，納米材料的抗菌和促炎作用可能會(huì)促進(jìn)原本低豐度的機(jī)會(huì)細(xì)菌的“繁殖”。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs暴露后腸道微生物群的豐度會(huì)發(fā)生顯著變化， 如厚壁菌門 （Phylum Firmicutes）［46-47］、蛋白菌門（Proteobacteria）［17］、紅球 菌 屬（Rhodococcus）［17］、 梭 狀 芽 孢 桿 菌 屬（Clostridium）［40，47］等細(xì)菌的豐度增加，普氏菌屬（Prevotella）［17］、韋榮氏球菌屬（Veillonella）［27］、擬桿 菌 屬 （Bacteroides）［32，40，46］、 羅 氏 菌 屬（Rothia）［41］、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）［39，42，46］、乳桿菌屬（Lactobacillus）［26，40，43，48-50］等細(xì)菌的豐度降低；其中，TiO2NPs對(duì)雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌的生長(zhǎng)和活力的影響值得關(guān)注。KHAN 等［49］使用益生菌制劑分離得到凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis），并從巧克力中分離得到平均粒徑約為40 nm 的TiO2NPs，共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)125 μg/mL 的TiO2NPs可有效抑制益生菌的生長(zhǎng)和活力；繼而推測(cè)，僅20 g 測(cè)試巧克力中的TiO2NPs 含量足可以影響2～8 歲兒童的腸道微生物群。ZHAO 等［26］觀察連續(xù)14 d 攝入TiO2NPs 的小鼠并采集其糞便，通過(guò)糞便菌群移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs可使小鼠腸道微生物群失調(diào)，并可激活腸道組織中核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、誘發(fā)結(jié)腸炎癥；隨后，使小鼠口服鼠李糖乳桿菌補(bǔ)充劑后發(fā)現(xiàn)，口服補(bǔ)充劑可有效抑制原本被激活的NF-κB信號(hào)通路，并減輕TiO2NPs引起的結(jié)腸炎癥損傷。

2.3 TiO2 NPs對(duì)微生物代謝的影響和促炎作用

TiO2NPs引起的腸道炎癥反應(yīng)包括對(duì)腸道中各類細(xì)胞的直接促炎作用，以及影響腸道微生物代謝所致的間接促炎作用。PINGET 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs的攝入可影響體內(nèi)細(xì)菌代謝產(chǎn)物的生成，促進(jìn)體外共生細(xì)菌的生物膜形成。同時(shí)，亦有大量研究發(fā)現(xiàn)攝入TiO2NPs會(huì)導(dǎo)致腸道微生物代謝紊亂，顯著增加脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的分泌，而后者則是膳食攝入TiO2NPs引起腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要媒介之一［27，32，41］。目前，已有研究［50］發(fā)現(xiàn)，LPS 主要通過(guò)刺激Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。YAN 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs的攝入會(huì)導(dǎo)致小鼠腸內(nèi)容物中LPS水平顯著升高，同時(shí)伴隨腸PKC （protein kinase C，蛋白激酶C）/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活；因此推測(cè)，TiO2NPs導(dǎo)致的腸道炎癥反應(yīng)可能是由大量的LPS 觸發(fā)TLR4信號(hào)通路，繼而激活NF-κB 信號(hào)通路并產(chǎn)生大量的炎癥因子所致。

3 總結(jié)與展望

考慮到膳食中人們長(zhǎng)期攝入TiO2的客觀事實(shí)，學(xué)者們針對(duì)TiO2的研究也長(zhǎng)期集中在對(duì)該材料的急性毒性、慢性毒性等毒理學(xué)方面，而TiO2的不可溶性和惰性使其被認(rèn)為是無(wú)毒性的。但多數(shù)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，TiO2NPs能從多個(gè)方面影響消化道組織和腸道微生物群。本文簡(jiǎn)要綜述了TiO2NPs對(duì)消化道組織和腸道微生物群造成的影響，以及其在腸道炎癥發(fā)生與發(fā)展中的促炎作用。目前，在食品安全領(lǐng)域仍缺少對(duì)TiO2NPs的安全性風(fēng)險(xiǎn)分析及相應(yīng)的控制手段，同時(shí)亦缺乏中長(zhǎng)期TiO2NPs膳食暴露的人群試驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，隨著人們健康意識(shí)的覺(jué)醒和科研技術(shù)的發(fā)展，中長(zhǎng)期TiO2NPs膳食暴露的潛在危害將會(huì)得到更多的關(guān)注，而有關(guān)TiO2NPs對(duì)人體各方面的生物學(xué)作用機(jī)制亦會(huì)得到進(jìn)一步的探索。