張桂鑫，劉 杰，趙 宇，王世浩，劉樹(shù)華，付 賽，龔春柱，王常德，萬(wàn) 雷，張 樂(lè)

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳平樂(lè)骨傷科醫(yī)院，廣東 深圳 518010；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；4. 山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030024)

骨質(zhì)疏松癥(OP)是與年齡相關(guān)，以骨量下降、骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性代謝性骨病[1]。OP作為老年人群的常見(jiàn)病及多發(fā)病，伴隨著我國(guó)人口老齡化程度的進(jìn)一步加深，其發(fā)病率逐年攀升，嚴(yán)重影響中老年人群的生活質(zhì)量，增加了民眾的醫(yī)療支出，加重了國(guó)家的財(cái)政負(fù)擔(dān)。目前OP的臨床治療效果仍不盡如人意，研究者多關(guān)注于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡機(jī)制[2]。近年來(lái)，隨著對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化研究的深入，許多學(xué)者逐漸認(rèn)識(shí)到BMSCs成脂向分化在OP發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，BMSCs的成骨/成脂向分化形成了一種類(lèi)似“拮抗”的關(guān)系[3]。相關(guān)研究顯示細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)信號(hào)通路活化在促進(jìn)骨形成中發(fā)揮著重要作用[4-9]，當(dāng)ERK5信號(hào)通路受到抑制時(shí),骨組織內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪細(xì)胞，骨小梁變得稀疏、甚至斷裂，高度重現(xiàn)了骨質(zhì)疏松患者的骨組織臨床形態(tài)學(xué)變化，這與骨質(zhì)疏松的“Fat-theory”理論符合[10]。而在OP發(fā)病、發(fā)展中ERK5信號(hào)通路介導(dǎo)下BMSCs各態(tài)分化改變特點(diǎn)與中醫(yī)陰陽(yáng)理論中的對(duì)立制約、互根互用、交感互藏等內(nèi)涵高度相似。因此，本課題組嘗試運(yùn)用中醫(yī)陰陽(yáng)自和理論來(lái)指導(dǎo)并探討ERK信號(hào)通路介導(dǎo)下BMSCs成骨/成脂向分化與OP之間的內(nèi)在聯(lián)系和規(guī)律，為OP的認(rèn)識(shí)和防治提供新的思路與方向。

1 陰陽(yáng)自和的淵源及內(nèi)涵

“陰陽(yáng)自和”首述于張仲景《傷寒論》第58條，但未進(jìn)行深入闡述[11-12]。后世醫(yī)家不斷對(duì)仲景“陰陽(yáng)自和”精義進(jìn)行了探討與發(fā)揮，由此形成了迥然不同的觀點(diǎn)?！夺t(yī)宗金鑒》言：“凡病……施治得宜,自然愈矣。即或治未得宜，雖不見(jiàn)愈,亦不致變諸壞逆……可不必施治,惟當(dāng)靜以俟之,診其陰陽(yáng)和,必能自愈也。”認(rèn)為陰陽(yáng)調(diào)和而疾病自愈，當(dāng)以靜處之，不妄施治，待其復(fù)趨平衡而邪去正安?？虑賱t認(rèn)為必須通過(guò)外在力量的引導(dǎo)而使陰陽(yáng)調(diào)和，指出“欲其陰陽(yáng)自和,必先調(diào)其陰陽(yáng)之所自……益血生津,陰陽(yáng)自和矣。”[13]程鐘齡宗《內(nèi)經(jīng)》“謹(jǐn)察陰陽(yáng)所在而調(diào)之，以平為期”，明確將“和陰陽(yáng)”列入中醫(yī)八法，其中“和法”即是指運(yùn)用調(diào)和臟腑、調(diào)治氣血、和解表里等方法，使機(jī)體陰陽(yáng)重歸平和而病邪自除。

早在《素問(wèn)》便有“陰陽(yáng)者，天地之要也，萬(wàn)物之綱紀(jì)……生殺之本始”的記載，其用“陰平陽(yáng)秘，精神乃治”簡(jiǎn)簡(jiǎn)八字便指出了陰陽(yáng)雙方的消長(zhǎng)平衡是維持人體正常生命、精神活動(dòng)的內(nèi)在基礎(chǔ)。“凡陰陽(yáng)之要……兩者不和，若春無(wú)秋，若冬無(wú)夏。因而和之，是謂圣度?！边M(jìn)一步闡釋了陰陽(yáng)自和是機(jī)體固有的調(diào)節(jié)自身陰陽(yáng)消長(zhǎng)、平衡從而不斷自我修復(fù)、自我完善的能力及過(guò)程；同時(shí)還指出治病當(dāng)以調(diào)和陰陽(yáng)為綱，“因而和之”，運(yùn)用調(diào)和氣血等法對(duì)機(jī)體陰陽(yáng)消長(zhǎng)進(jìn)行引導(dǎo)趨化，從而達(dá)到陰陽(yáng)平和、氣血平治的目的?？偟亩裕庩?yáng)自和的內(nèi)涵主要包含三個(gè)方面：其一，陰陽(yáng)失衡是人體一切疾病最基本的病機(jī)，調(diào)和陰陽(yáng)是治療一切疾病的總則。其二，陰陽(yáng)自和是人體自體的調(diào)控機(jī)制和自我調(diào)節(jié)使陰陽(yáng)重新趨于平衡的能力，是基于陰陽(yáng)雙方對(duì)立制約、互根互用、消長(zhǎng)轉(zhuǎn)化等交互作用自發(fā)形成的，是陰陽(yáng)相互關(guān)系的根本屬性之一[14]。其三，臨證治療時(shí)應(yīng)善于辨識(shí)和利用人體陰陽(yáng)自和的能力與趨勢(shì)，強(qiáng)調(diào)因勢(shì)利導(dǎo)，選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼椒?，調(diào)和陰陽(yáng)，使機(jī)體恢復(fù)陰陽(yáng)平和的狀態(tài)。

2 從腎陰陽(yáng)自和論治OP

2.1OP本之于腎 中醫(yī)認(rèn)為，OP歸屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”的范疇。根據(jù)OP的發(fā)病特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，歷代醫(yī)家總結(jié)其發(fā)病發(fā)生與腎的陰陽(yáng)失衡直接相關(guān)，提挈出了OP發(fā)病中腎精虧虛、骨枯髓減為本，瘀血痹阻、骨絡(luò)失榮為標(biāo)的病機(jī)關(guān)鍵。明·張景岳明確提出了“腎痿者，骨痿也”的論點(diǎn)，這一論斷早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》便已有體現(xiàn)?！端貑?wèn)·痿論》已有“腎主身之骨髓……骨枯而髓減……發(fā)為骨痿”的記載，指出OP的發(fā)生與腎中精氣不足的直接相關(guān)性?！夺t(yī)經(jīng)精義》對(duì)“腎主骨”理論進(jìn)一步注解：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也。健者腎精所生，精足則髓充，髓充者則骨強(qiáng)。”闡明了腎-精-髓-骨生理調(diào)節(jié)軸的調(diào)控機(jī)制?！赌嬲{(diào)論篇》則開(kāi)“骨痿自腎陰陽(yáng)論治”之先河，認(rèn)為“腎不生，則髓不能滿；腎氣熱，則腰脊不舉……水不勝火，骨枯而髓虛，足不任身，發(fā)為骨痿”，明確腎之水火安濟(jì)(陰陽(yáng)平和)與骨痿發(fā)生的直接關(guān)系，與“腎主骨”理論同為后世醫(yī)家們臨證論治奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。近年來(lái)，對(duì)OP的中醫(yī)臨證分型研究進(jìn)一步深入。萬(wàn)雷等[15]一項(xiàng)臨床調(diào)查(廣東省373名OP患者)顯示OP患者以脾腎陽(yáng)虛及肝腎陰虛型最為常見(jiàn)(脾腎陽(yáng)虛130例占34.85%，肝腎陰虛161例占43.16%)。中國(guó)老年學(xué)和老年醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)綜合了多中心研究發(fā)布了中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(shí)[16]，將原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥分為腎陽(yáng)虛、肝腎陰虛、脾胃虛弱、脾腎陽(yáng)虛、腎虛血瘀和血瘀氣滯六個(gè)主證。這些研究均強(qiáng)調(diào)了腎陰陽(yáng)失衡在OP發(fā)病和臨床辨證論治中的重要地位。

2.2陰陽(yáng)自和與BMSCs成骨/成脂分化 OP的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前較為統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)是成骨/破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成/骨吸收的平衡遭到破壞，而“RANKL-RANK-OPG”傳遞調(diào)節(jié)軸是其調(diào)節(jié)基本機(jī)制[17]。這一理論和調(diào)控方式本質(zhì)上與中醫(yī)陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)和臟腑協(xié)同理論的內(nèi)涵是相一致的，然而OP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在這一理論指導(dǎo)下運(yùn)用單純的靶點(diǎn)治療技術(shù)對(duì)成骨或破骨細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)節(jié)干預(yù)并不能滿足患者的健康醫(yī)療需求。近期研究發(fā)現(xiàn)OP患者BMSCs 的成脂分化能力明顯強(qiáng)于成骨分化能力, 這可能是由于患者的BMSCs成脂分化和成骨分化的平衡被打破所致[10]。然而B(niǎo)MSCs的成骨分化和成脂分化過(guò)程復(fù)雜，多種成脂和成骨形成因子參與調(diào)節(jié)[18-19]，其中2型過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ2)可明顯促進(jìn)成脂分化[20]。而Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX-2)作為成骨相關(guān)基因表達(dá)中核酸和相關(guān)調(diào)節(jié)因子的“支架蛋白”，是間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化和骨形成所必需的存在，其高表達(dá)表明BMSCs將向成骨方向分化[21]。

《陰陽(yáng)應(yīng)象大論》言“陽(yáng)化氣，陰成形”、“陰?kù)o陽(yáng)躁，陽(yáng)生陰長(zhǎng)，陽(yáng)殺陰藏”。中醫(yī)陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)根據(jù)陰陽(yáng)的生理功能和特性，認(rèn)為具有推動(dòng)、溫煦、興奮作用的物質(zhì)和功能歸屬于陽(yáng)，具有凝聚、涼潤(rùn)、抑制等作用的物質(zhì)則歸屬于陰。在既往關(guān)于骨重建基本單元陰陽(yáng)屬性的認(rèn)識(shí)中，將負(fù)責(zé)骨基質(zhì)合成、分泌礦化的成骨歸屬于陰，而負(fù)責(zé)骨吸收、降解的破骨細(xì)胞劃歸于陰[22-23]。馬勇等基于《內(nèi)經(jīng)》陰陽(yáng)變易思想，進(jìn)一步提出了骨病治療當(dāng)以“陰陽(yáng)為綱,氣血為本,陽(yáng)氣為先”的原則[24-25]。他們認(rèn)為人的正常生命活動(dòng)既依賴于骨組織及精血、津液等“陰凝之形”，亦需要骨髓脂肪組織等屬“陽(yáng)”之物的調(diào)節(jié)和氣化。而研究發(fā)現(xiàn)，骨髓微環(huán)境的細(xì)胞增殖變化受激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、藥物等影響，骨髓中骨含量與脂肪組織含量之間呈現(xiàn)出明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。隨著對(duì)這一表型研究的深入，發(fā)現(xiàn)BMSCs的成骨/成脂分化之間存在的對(duì)立消長(zhǎng)、動(dòng)態(tài)平衡的特點(diǎn)同樣切合中醫(yī)“陰陽(yáng)自和”理論的深刻內(nèi)涵。“萬(wàn)物負(fù)陰而抱陽(yáng)，沖氣以為和”、“陰陽(yáng)和合而萬(wàn)物生”，陰陽(yáng)的對(duì)立消長(zhǎng)平衡是人體，乃至天地萬(wàn)事萬(wàn)物的內(nèi)在運(yùn)動(dòng)規(guī)律。在BMSCs的分化代謝中這種內(nèi)在規(guī)律則體現(xiàn)為成骨和成脂之間的制約平衡，使得機(jī)體骨代謝得以長(zhǎng)期處于不斷自我修復(fù)、更新、完善、調(diào)和的穩(wěn)態(tài)，從而達(dá)到“陰陽(yáng)均平，以充其形”的生理和諧[26]。

3 ERK5與BMSCs成骨/成脂分化

ERK5是目前研究較少的通路，其激活與細(xì)胞的增殖、分化和遷移密切相關(guān)。ERK5信號(hào)通路的激活包括3級(jí)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，依次通過(guò)MAPKKKs激活MEKK2和MEKK3，然后磷酸化MEK5(Ser311/Thr315)，激活的MEK5雙磷酸化ERK5(Thr218/Tyr220)。磷酸化的ERK5可以通過(guò)改變蛋白構(gòu)象由折疊構(gòu)象變?yōu)闄M行構(gòu)象，從而破壞核輸出信號(hào)(NES)，促進(jìn)ERK5的核聚集(或者稱為核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象)，進(jìn)入胞核的ERK5可以作用其下游分子，產(chǎn)生眾多生理學(xué)效應(yīng)[27-28]。

3.1ERK5與成骨 早在2012年Li等[8]在應(yīng)用流體剪應(yīng)力(FSS)誘導(dǎo)MC3T3E1前成骨細(xì)胞ERK5磷酸化時(shí)，F(xiàn)SS會(huì)以強(qiáng)度和時(shí)間依賴的方式引起ERK5的激活，同時(shí)誘導(dǎo)磷酸化的ERK5轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。他們進(jìn)一步的研究則揭示了ERK5介導(dǎo)FSS誘導(dǎo)的AP-1和cyclinD1表達(dá)，抑制p-16信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，表明了ERK5在成骨細(xì)胞增殖過(guò)程中扮演者重要的角色[9]。Bin等[7]在其研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了FSS能夠通過(guò)ERK5信號(hào)通路阻斷TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細(xì)胞凋亡。ERK5通過(guò)抑制成骨細(xì)胞中TNF-α介導(dǎo)的信號(hào)事件，包括增加Bad磷酸化，抑制caspase-3活性，而B(niǎo)ad是ERK5的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，進(jìn)一步表明ERK5信號(hào)通路在FSS介導(dǎo)的成骨細(xì)胞抗凋亡中起著重要作用。Bin等[5]發(fā)現(xiàn) FSS通過(guò)激活ERK5-AKT-FOXO3a信號(hào)通路，降低FasL和Bim的表達(dá)，抑制caspase-3的激活，從而起到保護(hù)成骨細(xì)胞凋亡的作用。楊信信[29]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)ERK5基因沉默后證實(shí)ERK5信號(hào)通路能夠下調(diào)RUNX-2、堿性磷酸酶(ALP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)表達(dá)而抑制BMSCs成骨分化。

3.2ERK5與成脂 Tontonoz等[30]研究發(fā)現(xiàn)PPARγ的激活可通過(guò)下調(diào)RUNX-2 表達(dá)和干擾RUNX-2的反式激活能力來(lái)抑制骨鈣蛋白的表達(dá)，提示BMSCs成骨分化和成脂分化間可能存在此消彼長(zhǎng)的平衡關(guān)系。楊信信[29]發(fā)現(xiàn)ERK5信號(hào)通路可通過(guò)上調(diào)PPARγ、CCAAT-增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)和脂肪酸結(jié)合蛋白4(ap2)表達(dá)而抑制小鼠BMSCs的成脂分化；當(dāng)成脂分化誘導(dǎo)足夠時(shí)長(zhǎng)后，觀察到了脂滴的明顯增多、增大和增圓及染色的顯著加深。上述研究提示 ERK5 信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控BMSCs成脂和成骨分化的關(guān)鍵基因，維持BMSCs成脂和成骨分化的平衡，進(jìn)而影響OP的發(fā)生發(fā)展。

3.3ERK5與陰陽(yáng)自和 從微觀角度而言，人體的細(xì)胞、組織、DNA 等無(wú)不蘊(yùn)含著陰陽(yáng)對(duì)立統(tǒng)一關(guān)系[31]。OP患者BMSCs中所存在的成骨/成脂向動(dòng)態(tài)分化平衡、ERK5介導(dǎo)下BMSCs的成骨/成脂雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制同樣包含著中醫(yī)“陰陽(yáng)自和”理論的深刻內(nèi)涵?！瓣?yáng)勝則陰病”，當(dāng)ERK5被沉默，PPARγ、C/EBPα和ap2等成脂分化標(biāo)志基因的高度表達(dá)導(dǎo)致BMSCs成脂向分化的活躍，同時(shí)通過(guò)抑制RUNX-2、ALP和BMP-2的表達(dá)導(dǎo)致成骨作用減弱，并通過(guò)多通路激活caspase-3活性導(dǎo)致成骨細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。反之，“陰勝則陽(yáng)病”，當(dāng)ERK5信號(hào)激活，BMSCs成脂向分化受到抑制，RUNX-2、ALP和BMP-2高度表達(dá)，而成骨向分化顯著增強(qiáng)，同時(shí)成骨細(xì)胞增殖活躍，凋亡減少，改善OP患者的骨代謝失衡，使機(jī)體精充髓足，筋骨隆盛。

4 小 結(jié)

從最初發(fā)現(xiàn)成骨/破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與骨吸收有機(jī)統(tǒng)一，到“RANKL-RANK-OPG”傳遞軸的闡明，再到BMSCs成骨/成脂分化調(diào)節(jié)，OP的微觀分子調(diào)控與中醫(yī)陰陽(yáng)調(diào)和及多臟腑協(xié)同理論不謀而合。而B(niǎo)MSCs的成骨/成脂動(dòng)態(tài)平衡，為我們提供了OP防治不同于以往的思路?；谀I陰陽(yáng)自和理論，對(duì)ERK5介導(dǎo)調(diào)節(jié)BMSCs的成骨/成脂分化穩(wěn)態(tài)平衡深入研究，更為我們進(jìn)一步闡明OP發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機(jī)制提供了新的啟發(fā)和方向。

OP 的病機(jī)復(fù)雜多樣，虛中夾實(shí)，實(shí)中含虛，機(jī)體陰陽(yáng)動(dòng)態(tài)制約平衡。在這一過(guò)程，中醫(yī)及中藥復(fù)方顯示出其多靶點(diǎn)、多途徑和多角度的整體治療特點(diǎn)，展現(xiàn)了令人可喜的療效。多項(xiàng)臨床研究表明左歸丸等補(bǔ)腎中藥與復(fù)方能夠有效緩解OP患者的疼痛癥狀，并改善相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)，對(duì)OP患者的骨代謝平衡及骨密度的改善具有良好的療效[32]。而目前骨疏康顆粒、金天格膠囊等中藥復(fù)方合劑亦逐漸成為中西醫(yī)結(jié)合防治OP的主要用藥選擇。

針對(duì)OP腎精虧虛、骨枯髓減為本，瘀血痹阻、骨絡(luò)失榮為標(biāo)的病因病機(jī)，著眼于OP患者病后“多虛多瘀”的轉(zhuǎn)歸發(fā)展特點(diǎn)，我們課題組創(chuàng)立了補(bǔ)腎健脾活血方應(yīng)用于OP患者的治療。內(nèi)經(jīng)言：“年六十，陰痿，氣大衰，九竅不利，下虛上實(shí)?！毖a(bǔ)腎健脾活血方強(qiáng)調(diào)腎為先天之本，以淫羊藿、肉蓯蓉、熟地等益精填髓之品調(diào)補(bǔ)腎之陰陽(yáng)，使陰陽(yáng)均而氣血平；同時(shí)重視“脾為后天之本，氣血生化之源”，運(yùn)用黃芪、白芍補(bǔ)氣運(yùn)脾諸藥以顧護(hù)中焦，以中焦運(yùn)氣生血，使先天之陽(yáng)得生而后天之陽(yáng)得立?！皻鉃檠畮洠獮闅庵浮?，針對(duì)OP常多夾瘀的轉(zhuǎn)歸特點(diǎn)，取補(bǔ)血活血行血之當(dāng)歸、丹參等，達(dá)到陰陽(yáng)并調(diào)，氣血同治的目的。早期的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床干預(yù)研究已明確補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)OP具有多靶點(diǎn)調(diào)控作用[33-35]，然而目前對(duì)于其對(duì)成脂肪分化干預(yù)及作用機(jī)制我們尚未能深入研究。當(dāng)代醫(yī)學(xué)生物信息學(xué)高速發(fā)展，基因工程、表觀遺傳學(xué)、DNA甲基化飛速發(fā)展，BMSCs成骨/成脂動(dòng)態(tài)分化平衡為我們提供了新的啟發(fā)，而ERK5信號(hào)通路在其中的重要作用及補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)此的新作用靶點(diǎn)值得我們進(jìn)一步深入挖掘。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。