陽(yáng)新春 楊財(cái)容 祁偉亮 陳 佳 劉松青

（成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 611130）

雞腿菇Coprinus comatus是一種食藥兩用菌，口感細(xì)嫩，風(fēng)味獨(dú)特，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖血壓、改善心率、抑制腫瘤、防癌及抗癌等功效[1?3]。近幾年來(lái)，栽培雞腿菇也是助力鞏固脫貧成果的主要舉措之一，雞腿菇生產(chǎn)發(fā)展較快。菌種是食用菌生產(chǎn)和研究的重要材料，而菌種在繁育過(guò)程中極易發(fā)生變異[4?6]，科學(xué)、高效地保藏好菌種是高產(chǎn)的前提，所以菌種保藏越來(lái)越被重視[7?9]。雞腿菇菌種保藏方法眾多，各具優(yōu)缺點(diǎn)，但目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)羊肚菌、香菇、草菇、真姬菇等菌種的最適保藏方法做了較多研究，而對(duì)于雞腿菇的菌種保藏方法研究相對(duì)缺少[10?12]。因此，筆者比較幾種常見(jiàn)的雞腿菇菌種保藏方法的保藏效果，以期找出相對(duì)便捷、價(jià)廉、高效的雞腿菇菌種保藏方法，為雞腿菇菌種保藏提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

供試菌株為雞腿菇特大9201，購(gòu)于京山市成林菌業(yè)店。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15~20 g，蒸餾水1 000 mL。主要試劑：液體石蠟油 、NaCl 溶 液 、瓊 脂 、PEG6000、PEG10000、PEG20000、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將供試雞腿菇菌株接入PDA 斜面培養(yǎng)基中活化。當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿試管后，將其轉(zhuǎn)移到含有PDA 直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，于25 ℃培養(yǎng)，菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿一半后，取部分菌絲作為原始菌種，檢測(cè)菌絲生長(zhǎng)速度、脫氫酶活性，部分作為初始菌種，供保藏試驗(yàn)。在無(wú)菌環(huán)境下，將菌種分成0.9 cm塊備用。

1.2.2 保藏試驗(yàn)

1.2.2.1 斜面低溫保藏

PDA 培養(yǎng)基滅菌（121 ℃，30 min）后，裝入試管擺斜面后放入25 ℃培養(yǎng)箱，24 h 檢查無(wú)菌后備用。將1.2.1 菌塊接于斜面試管內(nèi)，并于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3 次。培養(yǎng)5 d 后，觀察菌落形態(tài)等基本特征，判斷是否被雜菌污染以及該培養(yǎng)物是否與原菌種一致。檢查確認(rèn)無(wú)誤后，置于4 ℃冰箱中保藏60 d。

1.2.2.2 液體石蠟油保藏

液體石蠟油（石蠟油）滅菌（121 ℃，30 min）后取出放在60 ℃干燥箱中烘干水分，直至石蠟油澄清備用。取1.2.1 菌種塊3~4 塊于5 mL 滅菌凍存管（實(shí)驗(yàn)室保存菌種專(zhuān)用）中，再加入3~4 mL 石蠟油后置于室溫保存60 d。重復(fù)3次。

1.2.2.3 水溶液保藏

水溶液保藏采用無(wú)菌水、NaCl 溶液、聚乙二醇溶液保藏。參考朱華玲等[13]保藏方法，設(shè)置NaCl 溶液的體積分?jǐn)?shù)梯度為0.3%，0.6%，0.9%，1.2%；設(shè)置體積分?jǐn)?shù)為0.1%的聚乙二醇溶液的分子量分別為PEG6000，PEG10000，PEG20000。取 1.2.1 菌種 3~4塊于5 mL 滅菌凍存管中，再分別加入3~4 mL 無(wú)菌水、NaCl 溶液和聚乙二醇溶液后放入4 ℃冰箱保藏60 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 菌絲保藏效果考察

1.3.1 菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定

斜面低溫保藏與水溶液保藏均需在保藏60 d后取出試管，于25 ℃下復(fù)活培養(yǎng)3 d；液體石蠟保藏60 d 后取出試管，轉(zhuǎn)接菌塊于PDA 平皿上培養(yǎng)3 d。之后各自取9 mm 菌塊于PDA 平皿上，培養(yǎng)7 d 后測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。

式中，菌落直徑D1為0.9 cm。

1.3.2 菌絲脫氫酶活性測(cè)定

脫氫酶活性可以反映微生物對(duì)有機(jī)物的代謝能力，從而反映菌絲活力。雞腿菇菌絲脫氫酶活性的測(cè)定按照熊川等[14]方法，用分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光值OD，二甲基亞砜（DMSO）作空白對(duì)照。OD 值越大，則酶活性越高，菌株保藏效果越好。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 25.0軟件對(duì)菌絲平均生長(zhǎng)速度、脫氫酶活性進(jìn)行多重比較及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三類(lèi)保藏方法保藏效果

由表1 和圖1 可知，不同保藏方法保藏后的雞腿菇菌絲的生長(zhǎng)速度（平均生長(zhǎng)速度，下同）、脫氫酶活性以及菌落形態(tài)有差異。與雞腿菇原始種相比，聚乙二醇溶液保藏的雞腿菇菌種菌絲生長(zhǎng)速度加快，其他保藏方法的雞腿菇菌種菌絲生長(zhǎng)速度均下降；采用0.6%、0.9%、1.2% NaCl 溶液及斜面保藏的雞腿菇菌種菌絲脫氫酶活性下降，其他保藏方法的脫氫酶活性均上升。

圖1 試驗(yàn)保藏方法的保藏效果菌種對(duì)比

表1 各種保藏方法的保藏雞腿菇菌種效果

考察保藏后的雞腿菇菌種菌絲生長(zhǎng)各個(gè)指標(biāo)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，大部分水溶液保藏的雞腿菇菌種菌絲生長(zhǎng)各指標(biāo)均較好。菌絲生長(zhǎng)速度，大多數(shù)的水溶液保藏法>斜面低溫保藏法>石蠟油保藏法；斜面低溫保藏法的菌絲生長(zhǎng)速度與無(wú)菌水、1.2%NaCl 保藏法無(wú)顯著差異，但顯著低于0.1% PEG10000、0.1%PEG20000、0.1% PEG6000、0.9% NaCl 保藏法；而石蠟油保藏法保藏后的菌種菌絲生長(zhǎng)速度僅與0.6%NaCl 保藏法無(wú)顯著差異，顯著低于其他7 種水溶液保藏法保藏的菌種。

雞腿菇菌種菌絲脫氫酶活性，大多數(shù)的水溶液保藏法>石蠟油保藏法>斜面低溫保藏法，斜面低溫保藏法的菌絲脫氫酶活性與0.6%NaCl、0.9%NaCl、1.2% NaCl 保藏法無(wú)顯著差異，但顯著低于0.1%PEG20000、0.1%PEG10000、無(wú)菌水、0.1%PEG6000、0.3% NaCl 水溶液保藏法；石蠟油保藏法僅與0.3%NaCl、0.1% PEG6000 水溶液保藏法無(wú)顯著差異，但顯著低于無(wú)菌水、0.1% PEG10000、0.1% PEG20000水溶液保藏法。斜面低溫保藏的菌種菌絲生長(zhǎng)速度高于石蠟油保藏法，但石蠟油保藏的菌種菌絲脫氫酶活性卻高于斜面低溫保藏法，甚至高于原始種。

雞腿菇菌種菌絲長(zhǎng)勢(shì)，大多數(shù)的水溶液保藏法>斜面低溫保藏法>石蠟油保藏法。雞腿菇菌種綜合菌絲生長(zhǎng)速度、脫氫酶活性、長(zhǎng)勢(shì)，三大類(lèi)保藏方法的保藏效果為大多數(shù)的水溶液保藏法優(yōu)于斜面低溫保藏法，石蠟油保藏法。

2.2 水溶液保藏法保藏效果

由圖2 可知，不同水溶液保藏方法對(duì)雞腿菇菌種的保藏效果不同。不同水溶液保藏后雞腿菇菌種菌絲生長(zhǎng)速度次序：聚乙二醇溶液>0.9%NaCl 溶液>1.2% NaCl 溶液>無(wú)菌水>0.3%NaCl 溶液>0.6%NaCl溶液；菌絲脫氫酶活性次序：0.1%PEG20000溶液>0.1%PEG10000 溶液>無(wú)菌水>0.1%PEG6000 溶液>NaCl溶液。

圖2 水溶液處理組對(duì)雞腿菇菌種保藏效果對(duì)比

由表1可知，無(wú)菌水、NaCl溶液保藏的雞腿菇菌種菌絲生長(zhǎng)速度均顯著慢于0.1%PEG10000、0.1%PEG20000 保藏法，但無(wú)菌水保藏的菌絲脫氫酶活性則與0.1%PEG10000、0.1%PEG20000 無(wú)顯著差異，因此無(wú)菌水保藏效果比NaCl溶液組保藏效果要好。

綜上，聚乙二醇溶液的保藏效果最好，其次是無(wú)菌水，NaCl溶液保藏效果最差。

NaCl 溶液處理組中，保藏效果最好的是0.9%NaCl 溶液；不同分子量的0.1%聚乙二醇溶液處理組，0.1% PEG20000 的保藏效果最好。比較無(wú)菌水、0.9% NaCl 溶液、0.1% PEG20000 溶液這三種保藏法的效果可知（圖3）：保藏效果依次為0.1%PEG20000，無(wú)菌水，0.9%NaCl。

圖3 不同水溶液中保藏效果最好對(duì)比

2.3 水溶液最優(yōu)保藏法（0.1%PEG20000）與斜面低溫、石蠟油保藏法效果比較

由圖4可知，0.1%PEG20000保藏的菌種菌絲生長(zhǎng)速度、脫氫酶活性均高于原始種；石蠟油保藏的菌種菌絲生長(zhǎng)速度與原始種相比明顯慢，但脫氫酶活性高；斜面低溫保藏的菌種菌絲生長(zhǎng)速度和脫氫酶活性均較原始種低。由表1可知，0.1%PEG20000保藏的雞腿菇菌種菌絲長(zhǎng)勢(shì)最旺盛，而石蠟油保藏兩個(gè)月之后的菌種接種到培養(yǎng)基后，培養(yǎng)過(guò)程中極易長(zhǎng)出霉菌且菌絲生長(zhǎng)緩慢，這是菌種退化的表現(xiàn)。由此可見(jiàn)，就短期保藏效果，0.1%PEG20000保藏法優(yōu)于斜面低溫保藏法、石蠟油保藏法。

圖4 水溶液最優(yōu)保藏法（0.1%PEG20000）與其他兩大類(lèi)保藏效果比較

3 小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，三大類(lèi)保藏方法中保藏效果最好的是水溶液保藏法，其中保藏效果最佳的是0.1%PEG20000 水溶液，其次是斜面低溫保藏法，保藏效果最差的是石蠟油保藏法。聚乙二醇溶液保藏效果最好，這可能是因?yàn)榫垡叶既芤簩?duì)菌絲細(xì)胞具有保護(hù)作用[13]。石蠟油保藏效果差可能因菌絲上攜帶少量石蠟油抑制其生長(zhǎng)，不適合短期保藏。

研究篩選出最適雞腿菇菌種短期保藏的方法，可為雞腿菇菌種提供成本廉價(jià)、經(jīng)濟(jì)高效、操作簡(jiǎn)便的短期保藏方法參考。