張瑞芝，姜生偉，吳 昊，陳俏麗, 4，李丹蕾, 3, 4，王 峰, 3, 4*

(1.黑龍江省外來林木病蟲害監(jiān)測與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.遼寧省林業(yè)和草原局有害生物防治檢疫工作站，遼寧 沈陽 110001;3.遼寧省危險(xiǎn)性林業(yè)有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽工學(xué)院，遼寧 沈陽 113122;4.森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

近半個(gè)世紀(jì)以來，松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)已在我國19個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)728個(gè)縣級行政區(qū)發(fā)生，嚴(yán)重危害我國松林[1-3]。近年來，松材線蟲在我國的分布線呈持續(xù)快速北移的態(tài)勢，已突破年均溫10 ℃線，擴(kuò)張至遼寧丹東、撫順和吉林延邊朝鮮族自治州汪清縣等地[1，4-5]。松材線蟲抗逆態(tài)幼蟲(third-stage dispersal juvenile，DJ3，或稱LⅢ、DL3)可以在低溫等不利條件下生存，在松材線蟲向東北等低溫地區(qū)擴(kuò)張過程中起重要作用[6]。

在模式線蟲秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)發(fā)育過程中，Insulin/IGF(insulin-like growth facter)路徑和ILS(insulin-like signal)路徑是秀麗線蟲形成抗逆態(tài)幼蟲的關(guān)鍵[7-8]，HSF-1(heat shock transcription factor 1,熱激轉(zhuǎn)錄因子)在Insulin/IGF路徑和ILS過程中起重要作用。Insulin/IGF路徑中，DAF(dauer formation)-28經(jīng)由HSF-1將熱激信號傳遞到DAF-16[9-12]。HSF-1在調(diào)節(jié)線蟲壽命[8]以及線蟲生長發(fā)育過程[13]中也起著重要作用。當(dāng)hsf-1被RNA干擾后，會(huì)使溫度敏感的秀麗線蟲幼蟲滯育，主要發(fā)生在2齡幼蟲(J2)向3齡幼蟲(J3)轉(zhuǎn)變的過程中[13]。HSF-1還影響ILS對饑餓、熱激或激素信號的調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)抗逆態(tài)幼蟲形成[8]。

在對松材線蟲的研究過程中發(fā)現(xiàn)，溫度是影響松材線蟲分布范圍的重要環(huán)境因素[14]。溫度刺激可誘導(dǎo)松材線蟲熱激轉(zhuǎn)錄因子基因Bx-hsf-1在多數(shù)體細(xì)胞，尤其是神經(jīng)元、體壁肌肉細(xì)胞和皮下細(xì)胞中高表達(dá)[15]。生物信息學(xué)分析表明Bx-HSF-1具有特異DNA序列結(jié)合的分子功能，Bx-HSF-1被預(yù)測為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[15]。鑒于秀麗線蟲hsf-1直接或間接地與ddl-1/2、aap-1、pdk-1及多個(gè)daf基因發(fā)生調(diào)控/互作關(guān)系，因此有必要鑒定Bx-HSF-1與其靶基因的調(diào)控關(guān)系。為進(jìn)一步確定Bx-HSF-1的功能，本研究鑒定了Bx-HSF-1的轉(zhuǎn)錄激活活性，并通過基因沉默和轉(zhuǎn)錄組測序篩選出靶基因，分析在7個(gè)蟲態(tài)(齡)中這幾個(gè)靶基因的表達(dá)量變化，為進(jìn)一步確定Bx-HSF-1在松材線蟲各蟲態(tài)(齡)發(fā)育過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 線蟲

試驗(yàn)所用松材線蟲Nxy61株系由中國林業(yè)科學(xué)研究院提供。松材線蟲在灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌苔上25 ℃避光培養(yǎng)，擴(kuò)繁備用。

1.2 pGBKT7-Bx-hsf-1重組載體構(gòu)建

參照Bx-hsf-1CDS(coding sequence)序列，合成1對帶有SalI、XmaI酶切位點(diǎn)引物，引物序列為：5′-ACTGTCGGTCCCCCC GGGGGGAAT GTC GTA TCT GGA TGG AAA AGA TG-3′，5′-CCATGGACACGCGTC GACGTC GGC CAT AGC GGC CGC GGA ACT AGT AAG GTT GAG TTT CAT ATG TG-3′(下劃線為酶切位點(diǎn)，斜體部分為保護(hù)堿基)。以松材線蟲cDNA為模板，使用該特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶正確后用純化試劑盒純化基因PCR產(chǎn)物，-20 ℃保存。

分別對pGBKT7載體和Bx-hsf-1基因PCR擴(kuò)增純化產(chǎn)物進(jìn)行XmaI和SalI-HF限制性內(nèi)切酶雙酶切(37 ℃，3 h)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶正確后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化。利用T4連接酶連接pGBKT7載體和Bx-hsf-1基因的雙酶切產(chǎn)物，4 ℃過夜。將連接產(chǎn)物通過熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡拉霉素(Kana mycin(50 mg/L)的LB培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取陽性單克隆進(jìn)行PCR檢測并測序。根據(jù)測序結(jié)果選取正確核苷酸序列的單克隆菌液進(jìn)行37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒保存于-20 ℃，將其命名為pGBKT7-Bx-hsf-1。

1.3 Bx-HSF-1轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證

pGBKT7-Bx-hsf-1和陰性對照pGBKT7分別轉(zhuǎn)入酵母(Saccharomycescerevisiae)AH109感受態(tài)細(xì)胞。將酵母轉(zhuǎn)化菌株分別滴在不同缺陷型固體培養(yǎng)基(SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade和SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal)上篩選，并以3個(gè)不同體積濃度(V菌液∶V生理鹽水為1∶1、1∶10和1∶100)滴在SD/-Trp/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上，放置在30 ℃下培養(yǎng)2 d拍照。

1.4 Bx-hsf-1 RNA干擾

分別用對Bx-hsf-1基因RNA干擾的羧基熒光素標(biāo)記siRNA(5′-GCA AUA CUU CAA GCA UAA UAA CUU GAA CAG[dT][dT]-3′)、對照Bx-Actin基因RNA干擾的菁染料標(biāo)記siRNA(5′-GCC UUC UUU CUU GGG UAU GGA AUC UGC CG[dT][dT]-3′)以及無靶向siRNA(5′-AGG AGC UGU UCA CCG GGG UGG UGC CCA UCC U[dT][dT]3′)進(jìn)行RNA干擾試驗(yàn)。用DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過的ddH2O分別稀釋相應(yīng)的siRNA至2 mg/mL(含10 mmol章魚胺)后浸泡線蟲12 h[16]后熒光顯微鏡拍照記錄，RT-qPCR鑒定RNA干擾效果(引物對為Bx-hsf-1-F，GGG GAG GAT TTG GAG ATG ATG G;Bx-hsf-1-R,AAG AGA TGC CCT TCC TTG GC)。使用兩步法PCR：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)反應(yīng)循環(huán)，60～95 ℃測定溶解曲線。以松材線蟲Bx-Actin為內(nèi)參基因(positive internal control)。相對定量法計(jì)算3次重復(fù)試驗(yàn)初始模板量比值，兩配對樣本t檢驗(yàn)差異顯著性。

1.5 RNAi處理線蟲差異表達(dá)基因鑒定

分別提取Bx-hsf-1RNAi處理組和對照組(control check，CK)線蟲總RNA，經(jīng)Bioanalyzer 2100(Agilent，CA，USA)檢測合格后送深圳華大公司構(gòu)建cDNA文庫并采用Illumina Hiseq平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。深圳華大公司完成序列拼接和表達(dá)量均一化FPKM(fragments per kilobase million)，F(xiàn)DR(false discovery rate)校正(adjustedP-value,公式中記為Padjusted)。根據(jù)FPKM，分別統(tǒng)計(jì)出RNAi組和CK組松材線蟲各基因表達(dá)量變化的log2倍數(shù)值，公式中記為log2(NRNAi/NCK)，并篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEG)[log2(NRNAi/NCK)<-0.5(Padjusted<0.001)][17]。根據(jù)DEG編碼蛋白質(zhì)的分子功能，鑒定這些基因之間的調(diào)控路徑。

用貝爾曼漏斗法分離收集松材線蟲，取J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雄成蟲(male)和雌成蟲(female)，分別提取J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雄成蟲和雌成蟲的總RNA[18-19]。選用GoTaq 2-Step RT-qPCR System Kit，應(yīng)用Stratagene Mx3000P進(jìn)行RT-qPCR鑒定6條基因表達(dá)量，Bx-daf-21(Bx-daf-21-F.AAA GTT GGC GAG ATC CCC TG;Bx-daf-21-R.CGG CTT CAT CAA GGT CCA GA)、Bx-hsp-1(Bx-hsp-1-F.TGG CAC CAC ATA CTC CTG TG;Bx-hsp-1-R.GGG TTC ATG GCG ACC TGA TT)、Bx-hsp-70(Bx-hsp-70-F.ATC ATT GCC AAC GAC CAG GG;Bx-hsp-70-R.ATC ATT GCC AAC GAC CAG GG)、Bx-sti(Bx-sti-F.CGG AGC TCA CCA GCA CTA TG;Bx-sti-R.CGG CAC GAT GTT CTC TAC CA)、Bx-cdc(Bx-cdc-F.GAC ACC AAG CTC GTC TGG AA;Bx-cdc-R.TCC TTT TCA TCC TGG GTG TTC T)和Bx-hsf-1(引物對Bx-hsf-1-F和Bx-hsf-1-R)在J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雌成蟲和雄成蟲共7種蟲態(tài)(齡)中的表達(dá)量。使用兩步法PCR，內(nèi)參及PCR條件如1.4所述。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bx-HSF-1轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證

利用XmaI和SalI-HF限制性內(nèi)切酶雙酶切pGBKT7和Bx-hsf-1基因克隆純化產(chǎn)物，得到具有黏性末端的線性pGBKT7載體(圖1A-1)和Bx-hsf-1基因片段(圖1A-2)。提取連接轉(zhuǎn)化后測序成功的重組質(zhì)粒DNA(圖1A-3)，再將該質(zhì)粒用XmaI和SalI-HF限制性內(nèi)切酶雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳后，膠圖中有雙條帶，一條帶位于pGBKT7載體位置，另一條帶位于Bx-hsf-1基因位置(圖1A-4)，說明pGBKT7-Bx-hsf-1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

轉(zhuǎn)有pGBKT7空載體和pGBKT7-Bx-hsf-1重組質(zhì)粒的酵母菌株均能在SD/-Trp單缺培養(yǎng)基上生長(圖1B)，表明pGBKT7空載體和pGBKT7-Bx-hsf-1重組質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)入酵母中。轉(zhuǎn)有pGBKT7-Bx-hsf-1重組質(zhì)粒的酵母菌株在SD/-Trp/-His/-Ade三缺培養(yǎng)基上能夠正常生長，而對照組轉(zhuǎn)有pGBKT7空載體的酵母菌株在三缺培養(yǎng)基上不能生長(圖1B)，表明Bx-HSF-1能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá)；pGBKT7-Bx-hsf-1重組質(zhì)粒的酵母菌株在SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基上顯藍(lán)色(圖1B)，表明在酵母體內(nèi)Bx-HSF-1能夠激活mel1基因(α-半乳糖苷酶基因)表達(dá)，水解X-α-gal產(chǎn)生藍(lán)色底物，證明Bx-HSF-1在酵母體內(nèi)具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.2 Bx-hsf-1 RNA干擾

經(jīng)siRNA過夜浸泡后，Bx-hsf-1的表達(dá)被有效抑制。熒光顯微觀察表明,羧基熒光素和菁染料標(biāo)記的siRNA均被松材線蟲有效吸收(圖2A、圖2C 2和圖2C 4)。RT-qPCR結(jié)果顯示，在siRNA浸泡12 h后松材線蟲的Bx-hsf-1和Bx-Actin沒有相互干擾，Bx-Actin可作為內(nèi)參基因，Bx-hsf-1在松材線蟲中被顯著抑制表達(dá)[log2(NRNAi/NCK)=-1.86，P<0.01，n=3](圖2B)。在Bx-ActinsiRNA和非靶向siRNA處理松材線蟲12 h后，Bx-hsf-1的表達(dá)量并無顯著差異。經(jīng)過10 d試驗(yàn)研究，與CK組線蟲相比，Bx-hsf-1RNAi處理的線蟲存活率和形態(tài)(圖2A和2C)均無顯著差異(P=0.46)。

2.3 RNAi處理線蟲差異表達(dá)基因鑒定

綜合RNAi處理組和CK組松材線蟲轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選出DEG 110條。表達(dá)量顯著下調(diào)基因86條[log2(NRNAi/NCK)<-1，Padjusted<0.001，P<0.01，圖3A藍(lán)色五角星]，去除表達(dá)量顯著下調(diào)的Bx-hsf-1[log2(NRNAi/NCK)=-1.745，Padjusted<0.001，P<0.01]，鑒定到靶基因85條(Padjusted<0.001，P<0.01，圖3A)，包括：具有肌動(dòng)蛋白結(jié)合活性的Bx-anc、微管運(yùn)動(dòng)活性相關(guān)的Bx-che、4個(gè)線蟲表皮結(jié)構(gòu)成分蛋白基因Bx-col、熱激蛋白基因Bx-hsp-70、半乳糖凝集素同源基因Bx-lec、負(fù)向調(diào)節(jié)身體形態(tài)發(fā)育和生長的Bx-lon以及幼蟲發(fā)育和正向調(diào)節(jié)基因Bx-lrp等多個(gè)與線蟲生長、幼蟲發(fā)育和溫度應(yīng)激相關(guān)基因。另有表達(dá)量顯著上調(diào)基因24條[log2(NRNAi/NCK)>1，Padjusted<0.001，P<0.01，圖3A紅色五角星]，其中包括Insulin/IGF路徑中與Bx-daf-16、Bx-daf-2和Bx-gld互作的基因，以及與蛻皮周期相關(guān)的MLT-10樣蛋白編碼基因和參與細(xì)胞代謝的Bx-dct基因。

對DEG進(jìn)行基因互作分析，110條DEG中有46條基因構(gòu)成133對直接調(diào)控關(guān)系(圖3B)，放大到3級調(diào)控層次，其中37條基因構(gòu)成以Bx-daf-21(圖3B 19)為中心的一個(gè)多級調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，Bx-HSF-1直接調(diào)控Bx-daf-21，并通過熱激蛋白70基因[Bx-hsp-70，log2(NRNAi/NCK)=-1.109，Padjusted<0.001，P<0.01，圖3B 24]間接調(diào)控Bx-daf-21。此外，Bx-hsf-1還與Bx-hsp-1(圖3B 58)、脅迫誘導(dǎo)基因Bx-sti(圖3B 57)，以及Bx-DAF-21結(jié)合蛋白基因Bx-cdc(圖3B 59)發(fā)生互作關(guān)系。

2.4 7個(gè)蟲態(tài)(齡)中差異表達(dá)基因表達(dá)量鑒定

對分離出的J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雄成蟲和雌成蟲進(jìn)行顯微拍照(圖4A)。RT-qPCR測定Bx-daf-21、Bx-hsp-1、Bx-hsp-70、Bx-sti、Bx-cdc和Bx-hsf-1共6條基因在J2、DJ3、DJ4、J3、J4、雄成蟲和雌成蟲共7種蟲態(tài)(齡)中的表達(dá)量(圖4B)，Bx-hsf-1在DJ3、J3和J4中顯著下調(diào)，其他蟲態(tài)(齡)未發(fā)生變化。RT-qPCR結(jié)果顯示Bx-daf-21在DJ3、J3和J4中顯著下調(diào)；Bx-hsp-1僅在DJ4和雌成蟲中上調(diào)表達(dá)；Bx-hsp-70在DJ3、J3、J4、雄成蟲和雌成蟲中顯著上調(diào)；Bx-sti在7個(gè)蟲態(tài)(齡)中均無明顯變化；Bx-cdc在DJ3、雄成蟲和雌成蟲中顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明Bx-daf-21與Bx-hsf-1表達(dá)量變化趨勢一致，Bx-hsp-70與Bx-hsf-1表達(dá)量變化趨勢相反。

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子HSF-1介導(dǎo)的熱激反應(yīng)是一種保守生存機(jī)制，其作用是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[20]。目前為止發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)HSF-1靶基因都編碼熱激蛋白(heat shock protein，HSP)，保護(hù)細(xì)胞免受蛋白質(zhì)破壞劑的破壞[21]。除了hsp基因外，HSF-1還調(diào)控參與多種細(xì)胞過程的基因，包括細(xì)胞保護(hù)、發(fā)育、代謝和衰老。秀麗線蟲HSF-1不僅在熱激反應(yīng)中起著核心作用，同時(shí)還調(diào)控線蟲生命活動(dòng)、壽命、蟲齡及相關(guān)生理過程[13, 22]。本研究對松材線蟲Bx-HSF-1進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Bx-HSF-1在酵母體內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄激活活性，是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子。由于Bx-HSF-1為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生較小的變化，就會(huì)引起調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中其他基因劇烈的變化[17]，所以通常將轉(zhuǎn)錄因子及microRNA等調(diào)控因子的log2(表達(dá)量閾值)<-0.5定義為下調(diào)，log2(表達(dá)量閾值)>0.5定義為上調(diào)[17, 23]。

松材線蟲是一類通過媒介昆蟲遷移的植物寄生線蟲，不同于其他植物線蟲，其發(fā)育階段在其生命周期中具有明顯的階段特異性作用[24]。先前對松材線蟲致病性的研究過程中，主要以混合蟲態(tài)(齡)進(jìn)行研究[25]，很少關(guān)注不同蟲態(tài)(齡)之間的差異。近期有研究表明，松材線蟲各蟲態(tài)(齡)在寄主植物內(nèi)有相同的生態(tài)位，但在松材線蟲各蟲態(tài)(齡)有許多差異表達(dá)基因[18-19, 26]。RT-qPCR結(jié)果表明Bx-hsf-1在松材線蟲不同蟲態(tài)(齡)中的表達(dá)量存在差異。與Bx-hsf-1相關(guān)的Bx-daf-21、Bx-hsp-1、Bx-hsp-70、Bx-sti、Bx-cdc這5個(gè)靶基因變化幅度都較大。Bx-hsp-70在不同蟲態(tài)(齡)中的表達(dá)量變化趨勢與Bx-hsf-1相反，與秀麗線蟲中熱激反應(yīng)衰減期間HSP-70負(fù)調(diào)節(jié)hsf-1轉(zhuǎn)錄[27]相符。本研究中Bx-daf-21僅在DJ3、J3與J4齡期顯著下調(diào)，其他蟲態(tài)(齡)變化幅度較小，與Bx-hsf-1表達(dá)量變化趨勢一致。Bx-daf-21基因是熱激蛋白90基因(hsp-90)的同源基因，又名Bx-hsp-90，以往研究表明該基因沉默會(huì)降低不適溫度下松材線蟲的存活率[16]。daf-21在秀麗線蟲形成DJ3過程中起關(guān)鍵作用[28]。RT-qPCR結(jié)果表明，在DJ3齡期Bx-daf-21與秀麗線蟲daf-21的表達(dá)量變化趨勢相同[28]，這意味著Bx-daf-21有可能在DJ3齡期起作用。本研究還發(fā)現(xiàn)Bx-daf-21、Bx-hsp-1、Bx-hsp-70、Bx-sti、Bx-cdc和Bx-hsf-1在不同蟲態(tài)(齡)中表達(dá)量存在差異，為進(jìn)一步研究松材線蟲的發(fā)育過程及其調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)。