蘇蕊芳,李詩(shī)韻,毛銀,趙運(yùn)英*,鄧禹,*

1(江南大學(xué), 糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122) 3(江南大學(xué),江蘇省生物活性產(chǎn)品加工工程研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122)

D-葡萄糖二酸(glucaric acid, GA)是葡萄糖的衍生物,是一種天然的二元酸,存在于許多水果和蔬菜中,特別是在十字花科蔬菜、西柚、柑橘等植物中葡萄糖二酸的含量較為豐富。葡萄糖二酸不僅在醫(yī)藥中有抗癌、治療糖尿病的作用[1],而且因其能合成羥基化尼龍,在紡織服裝方面也有廣泛的應(yīng)用[2]。因此,它在2004年被美國(guó)能源部確認(rèn)為“最具價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品”之一[3]。

目前,葡萄糖二酸主要通過(guò)葡萄糖的化學(xué)氧化方法合成,該方法以硝酸為溶劑和氧化劑[4]。但化學(xué)氧化法生產(chǎn)葡萄糖二酸存在收率低、副產(chǎn)物多、環(huán)境不友好等缺點(diǎn)。而采用生物法合成葡萄糖二酸對(duì)環(huán)境更加友好,并且能夠?qū)崿F(xiàn)低成本生產(chǎn)葡萄糖二酸。生物法生產(chǎn)葡萄糖二酸有很多種途徑,現(xiàn)階段,葡萄糖二酸的生物生產(chǎn)方法主要以微生物發(fā)酵為主。PRATHER團(tuán)隊(duì)通過(guò)共同表達(dá)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)、小家鼠的肌醇加氧酶(MIOX)和丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的糖醛酸脫氫酶(Udh),構(gòu)建了利用大腸桿菌從葡萄糖生物法合成葡萄糖二酸的途徑[5]。由于酵母的耐酸性和較強(qiáng)的抗噬菌體能力,GUPTA等[6]將大腸桿菌的葡萄糖二酸合成途徑轉(zhuǎn)移到釀酒酵母中,在外加肌醇的條件下葡萄糖二酸的最大滴度達(dá)到1.6 g/L。此外,釀酒酵母可以通過(guò)自身的Ino1和肌醇單磷酸酶(Inm1/2)轉(zhuǎn)化葡萄糖-6-磷酸生成肌醇,因此,研究人員只需要在釀酒酵母中表達(dá)外源的miox基因和udh基因即可實(shí)現(xiàn)葡萄糖到葡萄糖二酸的轉(zhuǎn)化[6-8]。

在研究葡萄糖二酸代謝途徑過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)MIOX的酶活力比Udh低2個(gè)數(shù)量級(jí)[5],并且穩(wěn)定性較差,容易失活。因此MIOX的催化過(guò)程成為葡萄糖二酸合成的限速步驟。研究人員采取了一系列代謝工程策略提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量,這些策略包括蛋白質(zhì)融合標(biāo)簽[9]、定向進(jìn)化、構(gòu)建多肽支架[10]等。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)將擬南芥(Arabidopsisthaliana)的miox4基因和丁香假單胞菌的udh基因構(gòu)建到釀酒酵母的delta位點(diǎn)上提高了葡萄糖二酸的產(chǎn)量[11];之后利用linker將MIOX4和Udh進(jìn)行融合,在釀酒酵母的delta位點(diǎn)表達(dá)[12],使葡萄糖二酸的產(chǎn)量大大提高;這些方法均提高了葡萄糖二酸的產(chǎn)量,但MIOX4的活力及穩(wěn)定性依然無(wú)法滿足應(yīng)用要求,因此采用定向進(jìn)化的方法篩選出酶活力較高的MIOX4具有重要意義。

定向進(jìn)化是利用基因工程技術(shù)模擬自然界中的進(jìn)化,建立蛋白質(zhì)突變庫(kù),從中篩出具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)突變體[13]。研究人員通常采用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行定向進(jìn)化[14-15]。葡萄糖二酸經(jīng)跨膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)后激活CdaR[16]蛋白使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?進(jìn)而與操縱子區(qū)域結(jié)合,啟動(dòng)下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄?；谏鲜鲈?王毳等[17]在大腸桿菌中構(gòu)建了葡萄糖二酸生物傳感系統(tǒng)篩,并將其應(yīng)用到篩選來(lái)自小鼠的肌醇加氧酶突變株的研究過(guò)程。本研究采取兩輪易錯(cuò)PCR的方法提高肌醇加氧酶的活性,通過(guò)葡萄糖二酸的產(chǎn)量篩選正突變菌株。同時(shí),利用本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的大腸桿菌葡萄糖二酸傳感器質(zhì)粒R7M10[18]作為高通量篩選工具篩選MIOX4突變株。

本研究以釀酒酵母BY4741opi1Δ(敲除OPI1基因的BY4741菌株)[11]為出發(fā)菌株,利用酵母自身的Ino1將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇-1-磷酸,再經(jīng)過(guò)酵母的Inm1/2將肌醇-1-磷酸轉(zhuǎn)化成肌醇,肌醇經(jīng)過(guò)外源的MIOX4轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖醛酸,之后再經(jīng)過(guò)外源Udh的催化生成葡萄糖二酸。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將擬南芥來(lái)源的肌醇加氧酶miox4基因和丁香假單胞菌來(lái)源的醛酸脫氫酶udh基因整合到BY4741opi1Δ的基因組上,以此構(gòu)建葡萄糖二酸生物合成途徑。本研究對(duì)擬南芥來(lái)源的MIOX4進(jìn)行定向進(jìn)化,通過(guò)兩輪易錯(cuò)PCR構(gòu)建MIOX4突變體文庫(kù),并利用大腸桿菌葡萄糖二酸傳感器作為高通量篩選工具對(duì)MIOX4突變體文庫(kù)進(jìn)行初篩,然后對(duì)篩選到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,挑選正向突變體并確定發(fā)生有益突變的氨基酸位點(diǎn)(圖1)。

圖1 MIOX4突變體文庫(kù)構(gòu)建和篩選策略示意圖Fig.1 The schematic diagram of the construction and screening strategy for MIOX4 mutant library

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒詳見(jiàn)表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

釀酒酵母用YPD[(g/L)(酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20)]、SD-URA、SD-HIS[(g/L)(葡萄糖20,無(wú)氨基酵母氮源1.7,硫酸銨5.0,10×必需氨基酸混合液,無(wú)對(duì)應(yīng)的氨基酸URA/HIS)]培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)基在YPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上外加60 mmol/L肌醇;大腸桿菌用LB[(g/L)(氯化鈉10,酵母提取物5,蛋白胨10)]培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),加入相應(yīng)的抗生素用于篩選轉(zhuǎn)化子;檢測(cè)熒光的大腸桿菌用M9[(g/L)(磷酸氫二鈉6.78,磷酸二氫鉀3,氯化鈉0.5,氯化銨1,硫酸鎂0.24,葡萄糖4,氯化鈣0.1 mmol/L)]培養(yǎng)。以上培養(yǎng)基添加2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉配制固體培養(yǎng)基。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table1 Strains and plasmids used in this study

1.1.3 試劑和儀器

2×TaqPCR Master Mix,南京諾唯贊科技有限公司;PCR引物(表2)及基因序列測(cè)序,蘇州金唯智生物有限公司;肌醇、葡萄糖二酸標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;其他常規(guī)試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。

ETC811基因擴(kuò)增儀,德國(guó)Eppendorf公司;Gel Doc XR+凝膠成像儀,美國(guó)Bio-Rad公司;SYNERGY H1多功能酶標(biāo)儀,南京拜爾克智能科技有限公司;UV-1800分光光度計(jì),上海翱藝儀器有限公司;1260Ⅱ高效液相色譜,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

表2 本研究所用引物序列Table 2 Primer sequence used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MIOX4蛋白活性位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬

在ZhangLab[19]https://zhanggroup.org/COACH/網(wǎng)站上預(yù)測(cè)來(lái)自擬南芥的MIOX4蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)和催化活性位點(diǎn);利用Swiss-Modelhttps://swissmodel.expasy.org/在線軟件對(duì)MIOX4進(jìn)行同源建模;使用可視化工具PyMOL對(duì)MIOX4進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬。

1.2.2 基因的擴(kuò)增

以菌株Bga-3[11]的基因組為模板,利用引物對(duì)HIS-udh-F/R擴(kuò)增帶有同源臂的HIS-udh,將該片段轉(zhuǎn)化到釀酒酵母BY4741opi1Δ,涂布到SD-HIS的平板上,挑取轉(zhuǎn)化子提基因組后利用引物對(duì)check-udh- F/R對(duì)基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證條帶正確的轉(zhuǎn)化子表示udh整合到OPI1的終止子上,即為BY4741opi1Δ-udh。

以質(zhì)粒pY26-miox4-udh[11]為模板,利用引物對(duì)URA3-F/R擴(kuò)增帶有同源臂的URA3,利用引物mi- ox4-1-F和miox4-4-R擴(kuò)增miox4,將擴(kuò)增得到的片段URA3和miox4利用引物URA3-F和miox4-4-R進(jìn)行融合得到URA3-miox4,將該片段轉(zhuǎn)化到BY4741opi1Δ-udh菌株中,涂布到SD-URA的平板上,對(duì)轉(zhuǎn)化子提基因組驗(yàn)證,驗(yàn)證條帶正確的轉(zhuǎn)化子表示miox4整合到OPI1的啟動(dòng)子上,得到未突變的對(duì)照菌株BY4741opi1Δ-udh-miox4。

1.2.3 易錯(cuò)PCR構(gòu)建突變體文庫(kù)

將miox4分成4段,分別標(biāo)記為1、2、3、4,miox4-1片段中包含miox4的啟動(dòng)子和ORF的上游,miox4-2片段為易錯(cuò)片段1,miox4-3片段為易錯(cuò)片段2,miox4-4片段中包含miox4的終止子和ORF的下游。以質(zhì)粒pY26-miox4-udh為模板,利用引物對(duì)miox4-1-F/R擴(kuò)增帶有同源臂的miox4-1片段,引物miox4-3-F和miox4-4-R擴(kuò)增miox4-3-4(包含3和4片段)片段,引物miox4-1-F和miox4-2-R擴(kuò)增miox4-1-2(包含1和2片段),使用引物對(duì)miox4-2-F/R和miox4-3-F/R對(duì)miox4-2和miox4-3分別進(jìn)行易錯(cuò)PCR;將擴(kuò)增得到的miox4-1、易錯(cuò)片段miox4-2*、miox4-3-4進(jìn)行融合,片段miox4-1-2、易錯(cuò)片段miox4-3、miox4-4進(jìn)行融合PCR,均得到易錯(cuò)miox4*;將易錯(cuò)miox4*和URA3片段利用引物miox4-1-F和URA3-R進(jìn)行融合PCR得到miox4*-URA3,將該片段轉(zhuǎn)化到BY4741opi1Δ-udh菌株中,涂布到SD-URA的平板上,所得到的轉(zhuǎn)化子即為突變體文庫(kù)。

1.2.4 利用大腸桿菌葡萄糖二酸傳感器初篩MI-OX4的正向突變體

將突變體文庫(kù)菌株接種到裝有2 mL YPD培養(yǎng)基的24孔板中,30 ℃培養(yǎng)12 h作為種子液,再轉(zhuǎn)接到裝有10 mL YPD(外加60 mmol/L肌醇)的試管中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),在24、48 h分別補(bǔ)5 g/L的葡萄糖,發(fā)酵培養(yǎng)7 d后,12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min收集發(fā)酵液。

將含有質(zhì)粒R7M10的大腸桿菌BL21種子以2%的接種量轉(zhuǎn)接到M9培養(yǎng)基中,接種之后的混合物與發(fā)酵液按1∶1加入到96深孔板中,培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8,用酶標(biāo)儀BioTek HT檢測(cè)熒光(激發(fā)485 nm,發(fā)射528 nm)和OD600值,取熒光/OD600的值,篩選熒光比值比對(duì)照高的突變菌株。

1.2.5 突變菌株的搖瓶發(fā)酵

將突變菌株接種到250 mL的搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng),30 ℃、250 r/min的條件下培養(yǎng),在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期24、48 h分別補(bǔ)加5 g/L的葡萄糖,每隔24 h取樣檢測(cè)OD600值及葡萄糖二酸的濃度。

1.2.6 葡萄糖二酸的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備:稱(chēng)取一定質(zhì)量的葡萄糖二酸鉀標(biāo)樣,融于超純水中,用KOH溶液調(diào)pH至中性,定容到終質(zhì)量濃度為1 g/L的葡萄糖二酸溶液。

樣品處理:取發(fā)酵溶液12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,收集上清液,用10 mmol/L稀硫酸稀釋2倍,再12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min混勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,供液相分析。

高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)分析條件:流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸,色譜柱為HPX-87H,進(jìn)樣量20 μL,流速0.6 mL/min,柱溫35 ℃,檢測(cè)器為示差檢測(cè)器。

2 結(jié)果與分析

2.1 易錯(cuò)PCR片段的確定

由于MIOX4的編碼區(qū)序列較長(zhǎng),直接易錯(cuò)PCR效率較低,因此為了提高M(jìn)IOX4的突變概率,本研究在ZhangLab網(wǎng)站上預(yù)測(cè)MIOX4蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)和催化活性位點(diǎn),利用Swiss-Model在線軟件對(duì)MIOX4進(jìn)行同源建模,使用可視化工具PyMOL對(duì)MIOX4進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬。通過(guò)模擬預(yù)測(cè)MIOX4的三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其結(jié)合位點(diǎn)和活性位點(diǎn)在2個(gè)鐵原子和底物的周?chē)?圖2-A)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,有13個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn),8個(gè)催化活性位點(diǎn),配體結(jié)合位點(diǎn)分別是Arg59、Tyr75、Asp116、Ser118、Asp119、Asp155、Lys158、Gly175、Asp176、His227、His253、Ser254、Tyr256(藍(lán)色和紫色);催化活性位點(diǎn)分別是His129、His154、Asp155、Lys158、His227、His253、Ser254、Asp286(粉色和紫色);其中Asp155、Lys158、His227、His253、Ser254既是催化活性位點(diǎn),又是配體結(jié)合位點(diǎn)(紫色)(圖2-B)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示這些氨基酸位點(diǎn)大多集中在MIOX4編碼區(qū)序列的中間區(qū)域,對(duì)MIOX4編碼區(qū)的中間區(qū)域分成兩段進(jìn)行易錯(cuò)PCR,以此提高突變概率。

2.2 葡萄糖二酸合成途徑的構(gòu)建

為了方便對(duì)突變MIOX4進(jìn)行篩選,本研究在釀酒酵母BY4741opi1Δ菌株上構(gòu)建葡萄糖二酸的代謝途徑,葡萄糖二酸由肌醇加氧酶MIOX4和糖醛酸脫氫酶Udh催化肌醇產(chǎn)生葡萄糖二酸,因此通過(guò)葡萄糖二酸的產(chǎn)量來(lái)篩選MIOX4突變株。以BY4741opi1Δ為出發(fā)菌株,在該菌株的基因組上構(gòu)建葡萄糖二酸的代謝途徑。首先將udh構(gòu)建到BY4741opi1Δ菌株OPI1的終止子上,構(gòu)建基礎(chǔ)菌株BY4741opi1Δ-udh;然后將經(jīng)過(guò)隨機(jī)突變的miox4*構(gòu)建到該菌株OPI1的啟動(dòng)子上得到突變體菌株BY4741opi1Δ-udh-miox4*,作為突變體文庫(kù),未發(fā)生突變的miox4作為對(duì)照菌株BY4741opi1Δ-udh-miox4(圖3)。以菌株Bga-3基因組為模板擴(kuò)增3 330 bp的HIS-udh(圖4-A),并轉(zhuǎn)化BY4741opi1Δ,正確的BY4741opi1Δ-udh轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)驗(yàn)證能擴(kuò)增915 bp(圖4-B)。

A-模擬MIOX4的三維結(jié)構(gòu);B-預(yù)測(cè)MIOX4的催化活性位點(diǎn)和配體結(jié)合位點(diǎn)圖2 MIOX4蛋白的三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.2 A simulation diagram of the three-dimensional structure of the MIOX4 protein注:橙色球體為鐵原子,黃色為底物肌醇,藍(lán)色和紫色為配體結(jié)合位點(diǎn),粉色和紫色為催化活性位點(diǎn),紫色為配體結(jié)合位點(diǎn)和催化活性位點(diǎn)

圖3 構(gòu)建葡萄糖二酸代謝途徑的示意圖Fig.3 Schematic diagram of constructing glucaric acid metabolic pathway

A-擴(kuò)增HIS-udh;B-轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證結(jié)果圖4 BY4741opi1Δ上構(gòu)建udh 基因Fig.4 Construction of udh gene in BY4741opi1Δ

2.3 易錯(cuò)PCR對(duì)MIOX4定向進(jìn)化

通過(guò)對(duì)MIOX4蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),MIOX4蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)和催化活性位點(diǎn)集中在編碼區(qū)的中間區(qū)域,為了提高突變率,將miox4的編碼區(qū)的中間區(qū)域分成2段分別進(jìn)行易錯(cuò)PCR。這樣就有2種情況,一種情況是miox4-2發(fā)生突變,miox4-2序列包括39位的天冬氨酸到205位的酪氨酸(圖5-A),另一種情況是miox4-3發(fā)生突變,miox4-3序列包括196位的谷氨酸到298位的谷氨酸(圖5-B),以此擴(kuò)大突變文庫(kù)。

A-對(duì)miox4-2片段易錯(cuò);B-對(duì)miox4-3片段易錯(cuò)圖5 兩種易錯(cuò)PCR的情況示意圖Fig.5 Schematic diagram of two error-prone PCR scenarios

Mn2+可以通過(guò)降低聚合酶對(duì)模板的特異性而增加堿基錯(cuò)配概率,研究人員一般采用外加Mn2+的方式進(jìn)行易錯(cuò)PCR[20-21]。我們亦采用外加不同濃度的Mn2+進(jìn)行易錯(cuò)PCR,為了提高突變率,本研究采用兩輪易錯(cuò)PCR的方式來(lái)進(jìn)行。以質(zhì)粒pY26-miox4-udh為模板,選取濃度為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mmol/L的Mn2+分別對(duì)miox4-2和miox4-3進(jìn)行第一輪易錯(cuò)PCR,由圖6-A可知,隨著Mn2+濃度升高,條帶逐漸變淡,選取Mn2+濃度為3.5、4、4.5 mmol/L的PCR產(chǎn)物作為模板對(duì)其進(jìn)行第二輪易錯(cuò)PCR,Mn2+濃度為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mmol/L,隨著Mn2+濃度升高,條帶逐漸變淡并且消失(圖6-B)。

1～8-Mn2+濃度1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mmol/LA-第一輪易錯(cuò)PCR;B-第二輪易錯(cuò)PCR圖6 外加不同Mn2+濃度進(jìn)行易錯(cuò)PCRFig.6 Different Mn2+ concentrations for error-prone PCR

將易錯(cuò)片段miox4-2*和miox4-3*分別與其他片段融合得到突變的miox4*擴(kuò)增產(chǎn)物,以質(zhì)粒pY26-miox4-udh為模板擴(kuò)增URA3,將突變的miox4*和URA3進(jìn)行融合得到URA3-miox4*片段3 089 bp(圖7),融合片段轉(zhuǎn)化到菌株BY4741opi1Δ-udh中,構(gòu)建突變體文庫(kù)。

泳道1-第一種易錯(cuò)PCR情況與URA3融合的結(jié)果(miox4-2*與miox4-1、miox4-3-4、URA3融合);泳道2-第二種易錯(cuò)PCR情況與URA3融合的結(jié)果(miox4-3*與miox4-1-2、miox4-4、URA3融合)圖7 兩種易錯(cuò)PCR產(chǎn)物融合的結(jié)果Fig.7 The results of the fusion of two error-prone PCR products

2.4 利用大腸桿菌葡萄糖二酸傳感器對(duì)突變體文庫(kù)進(jìn)行初篩

在大腸桿菌中,葡萄糖二酸經(jīng)膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)后與cdaR結(jié)合變成激活形式,進(jìn)而與操縱子區(qū)域結(jié)合,啟動(dòng)下游報(bào)告基因gfp的轉(zhuǎn)錄[17， 22]。R7M10質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子cdaR和綠色熒光蛋白GFP,能將葡萄糖二酸濃度以熒光的強(qiáng)弱顯示出來(lái)[18]。為了確定熒光檢測(cè)的時(shí)間,以對(duì)照菌株BY4741opi1Δ-udh-miox4(未突變)的發(fā)酵液為對(duì)照,檢測(cè)不同比例的菌液和發(fā)酵液在不同時(shí)間的熒光/OD600值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,菌液和發(fā)酵液體積比為1∶1時(shí)在6～7 h檢測(cè)熒光效果較好(圖8)。

圖8 菌液和發(fā)酵液比例以及熒光檢測(cè)時(shí)間的確定Fig.8 Determination of the ratio of bacterial liquid and fermentation liquid, fluorescence detection time

利用大腸桿菌葡萄糖二酸傳感器作為一個(gè)高通量工具篩選突變體文庫(kù),檢測(cè)突變株發(fā)酵液中的葡萄糖二酸。將帶有質(zhì)粒R7M10的大腸桿菌BL21菌液以2%的接種量轉(zhuǎn)接到M9培養(yǎng)基中,然后與發(fā)酵液以1∶1的體積比加入到96深孔板中,培養(yǎng)6～7 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè),篩選熒光較強(qiáng)的突變株,從熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),1 200株菌中有60株熒光較高且高于對(duì)照的菌株(圖9)。

為了進(jìn)一步確定這60株菌的葡萄糖二酸的產(chǎn)量,對(duì)60株菌進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。液相結(jié)果顯示,有24株菌的葡萄糖二酸產(chǎn)量高于對(duì)照菌株(未突變菌株)(圖10),其中9、15、41產(chǎn)量最高,分別是1.08、1.01、1.18 g/L,分別較對(duì)照菌株提高了34%、26%、48%。

圖9 大腸桿菌葡萄糖二酸傳感器質(zhì)粒對(duì)突變體文庫(kù)初篩的熒光結(jié)果Fig.9 Fluorescence results of screening of mutant library by E.coli glucaric acid biosensor

圖10 60株熒光較高的菌株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩Fig.10 Fermentation rescreening of 60 strains with higher fluorescence

2.5 突變菌株突變位點(diǎn)的確定及搖瓶發(fā)酵

為了鑒定上述24株菌的MIOX4的突變位點(diǎn),對(duì)這24株菌的MIOX4序列進(jìn)行了DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示,第8、9、12、15、41、45號(hào)菌株的MIOX4的氨基酸序列發(fā)生了突變,其余沒(méi)有發(fā)生突變,MIOX4的突變位點(diǎn)如表3所示。為了進(jìn)一步確定這些突變位點(diǎn)是否為有益突變,對(duì)這6株突變株在外加60 mmol/L肌醇的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,以未突變的菌株作為對(duì)照菌株。生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期后,在24、48 h分別補(bǔ)5 g/L葡萄糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,突變株S133R、K88R、E72V、T40P在發(fā)酵168 h時(shí)葡萄糖二酸產(chǎn)量較對(duì)照菌株產(chǎn)量分別提高了53%、30%、21%、17%(圖11),說(shuō)明這4個(gè)位點(diǎn)為正向突變位點(diǎn)。

表3 突變位點(diǎn)的確定Table 3 Determination of the mutation sites

圖11 突變株搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig.11 Mutant shake flask fermentation results

2.6 MIOX4(S133R)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

本研究中,我們對(duì)葡萄糖二酸產(chǎn)量提高最高的突變體MIOX4(S133R)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析,將突變后的MIOX4(S133R)蛋白序列輸入到蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)平臺(tái)Swiss Model后,對(duì)突變蛋白進(jìn)行同源建模,進(jìn)一步分析突變后蛋白MIOX4(S133R)的氨基酸結(jié)構(gòu)變化。分析結(jié)果顯示,MIOX4蛋白S133突變成R133后,Arg133和底物肌醇之間的距離變遠(yuǎn)(圖12),這種距離的增加導(dǎo)致了空間位阻的減少。KARKHANE等[23]通過(guò)定點(diǎn)誘變的方法減少空間位阻,使突變后的Phe181與催化Ser114之間的距離增大,脂肪酶活性增加了2.6倍。薄秀梅等[24]將MEKK3蛋白K391突變?yōu)镸391后,使靠近反應(yīng)中心的原子側(cè)鏈占有的空間位置變大,增大了空間位阻而失去活性?？臻g位阻會(huì)限制底物進(jìn)入酶活性的位點(diǎn),因此空間位阻的減小可能會(huì)提高M(jìn)IOX4的催化活性。

A-野生型MIOX4第133位的絲氨酸Ser與底物肌醇的空間距離;B-突變后133位的精氨酸Arg與底物肌醇的空間距離圖12 野生型MIOX4和突變型MIOX4(S133R)蛋白結(jié)構(gòu)的比較Fig.12 Comparison of the protein structure of wild-type MIOX4 and mutant MIOX4(S133R)

3 結(jié)論

目前,葡萄糖二酸的產(chǎn)量經(jīng)代謝工程及合成生物學(xué)的方法已大大提高[11-12],但肌醇轉(zhuǎn)化成葡萄糖醛酸的過(guò)程依舊是葡萄糖二酸代謝的限速步驟,因此提高肌醇加氧酶MIOX4的活性顯得尤為重要。定向進(jìn)化是一種非常強(qiáng)大的蛋白質(zhì)工程工具,可以在不深入了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和酶-底物相互作用的情況下改善酶的性能。本研究以釀酒酵母為宿主,對(duì)來(lái)自擬南芥的肌醇加氧酶MIOX4進(jìn)行定向提高其活性。采用易錯(cuò)PCR的方法來(lái)構(gòu)建MIOX4突變體文庫(kù),利用大腸桿菌葡萄糖二酸傳感器將葡萄糖二酸產(chǎn)量轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒鈴?qiáng)度對(duì)突變體文庫(kù)進(jìn)行初篩,得到了60株熒光較高的菌株。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)這60株菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,獲得了24株葡萄糖二酸產(chǎn)量高于對(duì)照的菌株。最后發(fā)現(xiàn),4個(gè)MIOX4的突變體(S133R、K88R、E72V、T40P)的葡萄糖二酸產(chǎn)量較野生型分別提高了53%、30%、21%、17%,其中S133R的產(chǎn)量提高最顯著。本研究結(jié)果同時(shí)進(jìn)一步證明了MIOX4在葡萄糖二酸生物合成過(guò)程中起著重要作用,為后續(xù)提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。