汪寧,劉冬豪,容俊楠,周慶瓊,漆亞喬,戚平

(廣州市食品檢驗所,廣東 廣州,511410)

全氟化合物(perfluoroalkyl sulfonic acid compounds, PFCs)是一類環(huán)境中新型持久有機(jī)污染物,包括全氟烷基磺酸、全氟烷基羧酸、全氟烷基磺酰胺三類,其中應(yīng)用最廣泛的PFCs是全氟辛烷磺酸(perfluorooctanesulfonic acid, PFOS) 和全氟辛酸(pentadecafluorooctanoic acid,PFOA)[1-3]。PFCs具有遷移能力,普遍存在于水、土壤、植物動物源性食品中[4-6],通過食物鏈累積,可對人體的健康造成影響[6-7]。目前,分析全氟化合物的方法主要是液相色譜-質(zhì)譜法[2-3，8-9]或氣相色譜法[10-11],但這2種方法耗時較長、樣品制備較復(fù)雜。同時由于儀器中管路材料的影響,可能引起系統(tǒng)本底背景值的升高[8],從而影響痕量分析的準(zhǔn)確性。因此,迫切需要開發(fā)簡單、高通量的PFCs 分析方法。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS) 是一種強(qiáng)有力的生物大分子分析工具,具有高靈敏度、實(shí)驗周期短、前處理簡單、樣品消耗量低等優(yōu)點(diǎn),主要用于蛋白質(zhì)、多肽、多糖、聚合物的分析[12-13],目前國內(nèi)外已有一些學(xué)者將該方法成功用于環(huán)境中苯并芘、抗生素、酚類等小分子污染物的分析[14-18]。α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA)、2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid,DHB)、芥子酸(sinapinicacid,SA)是MALDI 分析常用的基質(zhì),在大分子檢測中得到廣泛的應(yīng)用,它們通常被認(rèn)為在激光照射下容易產(chǎn)生碎裂片段對目標(biāo)物造成干擾,不適用于分子質(zhì)量500 Da 以下化合物的分析[19-21]。而有機(jī)金屬框架材料[14]、納米材料[16]、金屬有機(jī)骨架納米復(fù)合材料[15，18]等材料近年來被開發(fā)作為MALDI-TOF MS方法的新基質(zhì)材料,用于小分子物質(zhì)的分析。常用的基質(zhì)與新基質(zhì)相比,不需要進(jìn)一步的鑒定,并且可購買獲得,價格便宜,對檢測儀器安全可靠。關(guān)于這3種常用的基質(zhì)對小分子待測物的具體干擾、負(fù)離子模式檢測下的MALDI 質(zhì)譜信號等方面較少報道。

本文擬探索MALDI-TOF MS技術(shù)的常用基質(zhì)在負(fù)離子模式下檢測全氟烷基磺酸類化合物,旨在建立一種新的全氟烷基磺酸類化合物檢測方法,實(shí)現(xiàn)快速、有效檢測。通過內(nèi)標(biāo)定量的方法建立PFOS的MALDI-TOF MS定量分析,能實(shí)現(xiàn)環(huán)境水樣中PFOS的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 主要試劑

HCCA、DHB、SA,美國Sigma-Aldrich公司;全氟丁烷磺酸、全氟癸烷磺酸,加拿大TRC公司;全氟己烷磺酸、全氟庚烷磺酸、全氟辛烷磺酸,德國DR公司;全氟辛烷磺酸鈉內(nèi)標(biāo),加拿大Wellington公司;甲醇(色譜純),美國Thermo Fisher Scientific公司。具體見表1。

表1 基質(zhì)及全氟烷基磺酸化合物信息Table 1 Matrix and perfluoroalkyl sulfonic acid compound information

1.1.2 儀器與設(shè)備

ultrafleXtreme基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜,德國Bruker Daltonics公司;2600TH超聲清洗器,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;SECURA224-1CN電子天平,德國Sartorious公司;M37 610-33CN渦旋混合器,美國Thermo Fisher Scientific公司;Milli-Q超純水系統(tǒng),美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 基質(zhì)的配制

稱取適量的HCCA、DHB、SA固體分別溶解于一定量的甲醇水(體積比1∶1)溶液中,配制成10 mg/mL的基質(zhì)溶液,超聲溶解。

1.2.2 全氟烷基磺酸溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置

全氟烷基磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mg/mL,分別準(zhǔn)確稱取5種全氟烷基磺酸標(biāo)準(zhǔn)品0.010 00 g置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,作為標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液,于-18 ℃冰箱內(nèi)冷凍保存。

取上述5種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.1 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇水(體積比1∶1)定容至刻度,配成2.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.025、0.05、0.10、0.25、0.50、2.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0 μg/mL)于6個不同的10 mL容量瓶中,同時加入全氟辛烷磺酸鈉內(nèi)標(biāo),用甲醇水定容至刻度,配成5、10、25、50、100、500 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/mL。

1.2.3 樣品的準(zhǔn)備

取1 μL待測液滴加于不銹鋼靶板上,待其干燥后,再迅速滴加基質(zhì)溶液1 μL,在自然條件下待干燥后,把靶板放入儀器。

1.2.4 數(shù)據(jù)采集分析

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀器配備smartbeam-ⅡTM激光,頻率為2 000 Hz,激光能量設(shè)置為30%～50%,在負(fù)離子反射檢測模式下質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為100～3 500,數(shù)據(jù)處理采用Flex Analysis 3.4軟件。

2 結(jié)果與分析

全氟烷基磺酸類化合物含有磺酸基團(tuán),易在負(fù)離子模式下被MALDI-TOF MS分析檢測。LI等[16]研究以TiO2 NS、P25 TiO2等作為基質(zhì),分別在反射的正、負(fù)離子模式下進(jìn)行分析,在正離子模式下均未觀察到顯著的全氟辛烷磺酸特征峰,而在負(fù)離子模式能觀察到特征峰。根據(jù)目標(biāo)化合物的特點(diǎn),本實(shí)驗儀器方法設(shè)置為負(fù)離子反射模式,以HCCA、SA、DHB為基質(zhì),對5種全氟烷基磺酸類化合物進(jìn)行測定。

2.1 負(fù)離子模式下的基質(zhì)譜峰

在負(fù)離子反射模式下,對HCCA、SA、DHB 3種基質(zhì)本身測定,能明顯觀察到3種基質(zhì)自身的準(zhǔn)分子離子峰,[HCCA-H]-(m/z188.1)、[SA-H]-(m/z223.2)、[DHB-H]-(m/z153.1)。除此之外還有二聚體峰、Na+與基質(zhì)結(jié)合峰等其他形式的聚合峰,如[2HCCA-H]-(m/z377.2)、[2HCC+Na-2H]-(m/z399.2)、[2DHB-H]-(m/z307.2),[2SA-H]-(m/z447.2)等,這與郝春雁等[20]的研究結(jié)果一致,結(jié)果如圖1 所示。

2.2 對待測物的影響

5種全氟烷基磺酸類化合物為被分析物,分別與3 種基質(zhì)直接混合于樣品靶上,質(zhì)譜圖上能非常明顯地觀察到[PFBS-H]-(m/z299.1)、[PFHxS-H]-(m/z399.1)、[PFHpS-H]-(m/z449.1)、[PFOS-H]-(m/z499.1)、[PFDS-H]-(m/z599.1)的特征峰,分子質(zhì)量偏差小于0.05% ,與軟件擬合的[M-H]-一致。全氟烷基磺酸類化合物容易在負(fù)離子模式下被解離成[M-H]-形式,且成為最穩(wěn)定和主導(dǎo)的陰離子,主要是因為強(qiáng)C—F鍵尾的吸電子效應(yīng)。

a-DHB;b-SA;c-HCCA圖1 基質(zhì)的負(fù)離子反射模式質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrometry of marix using negative ion reflection mode

在HCCA作基質(zhì)時,實(shí)驗中雖然沒有加入Na+，但質(zhì)譜圖中含有[2HCCA+Na-2H]-(m/z399.1)的信號峰,對PFHxS的檢測結(jié)果存在干擾,如圖2所示;在SA作基質(zhì)時,[2SA-H]-(m/z447.2)的同位素峰對PFHpS的檢測結(jié)果存在干擾,如圖3所示;在DHB作基質(zhì)時,m/z為299.2、399.3、499.2的基質(zhì)峰對PFBS、PFHxS、PFOS的檢測結(jié)果存在干擾,如圖4所示。各基質(zhì)對被分析物的適用性如表2所示。且由于SA和DHB基質(zhì)偏硬,檢測時需要的激光能量高于HCCA,但是離子峰強(qiáng)度卻低于HCCA,信噪比也差于HCCA,因此選用HCCA作基質(zhì)檢測全氟烷基磺酸類化合物要優(yōu)于SA和DHB。

A-matrix blank;B-perfluoroalkyl sulfonic acid compounda-PFBS;b-PFHxS;c-PFHpS;d-PFOS;e-PFDS圖2 以HCCA作為基質(zhì)的5種全氟烷基磺酸類化合物質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of perfluoroalkyl sulfonic acid compounds using HCCA as matrix

表2 不同基質(zhì)測定全氟烷基磺酸類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的情況Table 2 Performances of perfluoroalkyl sulfonic acid standard analyzed using different kinds of matrix

2.3 全氟辛烷磺酸內(nèi)標(biāo)定量曲線的建立

用甲醇水配制5、10、25、50、100、500 ng/mL系列質(zhì)量濃度PFOS標(biāo)準(zhǔn)溶液,MPFOS內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/mL,點(diǎn)樣后在選定的最佳質(zhì)譜條件下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,以PFOS和MPFOS分子離子峰的峰面積之比與PFOS的濃度進(jìn)行定量。結(jié)果表明,該方法在5～500 ng/mL具有很好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.997 9,如圖5所示。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋,以最低濃度系列化合物的響應(yīng)值3倍信噪比對應(yīng)的濃度為檢出限,以大于10倍信噪比濃度為定量限,方法的檢出限為1 ng/mL,定量限為5 ng/mL。

在GB 5009.253—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物源性食品中全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)的測定》標(biāo)準(zhǔn)中,采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法測定PFOS,單個樣品的上機(jī)檢測時間約為10 min,而采用MALDI-TOF MS內(nèi)標(biāo)法在1 min內(nèi)獲得信號峰,能縮短檢測時間,有效提高檢測效率。

A-matrix blank;B-perfluoroalkyl sulfonic acid compounda-PFBS;b-PFHxS;c-PFHpS;d-PFOS;e-PFDS圖3 以SA作為基質(zhì)的5種全氟烷基磺酸類化合物質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of perfluoroalkyl sulfonic acid compounds using SA as matrix

A-matrix blank;B-perfluoroalkyl sulfonic acid compounda-PFBS;b-PFHxS;c-PFHpS;d-PFOS;e-PFDS圖4 以DHB作為基質(zhì)的5種全氟烷基磺酸類化合物質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of perfluoroalkyl sulfonic acid compounds using DHB as matrix

圖5 以HCCA作為基質(zhì)PFOS和MPFOS的峰面積之比與PFOS質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Fig.5 Linear relationships between the ratio of peak area of PFOS and MPFOS and PFOS concentration using HCCA as matrix

2.4 MALDI-TOF MS內(nèi)標(biāo)定量方法的驗證分析

采集當(dāng)?shù)?條河流的水樣,用0.22 μm的濾膜過濾2次,經(jīng)檢測后在m/z100～3 500無PFOS的特征峰,PFOS的含量低于方法檢出限。該樣品中添加PFOS標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,添加PFOS的質(zhì)量濃度水平分別為5、50、200、500 ng/mL,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線一致,采用前文步驟對樣品進(jìn)行處理和測定,每個含量水平平行測定6次,內(nèi)標(biāo)法校正,結(jié)果見表3。

表3 河流水樣的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Method recovery rate and relative standard deviation of river water

3 結(jié)論

本文對比了HCCA、SA、DHB 3種常用基質(zhì)在負(fù)離子反射模式下的質(zhì)譜信號峰及目標(biāo)化合物的干擾。采用HCCA作為基質(zhì),使用內(nèi)標(biāo)定量的方法消除了MALDI基質(zhì)不均勻等影響,建立了全氟辛烷磺酸的MALDI-TOF MS內(nèi)標(biāo)定量檢測方法,實(shí)現(xiàn)了對環(huán)境水樣中全氟辛烷磺酸的準(zhǔn)確定量,這對探討建立食品中全氟化合物MALDI-TOF MS的檢測方法具有借鑒意義。