陳 平, 梁昌鏞

(揚州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225100)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)是非洲豬瘟(African swine fever, ASF)的病原，屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的唯一成員，是具有囊膜的大型二十面體雙鏈DNA病毒[1].其基因組大小為170～194 kb[2]，含有160～175個開放閱讀框(open reading frames, ORFs)，編碼150～200種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，但許多蛋白的功能尚不清楚[1].衣殼組成成分包括主要衣殼蛋白p72和4種次要衣殼蛋白M1249L、p17、p49和H240R[3].依據(jù)病毒交叉血凝性將ASFV劃分為8個血清群，依據(jù)主要衣殼蛋白p72的B646L序列將其劃分為24個基因型(Ⅰ～ⅩⅩⅣ)[4].該病毒的宿主是家豬和野豬，主要通過直接和間接接觸形成循環(huán)傳播網(wǎng)絡(luò)(圖1)[5-6].發(fā)病豬、隱性感染豬及其排泄物和污染物以及傳染媒介蜱蟲等均是ASFV的傳染源.在非洲，ASFV流行傳播方式主要是蜱蟲叮咬后形成“野豬—軟蜱—野豬”的“森林循環(huán)”模式；在非洲之外，傳播方式主要是“家豬—家豬”循環(huán)和“家豬—軟蜱”循環(huán)的模式.有的家豬和野豬在感染后隱性帶毒[5]或康復(fù)后潛伏帶毒[7]，并向環(huán)境中排毒，導(dǎo)致ASFV不斷傳播[8].ASFV DNA復(fù)制發(fā)生在宿主單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核周圍胞質(zhì)中，最終ASFV從受感染的細(xì)胞中出芽[9].此外，感染ASFV的豬的血液具有高度傳染性，是豬接觸感染的主要傳染源[10].

圖1 ASFV的主要傳播網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Main spreading network of ASFV

1921年，ASF始發(fā)于非洲肯尼亞[11].2018年8月，我國報告首例ASF疫情，由于缺乏有效的ASFV疫苗和治療方法，ASF迅速蔓延至全國32個省(市、自治區(qū)).農(nóng)業(yè)農(nóng)村部[12]公開信息顯示，截至2021年7月底全國范圍內(nèi)暴發(fā)ASF疫情192起，撲殺生豬100萬頭以上，這給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失.世界動物衛(wèi)生組織將ASF列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病.本文對NCBI發(fā)布的VN/QP-ASFV1(2019)毒株編碼蛋白中已知功能的主要蛋白在病毒感染過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行總結(jié)，并對ASFV減毒活疫苗的研究情況進(jìn)行綜述，以期為ASF的防控與疫苗研發(fā)提供參考.

1 ASFV蛋白種類及功能

ASFV與其他核質(zhì)大DNA病毒具有類似的結(jié)構(gòu)、基因組和復(fù)制特性，但ASFV的獨特在于病毒顆粒的五層結(jié)構(gòu)和二十面體形態(tài).利用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)方法，解析出ASFV全顆粒的三維結(jié)構(gòu)[3]，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的ASFV顆粒平均直徑為260～300 nm，由內(nèi)向外的五層結(jié)構(gòu)分別為病毒核心(nucleoid)、病毒核殼(core shell)、內(nèi)囊膜(inner membrane)、病毒衣殼(capsid)、外囊膜(outer membrane).病毒核心包含病毒基因組和核蛋白，它們是早期mRNAs合成所需的元件；病毒核殼由pp220、pp62等多聚蛋白構(gòu)成；核殼外周附著一層來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)囊膜，并形成二十面體對稱的病毒衣殼，以細(xì)胞質(zhì)膜出芽獲得外囊膜.

通過分析NCBI發(fā)布的VN/QP-ASFV1(2019)毒株的全基因組信息(表1)發(fā)現(xiàn)，ASFV基因組編碼蛋白有163種，其中，功能被試驗表征的蛋白有67種，一半以上的ASFV ORFs未被確定結(jié)構(gòu)和功能.已確定功能的主要蛋白按其在感染宿主時發(fā)揮的作用分為6類：參與病毒形態(tài)形成的蛋白(16種)；參與病毒入侵的蛋白(8種)；病毒進(jìn)入宿主后，參與病毒復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白(25種)；參與宿主機體免疫調(diào)控的蛋白(18種)；參與病毒跨膜與傳播的蛋白(2種)；多基因家族(multigene family, MGF)編碼的病毒蛋白(6種).其中，大多數(shù)MGF蛋白的功能和種類尚未被確定，預(yù)測MGF蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有多樣性，但同一MGF的蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)、位置和功能.MGF基因在相同基因型ASFV毒株的進(jìn)化過程中傾向于丟失拷貝數(shù)[13].

表1 VN/QP-ASFV1(2019)毒株中主要功能蛋白分類Table 1 Classification of main functional proteins in VN/QP-ASFV1 (2019) strain

2 ASFV減毒活疫苗

ASFV于20世紀(jì)20年代初就被發(fā)現(xiàn)并報道，但其疫苗研究滯后了近50年，主要原因在于ASFV龐大基因組的多樣性及其免疫逃避機制的復(fù)雜性.目前，ASFV疫苗主要包括滅活疫苗、重組活載體疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、減毒活疫苗.在中短期內(nèi)，ASFV減毒活疫苗是最有希望研究成功的候選疫苗[42-43]，也是研究者們的重點研究方向.ASFV減毒活疫苗是將ASFV經(jīng)過特殊處理后減弱其致病力而保留其免疫原性的一類疫苗，該疫苗用較小劑量就能實現(xiàn)持續(xù)性的免疫保護(hù)，且其能針對同源親本病毒的攻擊起到完全保護(hù)效果[44]，但對異源毒株的交叉保護(hù)效果欠佳[42].ASFV減毒活疫苗按減毒方式可分為傳統(tǒng)減毒活疫苗和重組減毒活疫苗.

2.1 傳統(tǒng)減毒活疫苗

傳統(tǒng)減毒活疫苗包括自然致弱疫苗和細(xì)胞傳代致弱疫苗.其中，自然致弱疫苗是通過自然衰減毒力的毒株制備的疫苗.在20世紀(jì)60年代初期，葡萄牙和西班牙學(xué)者在野外接種自然致弱疫苗，發(fā)現(xiàn)其對同源ASFV可產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用，但對異源病毒保護(hù)效率低或沒有保護(hù)作用[44]，且該疫苗的使用對動物存在低病毒血癥或發(fā)熱、肺炎、關(guān)節(jié)腫脹、流產(chǎn)、死亡、慢性感染等諸多不良副作用[45].因此，該類疫苗安全性還需要進(jìn)一步評估.

自然致弱疫苗的常見毒株有OURT88/3和HN/P86.Oura et al[46]證實，OURT88/3毒株免疫后可以抵抗OUR/T88/3強毒株的攻擊，但OUR/T88/3毒株免疫可能使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞耗盡而不能免受OUR/T88/1毒株的攻擊，致使感染豬出現(xiàn)病毒血癥和發(fā)燒癥狀[47].家豬使用減毒的OURT88/3株，雖然可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度抗體發(fā)揮保護(hù)作用，但并不持久[48-49].HN/P86弱毒株可促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生毒性T淋巴細(xì)胞，并抵抗L60強毒株的攻擊，但同時會引起部分豬出現(xiàn)感染加劇現(xiàn)象[50]；HN/P86還會引起CD8+T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子IFNα、TNFα以及巨噬細(xì)胞釋放IL12p40，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞抵抗病毒.IL12p40是自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞活化所必需的，而IFNα對IL12p40的表達(dá)呈負(fù)調(diào)控作用，這可能是減毒活疫苗造成部分豬感染加劇的原因[46].這些試驗不僅證實了減毒活疫苗在異源保護(hù)方面的不足，還指出了CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抵抗ASFV中發(fā)揮的重要作用.

細(xì)胞傳代致弱疫苗是ASFV對培養(yǎng)細(xì)胞系適應(yīng)后，引起病毒基因組部分片段自發(fā)缺失，導(dǎo)致病毒毒力減弱的一類減毒活疫苗.已有研究表明，Georgia強毒株在Vero細(xì)胞中的復(fù)制能力隨著連續(xù)傳代而增強，而在原代豬巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力隨著連續(xù)傳代而減弱.這表明適應(yīng)Vero細(xì)胞系的ASFV突變株缺失了在豬巨噬細(xì)胞中復(fù)制和生長相關(guān)的特定功能基因.在Vero細(xì)胞中，隨著傳代次數(shù)的增加，Georgia毒株的毒力逐漸減弱，并在第110次傳代時完全減毒，但家豬接種完全減毒的病毒并未針對強毒親本Georgia的攻擊起到保護(hù)效果[51].這暗示該毒力完全喪失的毒株在豬體內(nèi)的復(fù)制能力可能受限使其喪失免疫原性，造成免疫保護(hù)效果不佳.

傳統(tǒng)減毒活疫苗已逐漸被淘汰，主要是由于其慢性感染會引起安全問題以及接種后會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[52].然而，Borca et al[53]研究表明，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可對基因組中靶序列進(jìn)行高精度編輯，極大提升了重組ASFV的純化效率，這為研制ASFV重組減毒活疫苗提供了思路.

2.2 重組減毒活疫苗

重組減毒活疫苗是通過減弱病毒的致病力而保留其免疫原性，并靶向缺失毒力相關(guān)病毒基因的ASFV疫苗.常見的缺失基因包括TK、NL、9GL、UK、CD2v、DP148R及MGF360/505基因.

TK基因參與三磷酸脫氧核苷的合成，對細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒生長不是必需的，但缺失TK基因的ASFV-Georgia株被完全減毒，且無法在豬巨噬細(xì)胞中復(fù)制，不能誘導(dǎo)針對強毒親本攻擊的免疫保護(hù)機制[54]；而Malawi株缺失TK基因卻可以誘導(dǎo)對同源病毒攻擊的免疫保護(hù)機制[55].除了TK基因外，NL(DP71L)基因也與病毒毒力有關(guān)，E70分離株缺失該基因可以有效減毒，但在Georgia分離株中NL基因的缺失不會減毒且會引起異質(zhì)反應(yīng)，使動物提前發(fā)生病毒血癥甚至死亡[56].這說明在不同病毒分離株中同一基因的功能可能存在一定的差異.

9GL缺失后，Malawi、Pretoriuskop分離株毒力減弱，且能針對親本分離株的攻擊起到完全保護(hù)的效果；而9GL缺失的Georgia分離株僅部分減毒，且針對親本分離株攻擊的保護(hù)作用也不完全，高劑量免疫還會誘發(fā)ASF病癥現(xiàn)象[57].在9GL缺失的基礎(chǔ)上進(jìn)一步缺失了E70分離株的毒力相關(guān)基因UK，構(gòu)建了9GL、UK雙基因缺失分離株，不僅避免了高劑量產(chǎn)生的病理作用，還可在接種2周后針對親代Georgia分離株的攻擊起到完全保護(hù)的效果[58].這表明多個毒力相關(guān)基因的共同缺失可能是實現(xiàn)疫苗安全和提供有效保護(hù)的重要途徑.

ASFV疫苗開發(fā)需要特別注意保護(hù)性免疫的血清群特異性，因為血清群內(nèi)的病毒可以相互交叉保護(hù)，這對防止ASFV感染非常重要[59-61].Monteagudo et al[62]研究指出，CD2v基因在減弱病毒毒力和防止宿主感染方面起著關(guān)鍵作用，以CD2v缺失的BA71分離株制成的減毒活疫苗既可以誘導(dǎo)對同源強毒株BA71攻擊的完全保護(hù)機制，又能產(chǎn)生對異源Georgia毒株和E75毒株攻擊的交叉保護(hù)作用.而Georgia分離株缺失CD2v對病毒毒力和免疫保護(hù)均無作用[63]；研究也發(fā)現(xiàn)，Congo-a分離株缺失CD2v并不影響病毒的體外復(fù)制能力，但不能對強毒株Congo-a的感染起到保護(hù)作用[64].這些與Monteagudo et al[62]的研究結(jié)果不符，推測可能與ASFV的遺傳變異有關(guān).

MGF360/505基因單缺失的Georgia分離株擁有與親代病毒一樣的復(fù)制力且毒力完全減弱，能誘導(dǎo)針對同源Georgia強毒株攻擊的完全保護(hù)機制[41]；但MGF360/505和9GL多基因缺失的分離株雖然安全性有所提高，但因在豬巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力降低而不會誘導(dǎo)針對親本Georgia強毒株攻擊的保護(hù)機制[65].研究發(fā)現(xiàn)，9GL、CD2v、EP153R多基因共缺失后，Georgia分離株的免疫保護(hù)作用不如9GL單基因缺失株[66].還有研究指出，BA71毒株同時缺失CD2v、EP153R或CD2v、UK基因，未實現(xiàn)體內(nèi)減毒和誘導(dǎo)免疫保護(hù)機制[67].這些試驗結(jié)果表明，在通過基因缺失制備疫苗時，不僅要減弱病毒毒力還要保持病毒的復(fù)制能力，才能保證減毒株具備有效的免疫原性，達(dá)到有效的免疫保護(hù)效果.

2.3 ASFV的免疫抑制因子

國內(nèi)外研究表明，在感染病毒期間，pA528R通過靶向p65激活和核易位抑制NF-κB信號傳導(dǎo)，從而抑制IFN-β的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞抗病毒活性[68].pA224L和pA179L通過抑制宿主細(xì)胞caspase活性和細(xì)胞凋亡促進(jìn)病毒粒子的產(chǎn)生[31-32]；EP153R能降低宿主TP53的反式激活活性，從而抑制細(xì)胞凋亡[33].此外，感染早期，pL83L通過與宿主IL-1β相互作用并干擾其功能而破壞宿主的先天免疫反應(yīng)[37].F317L也是對抗宿主先天免疫反應(yīng)的因子，其通過破壞NF-κB活性抑制NF-κB通路的激活，從而降低各種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[69].感染后期，CD2v通過抑制淋巴細(xì)胞增殖及促進(jìn)病毒復(fù)制和感染而發(fā)揮免疫抑制作用[70].pA238L對活性T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)基因的核因子鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶功能和宿主NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性有抑制作用[71]；I226L、A151R、NP419L、QP383R能抑制先天免疫相關(guān)基因和細(xì)胞因子的表達(dá)[34]；I329L是功能性病毒TLR3的同源物，可在TRIF水平上抑制IFN的表達(dá)[35]；DP96R能抑制cGAS-STING-TBK1信號通路中IFN-α的產(chǎn)生及NF-κB信號傳導(dǎo)，這在病毒免疫逃避中起重要作用[38].這些說明ASFV感染會導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制.但目前人們對免疫抑制機制仍知之甚少，參與免疫抑制的病毒因子還有哪些，以及刪除這些抑制因子是否會影響病毒的復(fù)制能力，這些都將是未來ASFV減毒活疫苗研究的重要內(nèi)容.

3 總結(jié)與展望

ASFV感染野豬和家豬，導(dǎo)致死亡率高達(dá)100%[72].但由于ASFV的復(fù)雜性和基因多樣性以及有關(guān)其保護(hù)性免疫研究的缺乏，目前尚無有效、安全的ASFV疫苗[73].今后不僅要加強對毒力關(guān)鍵基因的研究，包括控制ASFV復(fù)制、參與宿主免疫抑制的病毒基因，還要關(guān)注關(guān)鍵基因功能與細(xì)胞免疫和體液免疫機制的聯(lián)系，從而既能實現(xiàn)ASFV減毒活疫苗體內(nèi)減毒，減少副作用，又能誘導(dǎo)有效的免疫保護(hù)機制.

細(xì)胞免疫在免疫保護(hù)中起著至關(guān)重要的作用.已有研究指出，大多數(shù)因急性感染而死亡的病例都是由炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴引起的感染性急性呼吸窘迫綜合征和敗血癥等多種疾病導(dǎo)致的[74-75].研究表明，炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴是引起ASFV感染病癥的重要原因[76].因此，通過控制ASFV感染后產(chǎn)生的細(xì)胞因子抵抗ASFV感染，成為今后研究的重要方向之一.此外，VN/QP-ASFV1(2019)毒株中已確定的參與宿主機體免疫調(diào)控的功能蛋白，都是ASFV的重要保護(hù)性抗原，但有關(guān)其具體免疫機制的研究尚不完善，今后需繼續(xù)探明更多刺激T細(xì)胞免疫的關(guān)鍵抗原，明確其免疫保護(hù)機制，為開發(fā)新型有效且安全的ASFV減毒活疫苗奠定基礎(chǔ).

野豬相對于家豬更容易在ASFV感染中存活下來，說明野豬體內(nèi)可能存在著家豬沒有或表現(xiàn)較弱的抗ASFV感染的機制，因此，學(xué)者們圍繞家豬和野豬開展了免疫方面的對比研究，并取得了一些成果.如：家豬在被強毒力Armenia08分離株感染后，淋巴細(xì)胞減少，血液和淋巴器官均無CD8+T細(xì)胞增殖而迅速死亡，野豬的CD8+T細(xì)胞則快速被激活，但依舊表現(xiàn)出嚴(yán)重的急性致死性癥狀[77]，表明野豬中的T細(xì)胞對高毒力ASFV感染產(chǎn)生了細(xì)胞毒性反應(yīng)，只是未起到保護(hù)作用.中等毒力“Estonia 2014”分離株感染家豬和野豬后，家豬體內(nèi)產(chǎn)生了保護(hù)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，T細(xì)胞的活化和持續(xù)增殖降低了家豬死亡率，而該毒株對野豬的毒力更高，野豬表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床癥狀[78]；與家豬相比，野豬的γδ T細(xì)胞反應(yīng)更明顯，野豬病情加重可能是由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)增強，縮短了炎癥反應(yīng)[79].調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)能夠特異性地抑制抗病毒反應(yīng)，提示該調(diào)節(jié)反應(yīng)可能是ASFV逃避宿主免疫的方式，且該免疫逃避方式在野豬中比家豬中更為明顯.因此，圍繞ASFV減毒活疫苗在家豬與野豬中的作用開展對比研究，將有可能探明野豬體內(nèi)的抗病毒機制.