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復合乳酸菌發(fā)酵紅茶湯香氣成分及活性因子變化規(guī)律

2022-11-29 03:07陳清愛林湘旋韓金志
關鍵詞:茶湯乳酸菌揮發(fā)性

陳清愛, 林湘旋, 陳 馳, 韓金志

(1.福建商學院旅游與休閑管理學院,福建 福州 350012;2.福州大學生物科學與工程學院,福建 福州 350108;3.福建農業(yè)職業(yè)技術學院現代農業(yè)工程學院,福建 福州 350007)

乳酸菌作為一類重要的實際安全(GRAS)級食品微生物廣泛應用于發(fā)酵食品,具有抗菌防腐、賦予食品特殊風味以及提高營養(yǎng)品質等功能[1].目前用于生產發(fā)酵食品的乳酸菌有20余種,如酸奶的生產會用到保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌,德式乳桿菌用于發(fā)酵畜產品,干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌用于生產乳酪等[2],植物乳桿菌是酸菜發(fā)酵生產中的優(yōu)勢菌株[3].其中,植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌通??勺鳛榘l(fā)酵劑用于生產各類發(fā)酵食品,其代謝產生的乳酸和過氧化氫,可調節(jié)腸道pH,活化腸道中的過氧化酶—硫氰酸鹽反應體系,具有抑制病原菌、調節(jié)腸道菌群等功能;此外,乳酸菌菌體細胞可與膽固醇、膽鹽通過共沉淀作用去除體外膽固醇的主要方式發(fā)揮降血脂功能[4];同時,復合乳酸菌對人體免疫系統(tǒng)有一定的調控作用,如促進腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育、誘導T細胞的分化[5].

中國是世界紅茶的發(fā)源地,也是紅茶的最大出產國,紅茶以其獨特的香氣與滋味深受消費者青睞.當前已在紅茶中鑒定出400多種香氣物質;此外,紅茶含有多種功能性活性成分和滋味物質,已分離鑒定出700多種已知化合物,包括蛋白質(20%~30%)、茶多酚(18%~36%)、糖類(20%~25%)、氨基酸、生物堿、芳香物質和維生素等[6].當前,發(fā)酵茶飲料因其獨特的風味與良好的益生功能,已成為市場消費的熱點產品,并引起眾多科研工作者關注.紅茶富含多種營養(yǎng)成分,可為微生物發(fā)酵提供豐富的碳源、氮源和生長因子,同時也為發(fā)酵茶飲料的獨特風味提供物質基礎或前體;同時,微生物發(fā)酵使茶飲料中的酚氨比下降、芳香物質增加,并積累大量初級或次級代謝產物,從而改善茶湯風味,提高益生功能[7].發(fā)酵茶飲料由于其獨特的風味和保健功能而受到廣大消費者喜愛,國內也有越來越多針對發(fā)酵茶飲料的工藝開發(fā)和功能性研究報道.如劉佳奇等[8]用植物乳桿菌發(fā)酵正山小種紅茶和鐵觀音烏龍茶的茶湯,確定最優(yōu)發(fā)酵工藝,并對發(fā)酵前后的茶多酚、咖啡因、氨基酸含量及抗氧化能力、香氣成分進行分析,研制出風味獨特的發(fā)酵茶飲料.當前雖然已有乳酸菌發(fā)酵茶飲料的相關研究,但對于復合乳酸菌發(fā)酵紅茶飲料的香氣成分和活性因子等變化規(guī)律缺少系統(tǒng)研究,且在發(fā)酵過程中茶湯中香氣成分和活性因子的組成結構以及各組分含量的變化規(guī)律尚不明確,無法為乳酸菌發(fā)酵茶飲料工業(yè)化生產提供技術支持.

本研究以福建閩北小種紅茶為原料,以植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌作為復合發(fā)酵菌株,對發(fā)酵紅茶湯香氣成分和活性因子在不同發(fā)酵階段的變化規(guī)律進行探討,旨在為乳酸菌發(fā)酵紅茶飲料在生產中實現發(fā)酵過程控制和功能性研究提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 紅茶(正山小種)購自福建茶葉進出口有限公司.

MRS培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;42種游離氨基酸混合標準品購自德國曼默博爾公司;8種有機酸混合標準品購自北京北方偉業(yè)計量技術研究院;γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)標準品、L-茶氨酸標準品購自美國Parliament St公司;咖啡因標準品購自壇墨質檢科技股份有限公司;乙腈(色譜級)購自德國默克集團有限公司;2-辛醇(純度99.8%)購自德國Dr.Ehrensorfer公司;植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌由福州大學生物科學與工程學院實驗室保藏.

1.1.2 儀器與設備 主要儀器與設備有5977A氣相色譜質譜聯用儀(美國安捷倫科技有限公司)、SPX-150BⅢ恒溫生化培養(yǎng)箱(黃驊菲斯福實驗儀器有限公司)、反相C18液相色譜柱(4.6 mm×200 mm,美國安捷倫科技有限公司)、LDZF-50L-Ⅲ立式高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)、MP511 pH計(上海三信儀表廠)、Fresco 17高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)、Carbo-Pac PA20色譜柱(3 mm×150 mm,美國戴安公司)、A300氨基酸自動分析儀(德國曼默博爾公司)、UV-1100紫外可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司)、 PDMS固相微萃取頭(30 μm,美國Supelco公司)、Dionex-5500超高相離子交換色譜儀(美國戴安公司)、57330-U SPME手動進樣柄(美國Supelco公司).

1.2 樣品制備

1.2.1 待接菌種的制備 將冷凍保存的植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌(體積比為1∶1)進行多次MRS培養(yǎng)基活化、復壯培養(yǎng).取一定量的菌液進行離心操作,離心完成后去除上清液,用生理鹽水潤洗3次,潤洗后以生理鹽水作為參比溶液.將菌液光密度(D600 nm)調整至0.5~0.6,等待接菌[9].

1.2.2 復合乳酸菌發(fā)酵紅茶湯的制備 在10 g干燥紅茶中加入2 L純凈水,煮沸保持5 min后,加入10 g葡萄糖,溶解并過濾除渣.取上清茶湯分裝于絲口瓶中,于115 ℃條件下高壓滅菌20 min,待其冷卻至室溫,加入0.5%(體積比)植物乳桿菌和0.5%(體積比)發(fā)酵乳桿菌的生理鹽水菌懸液(D600 nm為0.5~0.6),于37 ℃條件下恒溫靜置發(fā)酵.試驗設置3個平行.

1.3 指標測定

1.3.1 復合乳酸菌活菌數和pH的測定 分別在紅茶湯發(fā)酵0、2、4、8、12、18、24、36、48、72、96 h時取樣,樣品經生理鹽水梯度稀釋后,涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進行菌落計數.同時分別在紅茶湯發(fā)酵0、24、48、72、96 h時取樣,樣品于10 000×g離心5 min,取上清測定樣品的pH.

1.3.2 單糖含量的測定 按文獻[10]的方法檢測發(fā)酵紅茶湯中的單糖含量.分別在紅茶湯發(fā)酵0、24、48、72、96 h時取樣,樣品經15 000×g離心10 min后,收集上清,過0.22 μm濾膜.取適量上清用超純水稀釋100倍后,采用超高相離子交換色譜系統(tǒng)和脈沖安培檢測器進行檢測.以0.02%(質量比)NaN3為流動相,采用Carbo-Pac PA20色譜柱(3 mm×150 mm)檢測.檢測條件:柱溫30 ℃、進樣量10 μL、流動相流速0.5 mL·min-1.

1.3.3 揮發(fā)性香氣成分含量的測定 按文獻[11]的方法檢測發(fā)酵紅茶湯中的揮發(fā)性香氣成分含量.分別在紅茶湯發(fā)酵0、24、48、72、96 h時取樣,取5 mL樣品置于12 mL頂空萃取瓶中,依次加入1 g NaCl、10 μL 10 mg·mL-12-辛醇(內標)[12],混勻,置于40 ℃水浴磁力攪拌器中,于600 r·min-1條件下溫育20 min后插入固相微萃取針,壓出萃取纖維,使其固定在距離液面0.5~1.0 cm處,吸附萃取30 min后收回萃取纖維,拔出萃取針并插入氣相色譜—質譜聯用儀中進樣分析.采用DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)檢測,檢測條件[13-14]:進樣口溫度250 ℃;柱溫箱起始溫度40 ℃,保留8 min,然后以4 ℃·min-1升溫至150 ℃,再以20 ℃·min-1升溫至250 ℃,保留5 min;載氣為99.999%高純度氦氣,流速1 mL·min-1;離子源溫度為230 ℃,電離方式為EI,電離能量為70 eV,接口溫度為250 ℃,四級桿溫度150 ℃,選擇SCAN模式為掃描方式進行定性分析,離子碎片的掃描范圍為30~500 m·z-1,溶劑延遲時間為2.5 min.選擇匹配度≥85,計算揮發(fā)性香氣成分含量.

揮發(fā)性香氣成分含量=(各揮發(fā)性香氣成分峰面積×2-辛醇含量)/2-辛醇峰面積.

1.3.4 游離氨基酸含量的測定 分別在紅茶湯發(fā)酵0、24、48、72、96 h時取樣,將400 μL經0.45 μm過濾處理的樣品與100 μL 10%磺基水楊酸混合均勻,置冰箱(2~8 ℃)中冷藏靜置過夜.于15 000×g條件下離心15 min,取上清再次以15 000×g離心5 min.樣品按1∶2的體積比稀釋后過0.22 μm濾膜,使用氨基酸自動分析儀檢測游離氨基酸含量.

1.3.5 有機酸含量的測定 按文獻[15-16]的方法測定發(fā)酵紅茶湯中的有機酸含量.分別在紅茶湯發(fā)酵0、24、48、72、96 h時取樣,樣品在15 000×g條件下離心5 min,過0.22 μm濾膜,使用高效液相色譜儀進行檢測.檢測條件:流動相為0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉(pH 2.7),過0.45 μm濾膜,超聲處理20 min;反相C18液相色譜柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)的柱溫27 ℃;紫外檢測器的檢測波長為210 nm;進樣量為20 μL,流動相流速為0.8 mL·min-1.

1.3.6 活性因子含量的測定 分別在紅茶湯發(fā)酵0、24、48、72、96 h時取樣.GABA含量參照QB/T 4587—2013[17]的方法測定;L-茶氨酸含量參照GB/T 23193—2017[18]的方法測定;茶多酚含量參照GB/T 21733—2008[19]的方法測定;咖啡因含量參照GB 5009.139—2014[20]的方法測定.

1.4 數據處理

數據采用SPSS Statistics 26.0進行分析,使用軟件Origin 2018和Hypertext Markup Language 1.0.3.7-Illustrator繪圖.

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵紅茶湯復合乳酸菌活菌數和pH的變化

圖1 不同發(fā)酵階段紅茶湯中復合乳酸菌活菌數和pH的變化Fig.1 Changes in pH value of black tea infusion and the number of viable compound Lactobacillus at different fermentation stages

在發(fā)酵過程中紅茶湯pH和復合乳酸菌活菌數的變化是判斷發(fā)酵進程的重要指標.圖1顯示,經復合乳酸菌發(fā)酵0~96 h,紅茶湯的pH由4.69逐步下降至3.78,說明乳酸菌代謝產酸.紅茶湯發(fā)酵0~18 h,乳酸菌能夠利用茶湯中的營養(yǎng)物質進行繁殖,其活菌數略有上升;發(fā)酵24~96 h,乳酸菌活菌數呈下降的趨勢,這可能與茶湯中營養(yǎng)物質濃度低且含有多酚、生物堿等抑菌物質對乳酸菌的生長繁殖產生逆境脅迫有關.

2.2 發(fā)酵紅茶湯單糖含量的變化

單糖是重要的可發(fā)酵碳水化合物,是乳酸菌發(fā)酵過程中的主要碳源物質.由表1可見,在紅茶湯發(fā)酵的過程中共檢6種單糖,包括葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和木糖.其中,葡萄糖含量在發(fā)酵0~24 h呈上升的趨勢,這可能是由于復合乳酸菌在繁殖過程中不僅能夠消耗葡萄糖,同時也能分解多糖分子產生葡萄糖;果糖和甘露糖含量的變化趨勢相似,都是先下降而后略有上升,這意味著它們在發(fā)酵過程中處于動態(tài)變化狀態(tài);半乳糖含量較少,變化不顯著;發(fā)酵48~96 h,乳酸菌在代謝中產生少量鼠李糖;木糖伴隨著發(fā)酵進程而逐步被消耗,其含量在發(fā)酵24 h后由0.74 mg·mL-1被完全消耗至0 mg·mL-1.可見,茶湯中的葡萄糖、果糖、甘露糖和木糖是乳酸菌發(fā)酵過程中的主要碳源物質,且代謝過程中不產生木糖.

表1 不同發(fā)酵階段紅茶湯中單糖含量的變化1)Table 1 Changes in contents of monosaccharides in black tea infusion at different fermentation stages

2.3 發(fā)酵紅茶湯揮發(fā)性香氣成分的變化

圖2 不同發(fā)酵階段紅茶湯中揮發(fā)性香氣成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile aromatic components in black tea infusion at different fermentation stages

揮發(fā)性香氣成分的豐度與結構組成是評價發(fā)酵紅茶湯品質的關鍵指標之一.氣相色譜—質譜總離子流圖(圖2)顯示,復合乳酸菌發(fā)酵紅茶湯中的揮發(fā)性物質組成及含量在不同發(fā)酵階段存在差異,且隨著發(fā)酵時間而處于動態(tài)變化過程,但經過發(fā)酵后,茶湯香氣成分的豐度均顯著增加.由不同發(fā)酵階段揮發(fā)性香氣成分組成熱圖(圖3)和附件表1(掃OSID碼可見)可知,復合乳酸菌發(fā)酵紅茶湯與未發(fā)酵組相比較,揮發(fā)性香氣成分數量明顯增加,香氣物質組成隨著發(fā)酵時間呈動態(tài)變化.未發(fā)酵時,茶湯中的香氣成分主要為D-檸檬烯、苯乙醛、反式β-羅勒烯、甲酸辛酯、糠醛和松油醇等;發(fā)酵24 h, 香氣成分主要為β-羅勒烯、苯甲醛、月桂烯、吲哚、3,5-二甲基苯甲醛、3-己烯-1-醇、1-甲基萘、2,4-二叔丁基苯酚和順-茉莉酮等;發(fā)酵48 h,香氣成分主要為糠醛、壬醛、松油醇、5-甲基-2-呋喃甲醛、α-亞乙基-苯乙醛、反-β-紫羅蘭酮、順-羅勒烯、順-3-壬烯-1-醇、2-甲基萘、3,6-壬二烯-1-醇、反-橙花叔醇、反-3-己烯-1-醇、乙酰苯、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、甲基苯甲醇、苯甲醛和檸檬醛等;發(fā)酵72 h,香氣成分主要為香葉醇、苯甲醛、檸檬醛、反-3-己烯-1-醇、乙酰苯、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、甲基苯甲醇、苯甲醛、檸檬醛、4-(2,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯-1-基)-3-丁烯-2-酮、順-2-己烯-1-醇、水楊酸甲酯、2,4-二甲基苯甲醛、乙酰呋喃、苯甲醇、2-十一酮、1-庚醇、苯乙醇、苯乙烯、苯乙腈、月桂烯和吲哚等;發(fā)酵96 h,香氣成分主要為香葉醇、D-檸檬烯、β-環(huán)檸檬醛、2-莰烯、順-2-己烯酸、β-羅勒烯、苯甲醇、2-十一酮、1-庚醇、苯乙醇和氯甲酸辛酯等.由此可見,復合乳酸菌發(fā)酵紅茶湯具有更加豐富的風味物質,且發(fā)酵72 h的香氣成分最多.在整個發(fā)酵過程中,隨著時間的延長,香葉醇、反-3-己烯-1-醇、2-十一酮、1-庚醇、苯乙醇、氯甲酸辛酯和十三烷酮等含量呈逐漸增加的趨勢,這些揮發(fā)性香氣成分的增加可進一步提升茶湯香氣,并賦予茶湯的花香和水果甜香;而壬醛和松油醇等含量隨著發(fā)酵時間的延長呈逐漸下降的趨勢,則可減少茶湯中的青草味.

圖3 不同發(fā)酵階段紅茶湯中揮發(fā)性香氣成分組成熱圖Fig.3 Heat map of aromatic components in black tea infusion at different fermentation stages

2.4 發(fā)酵紅茶湯游離氨基酸含量的變化

圖4顯示,在紅茶湯發(fā)酵過程中共檢測出22種游離氨基酸,氨基酸的組成和含量在不同發(fā)酵階段均呈差異性變化.未發(fā)酵時,茶湯中的氨基酸組成以蘇氨酸、正亮氨酸、谷氨酸和β-丙氨酸等為主;發(fā)酵24 h,茶湯中的蘇氨酸、正亮氨酸、谷氨酸和β-丙氨酸含量持續(xù)下降,氨基酸組成以精氨酸、色氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和天冬酰胺為主;發(fā)酵48 h,氨基酸組成以纈氨酸、絲氨酸和天冬酰胺為主;發(fā)酵72 h,氨基酸組成以羥基脯氨酸為主,其他氨基酸含量持續(xù)下降;發(fā)酵96 h,氨基酸組成以乙醇胺、苯丙氨酸和肌氨酸為主.不同種類游離氨基酸呈現出酸、咸、苦、鮮等滋味[21].茶湯經乳酸菌發(fā)酵作用后,苦味氨基酸,如色氨酸、賴氨酸和精氨酸含量減少,這與已有的研究結果[22]一致.

2.5 發(fā)酵紅茶湯有機酸含量的變化

圖5顯示,在紅茶湯發(fā)酵各階段均檢測出8種有機酸.發(fā)酵0~96 h,茶湯中的有機酸含量總體呈增加的趨勢,有機酸組成及含量在不同發(fā)酵階段呈差異性變化.發(fā)酵24 h,茶湯中的酒石酸、甲酸、乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸含量呈增加的趨勢(其中,乳酸和檸檬酸含量增幅顯著),蘋果酸和丙酸含量略有減少;發(fā)酵48 h,茶湯中的甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸含量增加(其中,乙酸和琥珀酸含量增幅顯著),而酒石酸、檸檬酸和丙酸含量減少(其中,檸檬酸含量顯著下降);發(fā)酵72 h,茶湯中的酒石酸、乳酸、乙酸、琥珀酸和丙酸含量有所增加(其中,乳酸、乙酸和丙酸含量顯著增加),而甲酸、蘋果酸和檸檬酸含量減少(其中,檸檬酸含量顯著下降);發(fā)酵96 h,茶湯中的酒石酸含量有所增加,乙酸、琥珀酸和丙酸含量呈下降的趨勢(其中,乙酸和琥珀酸含量下降幅度明顯),其他有機酸含量基本不變.這表明乳酸菌發(fā)酵有利于有機酸的積累,對于改善茶湯的感官品質有較好的作用.

圖4 不同發(fā)酵階段紅茶湯中游離氨基酸含量的變化Fig.4 Changes in contents of amino acids in black tea infusion at different fermentation stages

2.6 發(fā)酵紅茶湯活性因子含量的變化

紅茶湯中的GABA、茶多酚、L-茶氨酸和咖啡因等物質具有重要的生理活性功能,在茶湯發(fā)酵過程中,這些活性因子呈一定程度的變化.圖6顯示:發(fā)酵0~96 h,茶湯中的GABA含量呈先遞增后下降的趨勢;發(fā)酵72 h,GABA含量達到峰值,為0.649 mg·mL-1.研究表明:GABA由谷氨酸在谷氨酸脫羧酶(GAD)的作用下合成[23];乳酸菌發(fā)酵可增加發(fā)酵谷物中的GABA含量,可顯著提高奶酪和酸奶中的GABA含量[24].發(fā)酵24 h,茶湯中的茶多酚含量無明顯變化,此時的茶多酚含量可達到198.234 mg·mL-1,但隨著發(fā)酵時間的延長呈較明顯的下降趨勢,發(fā)酵96 h時的茶多酚含量下降為134.484 mg·mL-1.發(fā)酵后茶多酚含量略有下降,可能是茶多酚在發(fā)酵過程中發(fā)生一系列的生化反應轉化為茶黃素和茶褐素所致[25].L-茶氨酸含量隨著發(fā)酵時間的延長呈較緩慢的下降趨勢,未發(fā)酵時的含量最多,發(fā)酵48 h時的含量最少.L-茶氨酸含量經乳酸菌發(fā)酵后有所下降,這可能是L-茶氨酸作為一種能源被乳酸菌利用或者轉化為D-茶氨酸所致.在整個發(fā)酵過程中,茶湯中的咖啡因含量基本保持不變,維持在0.163~0.168 mg·mL-1.

圖6 不同發(fā)酵階段紅茶湯中活性因子含量的變化Fig.6 Changes in contents of bioactive factors in black tea infusion at different fermentation stages

3 結論

乳酸菌發(fā)酵紅茶飲料不僅可賦予紅茶飲料新的風味與口感,同時可將乳酸菌的益生功能與紅茶的健康功能相結合.本研究以正山小種紅茶為原料制成紅茶湯,以植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌作為復合發(fā)酵菌株,對不同發(fā)酵階段茶湯中的還原糖、揮發(fā)性香氣成分、游離氨基酸、有機酸、GABA、茶多酚、L-茶氨酸和咖啡因等含量的變化過程進行分析,闡釋了復合乳酸菌發(fā)酵紅茶湯在不同發(fā)酵階段的香氣成分和活性因子的變化規(guī)律.研究結果可為乳酸菌發(fā)酵茶飲料工業(yè)化生產的品質控制與功能性研究提供參考.

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