范鶴齡，朱清，孫雪冰，張麗，李長江，陳萍，黃小龍，張榮萍*

（1.海南大學熱帶作物學院，海口 570228；2.海南大學園藝學院，?？?570228；3.海南大學生命科學與藥學院，海口 570228）

微生物是土壤生物系統(tǒng)中最大的種群，直接驅(qū)動著土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)，在平衡土壤肥力、提高作物抗逆性、優(yōu)化土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量等方面發(fā)揮著重要作用[1]。土壤微生物在陸地生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學循環(huán)中還起著重要作用[2]。微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性影響著土壤物質(zhì)循環(huán)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，其豐富度和多樣性可影響作物生長發(fā)育[3]。土壤中細菌越多、真菌數(shù)量越少，土壤生態(tài)系統(tǒng)越好，群落結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，土壤的抗病能力越強[4]。目前，大量施用化肥會導致土壤pH下降，從而導致細菌群落豐度下降[5]；且現(xiàn)在的集約化農(nóng)業(yè)也使土壤生物多樣性下降，增加了蟲害爆發(fā)風險，嚴重威脅農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。長期施用農(nóng)藥會造成土壤脫水并破壞植物組織，過量的肥料也會污染環(huán)境[7]。而施用生物有機肥可以使土壤營養(yǎng)元素含量增加，提升土壤健康狀態(tài)，重塑微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[8]。生物有機肥還可以促進作物對氮磷鉀的吸收，減少病蟲害發(fā)生，從而減少殺蟲劑的使用，通過改善土壤和作物品質(zhì)等來推進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[9]。

在生物有機肥的制作中，對比自然發(fā)酵，添加微生物菌劑有利于增加肥料中的有益菌。將微生物菌劑加入有機肥料中進行混合堆肥可以提高作物產(chǎn)量[10]。農(nóng)用酵素是以植物為主要原料、添加或不添加輔料、經(jīng)微生物發(fā)酵制得的酵素產(chǎn)品，含有特定生物活性成分，可用于種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和土壤改良等[11]。目前農(nóng)用酵素已作為基肥、葉面肥、滴灌肥、生物農(nóng)藥和分解菌劑等廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[12]。細菌和真菌中的許多菌群已經(jīng)被證實為有益菌群，如細菌中厚壁菌門（Firmicutes）里的芽孢桿菌屬（Bacillus）和變形菌門（Proteobacteria）中的沙雷氏菌屬（Serratia）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、根瘤菌屬（Rhizobium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）及放線菌門（Actinobacteria）中的鏈霉菌屬（Streptomyces）；真菌中子囊菌門（Ascomycetes）里的白粉寄生孢屬（Ampelomyces）、盾殼霉屬（Coniothyrium）和木霉菌屬（Trichoderma）等，它們通過一系列復雜的反應來促進土壤養(yǎng)分含量、抑制病原菌，進而促進作物生長[13]。農(nóng)用酵素包含固態(tài)和液態(tài)2種形式，榕樹葉、青蒿莖葉、枇杷葉和木麻黃葉等制作的液態(tài)農(nóng)用酵素對辣椒和黃瓜生長及其土壤有顯著的改良促進作用[14]；花生秸稈和玉米秸稈制作的固態(tài)農(nóng)用酵素能夠使辣椒在低溫脅迫下保證產(chǎn)量[15]。然而，國內(nèi)外對農(nóng)用酵素中微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)鮮有報道。因此，本研究從農(nóng)用酵素的原材料和制作方式出發(fā)，利用高通量測序技術(shù)和生物信息分析技術(shù)，闡明不同農(nóng)用酵素的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征，為農(nóng)用酵素的高效利用和深入開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

設計液態(tài)和固態(tài)2種發(fā)酵方式，選用不同的植物秸稈作為原材料，具體材料種類詳見表1。島本酵素菌：粉劑，由昆明邦特生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)，有效活菌≥0.50億·g-1。枯草芽孢桿菌和哈茨木霉菌：由山東綠隴生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，有效活菌數(shù)400億·g-1。酵素制作方法參考島本農(nóng)法[16]，其中液態(tài)農(nóng)用酵素的制作為：原材料6 kg（干重，通過計算不同原材料的含水量，以其干物質(zhì)量計算），麥麩1.5 kg，酵素菌1.5 kg，水100 L，有氧發(fā)酵10 d；固態(tài)農(nóng)用酵素的制作為：原材料200 kg（干重，通過計算不同原材料的含水量，以其干物質(zhì)量計算），麥麩50 kg，羊糞40 kg，紅糖1 kg，酵素菌5 kg，保濕有氧發(fā)酵90 d。每種酵素重復3次。以上原材料均使用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廢棄秸稈或者自然生長的雜草，以實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2種類型的酵素均等待發(fā)酵完全后進行取樣混合后送測。

表1 農(nóng)用酵素的劑型和原材料Table 1 Form and raw materials of agricultural Jiaosu

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備取制作好的發(fā)酵產(chǎn)物3~5 g，液氮速凍30 min，然后放至-80℃冰箱冷凍，用于后續(xù)高通量測序。

1.2.2 樣品測序過程用微生物DNA提取試劑盒提取微生物DNA。然后采用引物SSU0817F(5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’)和1196R(5’-TCTGGACCTGGTGAG TTTCC-3’)對真菌ITS1區(qū)進行擴增；采用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對細菌16s rDNA V3~V4區(qū)進行擴增。PCR采 用20μL體系，包括5×FastPfu Buffer 4μL，dNTPs（2.5 mmol·mL-1）2μL，前后引物各0.8μL(5μmol·μL-1)，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4μL，BSA 0.2μL，DNA 10 ng，最后用ddH2O補至20μL。PCR程序：95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，細菌進行28個循環(huán)，真菌進行36個循環(huán)；72℃10 min，10℃保溫。PCR結(jié)束后選取大小正確含量合適的PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗數(shù)據(jù)通過測序獲得，并在其微生物多樣性云分析平臺進行分析。操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚 類 使 用Uparse 7.0.1090；OTU統(tǒng)計使用Usearch 7.0；Alpha多樣性分析使用Mothur1 30.2；在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）查詢微生物分類關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)用酵素樣品的高通量測序數(shù)據(jù)

對原始數(shù)據(jù)進行篩選得出優(yōu)化序列,在97%的相似水平下進行序列統(tǒng)計。由圖1和表2可知，菌劑中細菌和真菌的序列長度分別為401~460和381~420 bp；液態(tài)農(nóng)用酵素中細菌和真菌的序列長度分別為421~460和381~420 bp；固態(tài)農(nóng)用酵素中細菌和真菌的序列長度分別為421~460和381~420 bp。

表2 不同農(nóng)用酵素的高通量測序數(shù)據(jù)Table 2 High-throughput sequencing data of different Jiaosu for agriculture

圖1 優(yōu)化后農(nóng)用酵素菌群的序列長度Fig.1 Length distribution of the optimized sequence of Jiaosu for agriculture

2.2 農(nóng)用酵素樣品的稀釋性曲線

OTU稀釋曲線是從不同處理中隨機抽取一定數(shù)量的個體，然后統(tǒng)計這些個體代表的物種的數(shù)目，并且以個體數(shù)和物種數(shù)來構(gòu)建曲線，比較不同處理間物種的豐富度[17]。在OTU稀釋曲線中，當曲線急速上升時，表明有大量物種被發(fā)現(xiàn)；當曲線趨近于平緩時，表明酵素有機肥中的物種不會隨著測序數(shù)量的增加而增加[18]。從圖2可以看出，高通量測序深度合理，可以反映樣品中物種組成，較準確反映農(nóng)用酵素中微生物的豐富度和多樣性。

圖2 農(nóng)用酵素菌群的稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of microbial community of Jiaosu for agriculture

2.3 不同農(nóng)用酵素的微生物物種豐度和多樣性比較

由圖3可知，固態(tài)農(nóng)用酵素中細菌和真菌的OTU數(shù)量極顯著高于液態(tài)農(nóng)用酵素和微生物菌劑；液態(tài)農(nóng)用酵素中細菌的OTU數(shù)量與菌劑差異不顯著，而真菌的OTU數(shù)量顯著低于菌劑。由此表明，固態(tài)有利于提高農(nóng)用酵素的微生物物種多樣性。

圖3 不同劑型的農(nóng)用酵素的OTU數(shù)量Fig.3 Number of OTUs of different dosage forms of Jiaosu for agriculture

Alpha多樣性分析可估算環(huán)境群落物種的豐度和多樣性，其中Shannon指數(shù)越大，群落多樣性越高[19]。在島本酵素菌中，細菌的Shannon指數(shù)高于羊糞菌，Ace指數(shù)高于牛糞菌，Chao 1指數(shù)高于牛、羊糞菌；真菌的Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)高于羊糞菌，但低于牛糞菌。在液態(tài)農(nóng)用酵素中，細菌和真菌的多樣性因原材料的不同存在較大差異，細菌和真菌Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao 1指數(shù)的變異系數(shù)分別為55.31%、76.72%、74.96%、74.13%和68.76%、26.02%、69.02%、69.86%；細菌中，L4（木麻黃）的Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最?。籐1（玉米秸稈）的Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)最高；真菌中，L3（黃蒿）的Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最?。籐1（玉米秸稈）的Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)最高。在固態(tài)農(nóng)用酵素中，不同酵素中細菌和真菌的多樣性指數(shù)差別較小，細菌和真菌Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao 1指數(shù)的變異系數(shù)分別為4.86%、12.33%、11.91%和19.07%、10.12%、11.29%。綜上所述，島本酵素菌的細菌和真菌多樣性高于牛、羊糞菌；固態(tài)農(nóng)用酵素的真菌和細菌多樣性均高于液態(tài)農(nóng)用酵素；液態(tài)發(fā)酵受原材料的影響較大，固態(tài)發(fā)酵較為穩(wěn)定，受原材料影響小（表3）。

表3 不同農(nóng)用酵素的多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of different Jiaosu for agriculture

2.4 不同農(nóng)用酵素的微生物群落結(jié)構(gòu)比較

2.4.1 細菌群落結(jié)構(gòu)比較分析在細菌的門水平上，將相對豐度小于1%的歸于其他；在細菌的屬水平上，將相對豐度小于5%的歸于其他。由圖4和5可知，不同菌劑、不同劑型和不同材料農(nóng)用酵素的細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖4 不同農(nóng)用酵素在門水平上的細菌群落豐度Fig.4 Abundance of bacterial community of different Jiaosu for agriculture at phylum level

對于生物菌劑，在門水平上，B1（酵素菌）、B3（枯草芽孢桿菌）和B5（羊糞菌）中厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度為79.4%、97.7%、95.8%，為優(yōu)勢菌門；B4中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度為71.5%，為優(yōu)勢菌門。在屬水平上，B1中芽孢桿菌屬（Bacillus）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）的相對豐度較高，分別為42.9%和29.3%；B3中芽孢桿菌占絕對優(yōu)勢，相對豐度為96.4%；B4（牛糞菌）中根霉菌屬（Rhizomicrobium）的相對豐度較高，為33.3%；B5中norank_f_Bacillaceae的相對豐度為45.6%。

圖5 不同農(nóng)用酵素在屬水平上的細菌群落豐度Fig.5 Abundance of bacterial community of different Jiaosu for agriculture at genus level

對于液態(tài)農(nóng)用酵素，不同原材料制成的液態(tài)農(nóng)用酵素間細菌組成差異較大（圖4和5）。在門水平，L1、L2、L5的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，相對豐度分別為64.6%、98.9%、97.4%；L3、L6、L7、L8的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門（Bacteroides），相對豐度分別為51.9%、77.0%、61.2%、77.0%；L4的優(yōu)勢菌門為變形菌門，相對豐度為62.6%。

對于固態(tài)農(nóng)用酵素，不同固態(tài)農(nóng)用酵素的群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性（圖4和5）。在門水平上，厚壁菌門的相對豐度低于12.7%，變形菌門的相對豐度為26.0%~47.5%，擬桿菌門的相對豐度為9.4%~33.3%，放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度為10.7%~28.6%，綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度為5.7%~19.9%，酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度為1.4%~7.3%，螺旋體菌門（Saccharibacteria）的相對豐度為1.2%~3.3%。

綜上所述，在細菌群落結(jié)構(gòu)的組成上，液態(tài)農(nóng)用酵素由于原材料的不同差異較大，固態(tài)農(nóng)用酵素相似度較高，在群落組成上與添加的菌種（酵素菌）組成差異較大。

2.4.2 真菌群落結(jié)構(gòu)比較分析在屬和門水平上均將相對豐度小于5%的菌群歸于其他。由圖6和7可知，在門水平上，L4中unclassified_k_norank的相對豐度較高，為79.3%；其他處理的群落結(jié)構(gòu)相似，均表現(xiàn)為子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度較高，達82%以上。在屬水平上，B1（酵素菌）中unclassified_f_Trichocomaceae、曲霉菌屬（Aspergillus）、unclassified_o_Hy.pocreales、unclassified_p_Ascomycota和unclassified_o_Saccharomycetales的相對豐度較高，分別為7.0%、14.4%、25.2%、1.4%和46.3%；B2（哈茨木霉）中unclassified_o_Hy.pocreales占絕對優(yōu)勢，相對豐度為98.9%，純度較高；L1、L2、L5、L6、L7、L8中norank_o_Saccharomycetales的相對豐度較高，達73.3%以上；L4中unclassified_k_norank的相對豐度較高，為79.3%；固態(tài)農(nóng)用酵素的真菌群落在屬水平上具有較高的相似性，其中，unclassified_f_Trichocomaceae、曲霉菌屬（Aspergillus）、unclassified_p_Ascomycota和假埃希氏菌屬（Pseudallescheria）的相對豐度分別為9.5%~51.1%、2.9%~28.8%、3.6%~30.7%、1.6%~9.2%。綜上所述，農(nóng)用酵素中真菌的群落結(jié)構(gòu)在門水平上非常相似；在屬水平上，不同菌種、不同劑型之間差異較大，同一劑型不同材料間比較相似。

圖6 不同農(nóng)用酵素在門水平上的真菌群落豐度Fig.6 Abundance of fungal community of different Jiaosu for agriculture on phylum level

圖7 不同農(nóng)用酵素在屬水平上的真菌群落豐度Fig.7 Abundance of fungal community of different Jiaosu for agriculture on genus level

2.5 不同農(nóng)用酵素的微生物聚類分析

由圖8可知，基于門水平，細菌群落在0.2相似度下被分為5支，固態(tài)農(nóng)用酵素被聚在一起，液態(tài)農(nóng)用酵素被聚在不同的分支；真菌群落在0.4相似度下分為4支，液態(tài)農(nóng)用酵素除L4（木麻黃）外均被聚在一起，固態(tài)農(nóng)用酵素和B4（牛糞菌）、B5（羊糞菌）聚在一起。由此表明，不同固態(tài)農(nóng)用酵素的細菌和真菌具有相似的群落結(jié)構(gòu)；不同液態(tài)農(nóng)用酵素的細菌和真菌群落組成差異較大，均與菌種（酵素菌B1）間的相似度較低，表明原材料對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大于菌種。

圖8 不同農(nóng)用酵素細菌和真菌門水平群落結(jié)構(gòu)相似性聚類分析Fig.8 Cluster analysis of bacterial and fungal community structure similarity in different Jiaosu for agriculture

3 討論

生物有機肥可以通過對土壤微生物的調(diào)節(jié)來抑制病原菌。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)用酵素對灰霉病菌有較強的抑制作用，能夠作為一種生物農(nóng)藥使用；酵素中厚壁菌門和變形菌門的相對豐度較高，分別為72.8%和15.1%，與本研究酵素菌的細菌群落組成有一定的相似性。Tao等[21]證實生物有機肥對香蕉枯萎病的防治作用是由于生防菌改變了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。Zhang等[22]研究表明，添加含芽孢桿菌（Bacillus）的生物有機肥能夠減輕西瓜的連作障礙，促進西瓜生長。本研究也表明，芽孢桿菌屬是酵素菌種的優(yōu)勢菌屬。

生物有機肥還可以通過微生物調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì)來修復土壤，從而增強作物抗逆性。Lu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿地上將腐爛的稻草和生物有機肥混合施用可降低變形菌門的相對豐度，增加厚壁菌門的相對豐度，從而修復鹽堿地。本研究結(jié)果表明，液態(tài)農(nóng)用酵素中玉米、蓖麻、青蒿酵素的厚壁菌門相對豐度較高，推測該酵素可以用來修復鹽堿地。Azmat等[24]研究發(fā)現(xiàn)，加入菌劑的生物肥料和水楊酸共同施用可增強水稻抗旱性。張宇沖等[25]研究發(fā)現(xiàn)，施用生物有機肥能增加功能性有益細菌的含量，提高土壤細菌群落多樣性與豐富度，從而提升土壤酶活性和土壤肥力。以上研究表明，生物有機肥含有豐富的微生物菌群，能夠調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，修復土壤，促進作物養(yǎng)分吸收利用，增強作物抗逆性，減輕連作障礙等?？梢?，在生物有機肥中起作用的關(guān)鍵物質(zhì)是微生物菌群。因此，在生物有機質(zhì)肥的生產(chǎn)中添加菌劑更加有利于土壤改良和作物生長。本研究從細菌和真菌的多樣性和群落組成上闡述了不同農(nóng)用酵素的群落結(jié)構(gòu)，為農(nóng)用酵素的高效利用和開發(fā)奠定了理論基礎。

本研究表明，固態(tài)農(nóng)用酵素的細菌和真菌多樣性極顯著高于液態(tài)農(nóng)用酵素；液態(tài)農(nóng)用酵素的微生物多樣性和群落組成因原材料的不同差異較大；固態(tài)農(nóng)用酵素的微生物多樣性和群落組成較為穩(wěn)定，細菌的優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria，26.0%~47.5%）、擬 桿 菌 門（Bacteroides，9.4%~33.3%）和放線菌門（Actinobacteria，10.7%~28.6%），真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門（Ascomycetes）。微生物群落結(jié)構(gòu)和組成均因劑型和材料的不同而存在差異，影響程度為劑型>材料，多樣性表現(xiàn)為固態(tài)>液態(tài)。不同材料的農(nóng)用酵素對作物及土壤微生物群落改良的作用機理仍有待進一步探索。