張 強(qiáng)，周 鵬，劉昌來，余永帆，張 敏，楊甲定*

(1.南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153)

土壤鹽堿化是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的環(huán)境問題之一，既造成巨大的農(nóng)業(yè)、林業(yè)和園藝產(chǎn)業(yè)損失，也限制了野生植物種的分布[1]。全世界鹽堿土面積約為9.54×104萬hm2，而且還在繼續(xù)增長[2]；我國鹽堿土總面積約3 600萬 hm2，主要分布在東北、華北、西北內(nèi)陸地區(qū)、黃淮海平原以及長江以北的濱海地帶[3]，其中以北方內(nèi)陸的草甸鹽土和海岸沿線的濱海鹽土(灘涂)所占比例最大[4]。近年來隨著地下水過度開采導(dǎo)致海水倒灌，沿海鹽土面積呈現(xiàn)上升趨勢。江蘇省境內(nèi)分布有大量的沿海灘涂，約占全國灘涂總面積的25%，被視為江蘇省重要的后備土地資源[5]。但由于其土壤條件并不能直接用于農(nóng)林作物的栽培，灘涂需要采用工程、物理、化學(xué)、農(nóng)藝、生物等不同的措施進(jìn)行改良[6]，其中生物措施具有獨(dú)特的優(yōu)勢，即提高植物耐鹽性或培育耐鹽新品種，使之能在灘涂正常栽培生長，通過吸收土壤的鹽分改良灘涂土壤的物理化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)微生物和動物的定居而改善灘涂生態(tài)環(huán)境。因此耐鹽植物的選育、栽培與推廣正成為灘涂利用實(shí)踐的重要內(nèi)容。

由于不同區(qū)域?yàn)┩康臍夂?、環(huán)境等差異，通常需要檢測具有較高應(yīng)用潛力的鄉(xiāng)土植物或外來引種植物的耐鹽性，篩選出真正適合本地域?yàn)┩可L的耐鹽植物。1年生植物可通過比較植物分別在高鹽和對照條件下的生物量積累來評估其耐鹽性；但對木本植物，由于其相對較慢的生長速度，則可以利用一些簡便的生理指標(biāo)評估其耐鹽性[7]。紅果冬青(Ilexpurpurea)是在長江流域廣泛分布的鄉(xiāng)土樹種，因其秋冬季節(jié)鮮艷的果實(shí)而被用于園林綠化觀賞栽培，具有較強(qiáng)的抗風(fēng)和耐濕潮土壤的能力，但不耐長期淹水[8]；全緣冬青(I.integra)分布在我國東南浙江和福建的沿海地帶，在日本和朝鮮半島南部也有分布[9]，鑒于長期生長在高鹽貧瘠的濱海地帶，推測全緣冬青應(yīng)具有較高的耐鹽性，因此被作為江蘇灘涂栽培的備選引種植物之一。筆者前期選擇全緣冬青和紅果冬青作為測試對象，對其根系在外界NaCl處理下的生理變化進(jìn)行了檢測[10]，發(fā)現(xiàn)全緣冬青根系在鹽處理中積累的Na+相對較少、細(xì)胞膜脂過氧化程度相對較低，相比紅果冬青，全緣冬青根系具有較高的耐鹽性。但目前對兩種冬青的根系在分子水平的耐鹽機(jī)理卻鮮見報(bào)道。本研究在前期生理檢測的基礎(chǔ)上，對NaCl處理下兩種冬青根系的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了檢測和生物信息學(xué)分析比較，以期從分子水平對全緣冬青根系高耐鹽性的形成機(jī)理進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

將生長于苗圃的紅果冬青和全緣冬青的兩年生扦插苗(株高約50～60 cm)從地里帶根系挖出，用自來水洗去泥土后，移栽到1 L的塑料花盆(盆內(nèi)基質(zhì)為大田土壤和珍珠巖的等體積混合物，每盆1株植物)中。每種冬青各移栽75株，于南京林業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地(119°18′E, 31°06′N)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行栽培，用1/2濃度的霍格蘭德溶液從花盆基質(zhì)表層對植株進(jìn)行澆灌(每盆500 mL)，每4天澆灌1次，共5次。 隨后對植株進(jìn)行NaCl鹽脅迫處理，NaCl鹽溶液為1/2濃度的霍格蘭德溶液內(nèi)含250 mmol/L NaCl，在實(shí)驗(yàn)開始時(0 h)取樣，隨即每個花盆澆灌500 mL的鹽溶液3次(即0、24和48 h, 均在9:00—10:00完成)，使花盆內(nèi)基質(zhì)NaCl鹽溶液達(dá)飽和。

每種冬青在實(shí)驗(yàn)的0、1、6、24、72 h等時間點(diǎn)隨機(jī)選擇9株，隨機(jī)分成3組作為3個生物學(xué)重復(fù)。將每個重復(fù)的植株根系挖出，快速洗去粘附的基質(zhì)，剪取根系混合后再分成2部分，一部分凍存于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃保存，后用液氮冷凍研磨機(jī)磨成粉末作為鮮樣；另一部分在105 ℃烘箱內(nèi)烘烤3 h，然后在65 ℃下烘烤48 h后用普通電動磨樣機(jī)磨成粉末作為干樣。

1.2 總RNA的提取與檢測

基于前期根系生理指標(biāo)的檢測與分析，選擇兩種冬青經(jīng)0、6 (短期)和72 h(長期)鹽處理等3個時間點(diǎn)，共18份根系樣品提取總RNA。總RNA的提取使用北京天根生物技術(shù)有限公司的RNAprep Pure Kit RNA提取試劑盒抽提，操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 文庫構(gòu)建與測序

RNA樣品經(jīng)質(zhì)量檢測合格后由美吉生物公司(http://www.majorbio.com/)基于Illumina Novaseq 6000 測序平臺采用標(biāo)準(zhǔn)Illumina操作流程進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。將獲得的原始測序數(shù)據(jù)(raw data)用軟件SeqPrep 和Sickle進(jìn)行質(zhì)控純化，得到高質(zhì)量的純化數(shù)據(jù)(clean data)；隨后用Trinity軟件(V.2013-02-25)[11]對每種冬青的所有純化數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝，將來自同一基因的不同同源轉(zhuǎn)錄本中最長的成員作為一個“unigene”。

通過與六大數(shù)據(jù)庫(NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO 和 KEGG)比對進(jìn)行unigene的功能注釋，即預(yù)測其功能或參與的分子途徑。對轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測通過與植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB 4.0(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)比對完成。采用RSEM軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的定量，獲得基因的測序所得片斷數(shù)(read counts)，然后使用DESeq2差異分析軟件進(jìn)行鹽處理樣本與鹽處理前樣本間的基因差異表達(dá)分析，篩選出樣本間的差異表達(dá)基因，即以0 h鹽處理前的表達(dá)量為參照，篩選閾值為|log2(表達(dá)差異倍數(shù))|≥1且校正后P值(Padjust) < 0.05，獲得在鹽處理6和72 h后根系內(nèi)發(fā)生差異表達(dá)的基因。

1.4 基因差異表達(dá)分析及表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測

將兩種冬青根系中的差異表達(dá)基因相對于各自0 h表達(dá)的log2(表達(dá)水平變化)值導(dǎo)入MeV(Multiple Experiment Viewer 4.9.0)，以熱圖展示差異基因上調(diào)/下調(diào)表達(dá)的概況；利用美吉生物公司在線生信云平臺(https://cloud.majorbio.com/)，對每種冬青中的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，默認(rèn)當(dāng)Padjust< 0.05時，認(rèn)定此 KEGG 通路存在顯著富集，并選擇某些特定通路進(jìn)一步分析其基因表達(dá)水平趨勢，即以鹽處理前0 h表達(dá)為參照，計(jì)算log2(表達(dá)水平變化)，并根據(jù)基因注釋信息分析其在特定代謝途徑中的功能。

對每個用于RNA-Seq的RNA樣品，取500 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，北京)，稀釋10倍后用于熒光定量PCR檢測[12]。選取本研究重點(diǎn)關(guān)注的與甜菜紅素生物合成、亞油酸代謝、花生四烯酸代謝相關(guān)基因和過氧化氫酶基因共20個，根據(jù)各自的蛋白編碼區(qū)序列，用Primer3在線軟件(http://primer3.ut.ee)設(shè)計(jì)引物，引物長度為120～240 bp，引物序列見表1；qRT-PCR 檢測使用艾科瑞公司 的 SYBR Green Premix Pro Taq HS試劑盒，在QuantStudio3熒光定量PCR儀(Appliedbiosystems，Thermo Fisher, 美國)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；用 2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)水平，最后計(jì)算其log2值與相對應(yīng)的RNA-Seq表達(dá)水平(log2值)進(jìn)行對比。

表1 熒光定量PCR 引物

表1(續(xù))

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA測序與差異表達(dá)基因的篩選

對每種冬青各9個RNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序獲得的原始序列數(shù)據(jù) (raw reads)經(jīng)質(zhì)檢過濾，獲得各自的純化測序數(shù)據(jù)(clean reads)；隨后使用Trinity對全緣冬青的純化測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝，從全緣冬青中得到333 194個轉(zhuǎn)錄本(transcript)和239 429個unigene；從紅果冬青中得到196 173個transcript和129 073個unigene。

鑒于unigene作為最長的轉(zhuǎn)錄本，通常能更好地代表該基因的編碼信息，故筆者的分析以unigene為對象。如根系鹽處理6和72 h后差異表達(dá)基因的數(shù)量(圖1A)所示，全緣冬青鹽處理6 h的差異表達(dá)基因數(shù)量為2 616，鹽處理72 h為1 802；而紅果冬青該指標(biāo)在鹽處理6 h為1 831，鹽處理72 h為3 490。由于差異表達(dá)基因的篩選是以鹽處理前為對照，從差異表達(dá)基因數(shù)量可以初步判斷，全緣冬青根系對短期鹽處理(6 h)響應(yīng)迅速，差異表達(dá)基因數(shù)目較多，隨著鹽處理時間的延長，差異表達(dá)基因數(shù)目降低，轉(zhuǎn)錄組活性有向鹽處理前回歸的趨勢；而紅果冬青鹽處理后期(72 h)差異表達(dá)基因數(shù)量多于鹽處理初期，表明紅果冬青根系隨著鹽處理時間的延長，其轉(zhuǎn)錄組活性趨向更偏離鹽處理前的狀態(tài)。同時從差異表達(dá)基因上調(diào)/下調(diào)熱圖概況(圖1B)可知，鹽處理6 h的全緣冬青根系中表達(dá)上調(diào)的差異基因遠(yuǎn)多于下調(diào)差異基因，而鹽處理6 h的紅果冬青根系中多數(shù)是表達(dá)下調(diào)的基因；和各自的鹽處理6 h相比，鹽處理72 h的全緣冬青和紅果冬青根系中均表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)基因的數(shù)目下降而表達(dá)下調(diào)基因的數(shù)目上升。

圖1 全緣冬青和紅果冬青根系鹽處理6和72 h后差異表達(dá)基因的數(shù)量(A)和上調(diào)/下調(diào)熱圖(B)

2.2 兩種冬青根系中差異表達(dá)基因的KEGG功能富集分析

如全緣冬青根系鹽處理后的KEGG功能途徑(圖2A)所示，鹽處理6 h全緣冬青根系的KEGG通路絕大部分基因?qū)儆诖x基因(203/223)，包括碳(糖)代謝、氨基酸(酪氨酸)代謝、脂肪酸(亞油酸)代謝和次生代謝(苯丙烷、甜菜紅素、類胡蘿卜素生物合成)等，另有13個基因?qū)儆诃h(huán)境信息處理(植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo))基因。全緣冬青根系鹽處理72 h的KEGG富集通路包括細(xì)胞進(jìn)程(內(nèi)噬體，49/142)、環(huán)境信息處理(植物MAPK信號途徑和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，33/142)和代謝(29/142)，代謝包括脂肪酸(亞油酸和花生四烯酸)代謝和甜菜紅素、類胡蘿卜素生物合成。6和72 h鹽處理根系中共同的富集途徑為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、亞油酸代謝、類胡蘿卜素生物合成和甜菜紅素生物合成。

紅果冬青根系鹽處理6 h的KEGG通路(圖2B)包括環(huán)境信息處理(植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物MAPK信號途徑，49/99)、代謝(41/99)和植物晝夜節(jié)律(9/99)，代謝則包括苯丙烷生物合成、光合作用、多種次生代謝物合成和類胡蘿卜素生物合成)(圖2B)。紅果冬青根系鹽處理72 h的KEGG富集通路包括細(xì)胞進(jìn)程(內(nèi)噬體，131/310)、環(huán)境信息處理(植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，31/310)和代謝(88/310)，代謝包括苯丙烷生物合成、氮代謝、光合作用-天線蛋白、類胡蘿卜素、雙萜以及萜類和甾醇類生物合成。6和72 h鹽處理共同的富集途徑為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成和類胡蘿卜素生物合成。

圖2 鹽處理6和72 h后兩種冬青根系中富集的KEGG功能途徑

2.3 全緣冬青根系響應(yīng)鹽處理的特異代謝途徑

比較兩種冬青根系經(jīng)6 h鹽處理的富集途徑(圖2)發(fā)現(xiàn)，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、類胡蘿卜素生物合成和植物晝夜節(jié)律為二者的共同途徑；但全緣冬青有9種特異途徑，包括酪氨酸代謝、甜菜紅素生物合成、亞油酸代謝和六類碳代謝途徑(即淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、糖酵解/糖異生、戊糖磷酸途徑、戊糖與葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、乙醛酸和二碳酸代謝)等。

兩種冬青根系鹽處理72 h的共同途徑有植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)噬體、類胡蘿卜素生物合成和肝癌等4種(圖2)，而全緣冬青特有的途徑為植物MAPK信號途徑、甜菜紅素生物合成、亞油酸代謝和花生四烯酸代謝等4種。這些結(jié)果表明全緣冬青根系在6 h短期和72 h長期鹽脅迫處理中，甜菜紅素生物合成和脂肪酸(亞油酸、花生四烯酸)代謝均為特異的富集代謝通路，可能對全緣冬青根系的耐鹽性形成具有特定的生理作用，將做進(jìn)一步的分析。

2.4 全緣冬青中甜菜紅素合成相關(guān)基因的表達(dá)

KEGG富集分析顯示有9個基因可能參與甜菜紅素生物合成，這些基因可以根據(jù)其在鹽處理6和72 h后相對表達(dá)變化分為3類(圖3)：第1類4個基因在鹽處理6 h時表達(dá)顯著升高，至72 h保持平穩(wěn)表達(dá)或表達(dá)降低[基因編號(下同)為TRINITY_DN294234_c0_g1、TRINITY_DN234089_c0_g1、TRINITY_DN509330_c0_g4和TRINITY_DN413471_c0_g1]；第2類為鹽處理6 h的表達(dá)水平相對于鹽處理0 h無明顯變化，鹽處理72 h后表達(dá)顯著降低(包括TRINITY_DN33926_c0_g1、TRINITY_DN62285_c0_g3和TRINITY_DN247553_c0_g1)；第3類為鹽處理6 h時表達(dá)顯著降低，至72 h無顯著變化(即TRINITY_DN350783_c0_g1、TRINITY_DN109022_c0_g1)。說明盡管這些甜菜紅素合成相關(guān)的基因均注釋為酪氨酸酶(tyrosinase)或包含酪氨酸酶中心功能域，但其表達(dá)水平對鹽處理的響應(yīng)存在上調(diào)/下調(diào)、早期/晚期的模式差異。

圖3 全緣冬青根系甜菜紅素生物合成9個相關(guān)基因表達(dá)水平在鹽處理中的變化

2.5 全緣冬青中亞油酸代謝和花生四烯酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)

KEGG功能富集分析顯示全緣冬青根系在鹽處理中有8個基因可能參與亞油酸代謝(圖4)，其中編號為TRINITY_DN173841_c0_g1、TRINITY_DN22314_c0_g1、TRINITY_DN75152_c0_g1和TRINITY_DN81998_c0_g1的4個基因(均注釋為亞油酸酯10R-脂氧合酶類似物，linoleate 10R-lipoxygenase-like)，TRINITY_DN173841_c0_g2(ψ-產(chǎn)氧酶A類似物，psi-producing oxygenase A-like)和TRINITY_DN383657_c0_g1(胞質(zhì)磷脂酶A2γ，Cytosolic phospholipase A2 gamma)的表達(dá)水平在鹽處理6 h后顯著升高。鹽處理72 h后，表達(dá)水平平穩(wěn)保持或有所降低。另外編號為TRINITY_DN524668_c0_g2(細(xì)胞色素P450單加氧酶，Cytochrome P450 monooxygenase)和TRINITY_DN16496_c0_g1(三酰甘油酯酶，Triacylglycerol lipase)的2個基因則在鹽處理過程中表達(dá)水平降低，其中TRINITY_DN524668_c0_g2僅在72 h鹽處理后表達(dá)水平降低，而TRINITY_DN16496_c0_g1在鹽處理6和72 h其表達(dá)水平持續(xù)降低。

圖4 全緣冬青根系中與亞油酸和花生四烯酸代謝相關(guān)基因在鹽處理中的表達(dá)水平變化

如圖4B所示，與亞油酸代謝相關(guān)基因不同，所有12個花生四烯酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著升高的表現(xiàn)，其中編號為TRINITY_DN107276_c0_g2、TRINITY_DN13210_c0_g1、TRINITY_DN13210_c1_g1、TRINITY_DN23731_c0_g1、TRINITY_DN306749_c0_g2、TRINITY_DN38879_c0_g1、TRINITY_DN427259_c0_g2的7個基因(均注釋為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，glutathione S-transferase)、編號為TRINITY_DN35068_c0_g1(花生四烯酸15-脂氧合酶B，arachidonate 15-lipoxygenase B)和TRINITY_DN524668_c0_g2(細(xì)胞色素P450單加氧酶，Cytochrome P450 monooxygenase)的基因在鹽處理6 h時表達(dá)水平無顯著變化，但在鹽處理72 h后顯著降低；另有編號為TRINITY_DN25882_c0_g1(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，glutathione S-transferase)、TRINITY_DN722583_c0_g1(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，glutathione S-transferase)和TRINITY_DN16496_c0_g1(三酰甘油酯酶，Triacylglycerol lipase)的3個基因在鹽處理6 h時表達(dá)水平即顯著降低，鹽處理72 h后其表達(dá)水平繼續(xù)降低或保持平穩(wěn)。

2.6 兩種冬青根系中過氧化氫酶基因的比較

基于前期發(fā)現(xiàn)全緣冬青根系在鹽處理中過氧化氫酶活性升高而紅果冬青根系中過氧化氫酶活性降低的差異表現(xiàn)，筆者對兩種冬青中可能編碼過氧化氫酶的基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析。由于抗氧化酶相關(guān)的代謝并不在KEGG功能富集的通路中，用關(guān)鍵詞搜索全緣冬青和紅果冬青差異表達(dá)基因的功能注釋，在全緣冬青發(fā)現(xiàn)7個注釋為過氧化氫酶的差異表達(dá)基因，在紅果冬青中找到3個注釋為過氧化氫酶的差異表達(dá)基因(圖5)。

I.p表示紅果冬青的 I. purpurea’s。下同。The same below.

全緣冬青7個過氧化氫酶基因中，有4個基因(編號為TRINITY_DN27282_c0_g1、TRINITY_DN359401_c0_g1、TRINITY_DN47768_c1_g2、和TRINITY_DN71912_c0_g1)在鹽處理6 h時表達(dá)急劇升高，其表達(dá)水平分別是各自0 h時的12.9、53.4、66.2和216.4倍；鹽處理72 h后，編號為TRINITY_DN27282_c0_g1的基因表達(dá)水平降低至0 h水平，TRINITY_DN359401_c0_g1表達(dá)水平依然是0 h水平的50倍，而TRINITY_DN71912_c0_g1和TRINITY_DN47768_c1_g2的表達(dá)水平相對其6 h表達(dá)水平有降低，但依然是鹽處理前0 h水平的約9倍。其他2個基因(編號為TRINITY_DN36598_c0_g2和TRINITY_DN126173_c0_g1)在鹽處理6 h時表達(dá)明顯降低，72 h鹽處理后表達(dá)水平恢復(fù)至0 h表達(dá)水平；另有TRINITY_DN40435_c0_g3鹽處理6 h表達(dá)無變化，鹽處理72 h，表達(dá)水平降低為其0 h水平的1.2%。

紅果冬青中搜索到3個可能的過氧化氫酶基因，其中編號為TRINITY_DN157718_c0_g1和TRINITY_DN25268_c0_g1的基因表達(dá)水平在鹽處理6 h時分別升高3倍，鹽處理72 h后其表達(dá)降低至0 h水平；另有TRINITY_DN205218_c0_g1，其表達(dá)水平在鹽處理中持續(xù)降低。這些結(jié)果說明全緣冬青和紅果冬青根在鹽脅迫處理時均有過氧化氫酶基因或上調(diào)或下調(diào)，但全緣冬青中受鹽脅迫正調(diào)控的過氧化氫酶基因其表達(dá)水平在鹽處理中遠(yuǎn)高于紅果冬青，這與筆者前期生理測定中發(fā)現(xiàn)全緣冬青中過氧化氫酶活性在鹽處理中迅速上升的變化趨勢是吻合的[10]。

2.7 基因表達(dá)水平的熒光定量PCR驗(yàn)證

對上述可能與全緣冬青根系較高耐鹽性相關(guān)的基因，其在鹽處理中的表達(dá)水平進(jìn)行了熒光定量PCR檢測。這些隨機(jī)選擇的 20 個基因包括全緣冬青5個甜菜紅素生物合成相關(guān)基因、5個亞油酸代謝相關(guān)基因、5個花生四烯酸代謝相關(guān)基因，還有3個全緣冬青過氧化氫酶基因和2個紅果冬青過氧化氫酶基因。盡管熒光定量PCR檢測的結(jié)果(圖6)和轉(zhuǎn)錄組測序得到的結(jié)果(圖3—圖5)在具體升降倍數(shù)上并不完全相同，但在鹽脅迫0、6和72 h的過程中，這些基因的表達(dá)變化趨勢是一致的，由此證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。

圖6 基因表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測

3 討 論

耐鹽性是植物對外界高鹽環(huán)境的綜合響應(yīng)，要成功提高某一目標(biāo)植物的耐鹽性，很大程度上依賴于首先對其關(guān)鍵耐鹽機(jī)理的解析[13]，進(jìn)而通過操控關(guān)鍵代謝途徑的活性達(dá)到提高植物耐鹽性的目的。RNA測序技術(shù)(RNA-Seq)作為高通量手段，對不同生理/環(huán)境條件下植物器官、組織或細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況進(jìn)行檢測分析；特別是對那些尚無參考基因組的物種，通過轉(zhuǎn)錄本的從頭組裝(Denovoassembly)可以全面理解其表型特征與轉(zhuǎn)錄組活性之間的關(guān)系，是目前深入研究植物轉(zhuǎn)錄組的有力工具之一[14]。由于沒有近緣的植物基因組作為參考，本研究采用RNA-Seq測序技術(shù)對全緣冬青和紅果冬青的根系在鹽處理中的轉(zhuǎn)錄組活性進(jìn)行了分析。

1)全緣冬青和紅果冬青根系在鹽處理過程中均有數(shù)千個基因表現(xiàn)出差異表達(dá)，但值得注意的是，全緣冬青根系鹽處理6 h的差異基因數(shù)(2 616)多于鹽處理72 h時的基因數(shù)(1 802)；而紅果冬青在鹽處理6 h的差異基因數(shù)(1 831)少于鹽處理72 h時的基因數(shù)(3 490)，可能說明全緣冬青根系對短期鹽處理(6 h)響應(yīng)相對迅速，差異基因數(shù)較多，隨著鹽處理時間延長，其轉(zhuǎn)錄組活性有向?qū)φ栈貧w的趨勢；而紅果冬青鹽處理后期(72 h)差異基因數(shù)多于鹽處理初期，表明紅果冬青根系隨著鹽處理時間的延長，鹽脅迫對其轉(zhuǎn)錄組活性的干擾越大(相對于鹽處理前的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài))，這一結(jié)果暗示相對于紅果冬青，全緣冬青根系可能具備一定程度上消除鹽脅迫影響的能力。

2)植物對鹽脅迫的響應(yīng)和適應(yīng)需要體內(nèi)多種激素的交流和互作[15]。本研究中，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是兩種冬青根系在6 和72 h鹽處理中均表現(xiàn)富集的通路，表明激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在兩種冬青的鹽脅迫響應(yīng)中均發(fā)揮一定的作用；同時，類胡蘿卜素生物合成也是兩種冬青根系在6和72 h鹽處理中共同的富集途徑，暗示類胡蘿卜素可能參與了兩種冬青的鹽脅迫響應(yīng)。類胡蘿卜素雖然在植物光合組織中主要作為光合色素的組分參與對光能的吸收[16]，同時可作為抗氧化劑，清除活性氧，緩解植物組織的過氧化傷害[17]。番茄紅素環(huán)化酶(lycopene cyclase，LCY)是類胡蘿卜素生物合成途徑中直接催化α-和β-胡蘿卜素生成的關(guān)鍵酶，由α-和β-胡蘿卜素生成類胡蘿卜素(如蘆丁、玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)等)[18]，有研究表明，過表達(dá)鹽角草(Salicorniaeuropaea)β-LCY基因可提高擬南芥葉片中類胡蘿卜素的含量而減少了過氧化氫的形成，由此提高了擬南芥對200 mmol/L NaCl 的耐受性[19]。另外由于類胡蘿卜素(9-cis-violaxanthin 和 9′-cis-neoxanthin)是植物脅迫激素脫落酸(ABA)的直接合成前體[20-21]，而且某些類胡蘿卜素合成突變體中生長素和ABA的生物合成均受到阻礙[22]，暗示在兩種冬青的鹽脅迫響應(yīng)中類胡蘿卜素生物合成和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能存在某種關(guān)聯(lián)，將來可對兩種冬青根系在鹽脅迫中的類胡蘿卜素組分、含量、各類激素的合成/降解動態(tài)進(jìn)行檢測，解析是哪一類類胡蘿卜素或激素在冬青鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

甜菜紅素生物合成和脂肪酸(亞油酸、花生四烯酸)代謝是全緣冬青根系在6 h(短期)和72 h(長期)鹽脅迫處理中特異的富集代謝通路，在紅果冬青中并不富集，因此推測可能與全緣冬青根系的耐鹽性形成相關(guān)聯(lián)。甜菜紅素是一種水溶性含氮生物堿類色素，目前從17種植物中鑒定出了約75種甜菜紅素結(jié)構(gòu)[23]，在鹽地堿蓬(Suaedasalsa)中已證明甜菜紅素既受高鹽堿條件的誘導(dǎo)，也受黑暗、過氧化氫的誘導(dǎo)，是植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的一種次生代謝物質(zhì)，具有清除氧自由基的功能[24]，甜菜紅素是否參與全緣冬青根系的耐鹽響應(yīng)尚有待研究。

3)細(xì)胞膜作為植物細(xì)胞在脅迫條件下維持穩(wěn)定胞內(nèi)代謝環(huán)境的屏障，在鹽堿脅迫中, 通常是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能先受到傷害[25]，在許多植物中已觀察到鹽脅迫會使細(xì)胞膜脂(磷脂、糖脂或鞘脂)含量、組分發(fā)生改變，特別是一些在正常條件下僅微量合成的特殊脂類會在脅迫條件下大量合成，由此改變膜的流動性和通透性，進(jìn)而影響膜蛋白的特性和膜上信號分子的活性[26]。脂肪酸是膜脂分子的主要構(gòu)成元件，膜脂脂肪酸的組分在植物各物種之間是保守的，通常軟脂酸和亞油酸所占比例最大[27]；飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比率變化，因其能調(diào)控膜的流動性和通透性，被認(rèn)為參與了植物對鹽脅迫的響應(yīng)[28]。本研究中，全緣冬青根系在鹽處理中有8個基因可能參與亞油酸代謝，其中6個基因的表達(dá)水平在鹽處理6 h后顯著升高，隨著鹽處理72 h，表達(dá)水平平穩(wěn)保持或有所降低，暗示亞油酸代謝與全緣冬青根系的鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)聯(lián)，這與花生(Arachishypogaea)研究相吻合，即經(jīng)150 mmol/L NaCl脅迫7 d后的花生葉片中，單半乳糖甘油二酯(MGDG)、二半乳糖甘油二酯(DGDG)、硫代鼠李糖甘油二酯(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)的雙鍵指標(biāo)(double bond index，DBI)升高，特別是軟脂酸與亞油酸在這些膜脂中的含量有升高[29]?；ㄉ南┧崾侨梭w的一種必需脂肪酸，為5，8，11，14-二十碳四烯酸[30]，擬南芥中的研究表明花生四烯酸作為一種信號分子，不僅可以激發(fā)脂肪酸介導(dǎo)的病原物防御反應(yīng)，而且會引發(fā)普遍的脅迫信號網(wǎng)絡(luò)[31]，但目前尚無花生四烯酸與植物非生物脅迫關(guān)聯(lián)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中全緣冬青根系所有12個花生四烯酸代謝相關(guān)基因在鹽脅迫處理過程中總體表現(xiàn)為表達(dá)水平降低，這一趨勢與全緣冬青耐鹽性之間的相關(guān)性值得深入研究。

4)過氧化氫酶顯著區(qū)別于其他過氧化代謝酶的特征是不需要還原劑的參與就能清除過氧化氫，而且對過氧化氫具有很高的專一性，對有機(jī)過氧化物的活性很低[32]。前期研究發(fā)現(xiàn)，盡管鹽脅迫處理前(0 h)，紅果冬青根系中的過氧化氫酶活性顯著高于全緣冬青；鹽脅迫處理使過氧化氫酶活性在紅果冬青中迅速降低，而在全緣冬青中迅速升高，全緣冬青過氧化氫酶活性在鹽處理1～24 h均略高于紅果冬青(無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)，鹽處理72 h則全緣冬青過氧化氫酶(CAT)活性顯著高于紅果冬青[10]，說明全緣冬青根系在鹽處理中具有更高的清除過氧化氫的能力。本研究中，全緣冬青中受鹽脅迫正調(diào)控的過氧化氫酶基因數(shù)目多于紅果冬青，并且其表達(dá)水平在鹽處理中遠(yuǎn)高于紅果冬青，說明鹽處理中過氧化氫酶基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)是全緣冬青根系過氧化氫清除能力提高的重要原因，暗示將來可以嘗試通過鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)過氧化氫酶基因來提高紅果冬青的耐鹽性。

綜上所述，對全緣冬青和紅果冬青鹽處理根系的轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)閷磉M(jìn)一步分析二者耐鹽性差異的生理學(xué)機(jī)理提供了有益的提示，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、類胡蘿卜素生物合成、甜菜紅素生物合成和脂肪酸(脂類)代謝都是值得關(guān)注的生理過程。同時，功能鑒定全緣冬青根系中受鹽處理高效誘導(dǎo)的過氧化氫酶基因，有可能用于將來通過遺傳轉(zhuǎn)化培育具有較高耐鹽性的紅果冬青或其他木本新品種。