丁 寧， 李才明，2，3， 班宵逢，2，3， 顧正彪*，2，3， 李兆豐*，2，3

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122）

地球的自然生態(tài)系統(tǒng)中存在諸多極端環(huán)境，能夠在極端環(huán)境下正常生長代謝的微生物被稱為極端微生物，其中，在海洋深處、極地和陸地高寒帶等低溫環(huán)境生長的微生物被稱為低溫微生物。低溫微生物通常具有與常溫微生物不同的生理機(jī)制，其中包括分泌的酶類具有較強(qiáng)的低溫催化能力，這類酶被稱為冷適酶[1-2]。對冷適酶進(jìn)行研究，一方面能夠拓寬酶的應(yīng)用范圍，一定程度上填補(bǔ)工業(yè)用酶的缺口；另一方面，冷適酶的分子結(jié)構(gòu)通常具有特殊性，因此，發(fā)現(xiàn)并總結(jié)冷適酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，可以為生物學(xué)研究提供寶貴信息[3-4]。

麥芽五糖（maltopentaose，G5）是由5個葡萄糖單元以α-1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖，因其甜度較低，在維持血糖平衡和改善腸道內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮重要作用，同時作為營養(yǎng)助劑和診斷試劑被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，因此G5的合成具有較高的研究和應(yīng)用價值[5-8]。G5主要采用酶法生產(chǎn)，即利用麥芽 五 糖 生 成 酶 （maltopentaose-forming amylase，G5A，EC 3.2.1.X）選擇性地水解淀粉中特定的α-1，4糖苷鍵，生成以G5為主的麥芽低聚糖混合物。目前，已報(bào)道的G5A的最適反應(yīng)溫度為60～93℃[9-11]，在室溫或低溫下催化效率極低。然而，長時間加熱可能引起G5的顏色等物理性質(zhì)發(fā)生變化，并且降低G5的營養(yǎng)性[12]；同時，高溫生產(chǎn)會引起大量能源消耗和溫室氣體排放。因此，冷適G5A的開發(fā)對于高效、綠色生產(chǎn)高品質(zhì)的G5起到至關(guān)重要的作用[6]。

前期研究表明，海洋微生物多糖降解菌Saccharophagus degradans能夠分泌兩種不同相對分子 質(zhì) 量 的G5As（SdG5A和SdG5A-CD），位 于SdG5A C端的淀粉結(jié)合域（starch-binding domain，SBD）可能發(fā)生降解，形成SdG5A-CD。為了探究SdG5A和SdG5A-CD的冷適性，作者分別將其表達(dá)于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600中，并對重組SdG5A和重組SdG5A-CD進(jìn)行分離純化。以水解活力和G5得率為指標(biāo)，分析其在低溫下的催化能力。隨后，利用RoseTTAFold預(yù)測SdG5A的結(jié)構(gòu)模型，并在此基礎(chǔ)上通過結(jié)構(gòu)分析和分子動力學(xué)模擬（molecular dynamics simulations，MD）等生物信息學(xué)手段，闡明SdG5A分子柔性與酶冷適性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒和菌株pST質(zhì)粒、Escherichia coli JM109克隆菌株保存于作者所在實(shí)驗(yàn)室；B.subtilis WB600感受態(tài)細(xì)胞由江南大學(xué)糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心饋贈。

1.1.2 主要試劑與材料高保真DNA聚合酶Phanta Max、重組克隆試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Phenyl Superose HR 10/10疏水柱：美國Amersham Biosciences公司產(chǎn)品；Superdex 75 10/300凝膠柱：瑞典GE Healthcare Biosciences公司產(chǎn)品；CarboPacTMPA200碳水化合物分析柱：美國Dionex公司產(chǎn)品；麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品：日本Hayashibara生物化學(xué)研究所提供。

1.1.3 主要儀器AKTA Prime Plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：美國GE公司產(chǎn)品；高效陰離子交換色譜（highperformance anion-exchange chromatographic，HPAEC）儀、脈沖電流檢測器（pulsed amperometrydetector，PAD）：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.1.4 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.0；固體培養(yǎng)基再添加1.5 g/dL瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉36 g/L、麥芽糊精5 g/L，pH 6.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)載體sdg5a/pST和sdg5a-cd/pST的構(gòu)建SdG5A編 碼 基 因sdg5a（GenBank accession：AIV43244.1）和相關(guān)引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增sdg5a、sdg5a-cd和pST質(zhì)?；蚱危镄蛄幸姳?。

表1 構(gòu)建sdg5a/pST和sdg5a-cd/pST表達(dá)載體的引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers used for the construction of sdg5a/pST and sdg5a-cd/pST plasmid

PCR完成后，分別在兩個基因片段中加入1 μL限制性內(nèi)切酶Dpn I，于37℃酶切4 h，消化模板質(zhì)粒，并進(jìn)行切膠回收。參考重組克隆試劑盒說明書，完成片段的拼接，得到sdg5a/pST和sdg5a-cd/pST表達(dá)載體。

1.2.2 Bacillus subtilis WB600感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取10 μL sdg5a/pST和sdg5a-cd/pST質(zhì)粒，分別加入至B.subtilis WB600超級感受態(tài)細(xì)胞（100 μL）中，于37℃搖床（200 r/min）中培養(yǎng)2 h，涂布于含有終質(zhì)量濃度10 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落即為基因工程菌sdg5a/pST/B.subtilis WB600和sdg5a-cd/pST/B.subtilis WB600。

1.2.3 SdG5A和SdG5A-CD的生產(chǎn)和純化挑取單菌落加入到裝有5 mL LB培養(yǎng)基的15 mL聚丙烯圓底試管中，于37℃搖床（200 r/min）過夜培養(yǎng)。取2 mL活化菌液接種至含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在25℃搖床（200 r/min）培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在4℃、10 000 r/min的條件下離心20 min，收集上清液即為重組SdG5A和SdG5A-CD粗酶液。LB培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均添加終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的卡那霉素。

重組SdG5A和SdG5A-CD的純化均采用疏水柱與凝膠柱相結(jié)合的方法。在使用疏水柱純化時，首先用含有體積分?jǐn)?shù)為20%（NH4）2SO4的緩沖液A（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）平衡疏水柱，上樣后，分別用體積分?jǐn)?shù)0～100%的緩沖液A（與超純水混合）進(jìn)行梯度洗脫，并最終用超純水洗脫活性組分用于凝膠柱二步純化。在使用凝膠柱純化時，同樣用緩沖液A平衡凝膠柱，并在上樣后用超純水洗脫，收集洗脫液的活性部分即為純化重組SdG5A和SdG5A-CD。將純酶液置于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，于4℃下透析過夜，并將純酶分裝保存于-80℃中。

1.2.4 水解活力的測定將每分鐘生成1 μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量定義為1個酶活力單位（U）。還原糖的含量利用3，5-二硝基水楊酸法測定[13]。具體方法為用C6H8O7-Na2HPO4緩沖液（50 mmol/L，pH 6.5）配制1 g/dL的可溶性淀粉溶液，加熱糊化。取900 μL底物加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，分別于0、25、45℃下反應(yīng)15 min后，加入1 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑。在沸水浴中顯色5 min，冷卻后加入3 mL蒸餾水，在540 nm下測定吸光度。

1.2.5 水解產(chǎn)物分析配置10 g/dL的蠟質(zhì)玉米淀粉作為底物，分別加入2 U/g重組SdG5A和SdG5A-CD，在25℃下反應(yīng)48 h，每隔12 h取樣，沸水浴30 min終止反應(yīng)，離心（10 000 r/min）5 min，取上清液過0.22 μm水系超濾膜待測。利用HPAEC-PAD分析產(chǎn)物中各組分含量[6]。采用三元梯度程序進(jìn)行洗脫（見表2），其中洗脫液A為0.25 mol/L氫氧化鈉，洗脫液B為1.0 mol/L醋酸鈉，洗脫液C為超純水。流量為0.5 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL，以糖四電位波形檢測。

表2 HPAEC-PAD分離麥芽低聚糖的梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for the separation of maltooligosaccharides using HPAEC-PAD

以葡萄糖、麥芽糖和麥芽低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照進(jìn)行水解產(chǎn)物組分的定性和定量，淀粉轉(zhuǎn)化率和G5比例的計(jì)算方法如下：

式中：Cs為淀粉轉(zhuǎn)化率，%；m1為葡萄糖、麥芽糖、麥芽低聚糖總質(zhì)量；m0為底物干基質(zhì)量；RG5為G5比例，%；mG5為G5質(zhì)量。

1.2.6 SdG5A的結(jié)構(gòu)預(yù)測利用RoseTTAFold（https：//robetta.bakerlab.org/）[14]和AlphaFold2[15]模擬SdG5A的空間結(jié)構(gòu)。利用M-ZDock（https：//zdock.umassmed.edu/m-zdock/）模擬SdG5A二聚體結(jié)構(gòu)[16]。模擬結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和相似性利用ResQ（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ResQ/）計(jì)算TM-score進(jìn)行評價[17]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作圖利用Pymol軟件進(jìn)行。

1.2.7 SdG5A的柔性分析利用ResQ在線分析工具（https：//zhanggroup.org/ResQ/）分 析SdG5A的 溫度因子（B-factor）和模型到自然態(tài)之間的距離（distance to native state，dn），并以此作為評價蛋白質(zhì)靜態(tài)柔性的依據(jù)[17]。利用MD計(jì)算SdG5A在不同溫度下氨基酸殘基的均方根漲落（root-mean-square fluctuation，RMSF）值，以此作為評價SdG5A動態(tài)柔性的指標(biāo)。

利用Desmond軟件進(jìn)行MD，溶劑模型選擇TIP3P，盒子為正交晶系，盒子大小設(shè)置為1 nm×1 nm×1 nm，角度α=90°、β=90°、χ=90°。添加Na+平衡電荷，選擇OPLS4力場進(jìn)行體系構(gòu)建。選擇NVT平衡，溫度設(shè)置為0℃和45℃，每個體系的模擬時間為100 ns，收集1 000幀軌跡。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用Prism 8 Student’s T-test分析兩組間的顯著性差異。當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 Linker-SBD對SdG5A冷適性的影響

2.1.1 SdG5A和SdG5A-CD的 純 化SdG5A與SdG5A-CD含有相同的催化域（Q1～A427），SdG5A在C端含有額外的SBD（V446～F542），位于N端的催化域與C端的SBD之間以linker（I428～K445）連接（見圖1（a））。SdG5A和SdG5A-CD的理論相對分子質(zhì)量分別為58 000和48 000。重組SdG5A和SdG5A-CD均采用疏水-凝膠兩步法進(jìn)行純化，經(jīng)十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）驗(yàn)證，所收集活性部分的相對分子質(zhì)量與理論相對分子質(zhì)量相同（見圖1（b））。

圖1 SdG5A和SdG5A-CD的結(jié)構(gòu)組成和SDS-PAGE分析Fig.1 Structural composition and SDS-PAGE analysis of SdG5A and SdG5A-CD

2.1.2 SdG5A和SdG5A-CD的冷適性為了評價SdG5A和SdG5A-CD的冷適性，分別測定了其在冰點(diǎn)（0℃）、室溫（25℃）和最適反應(yīng)溫度（45℃）下的水解活力，結(jié)果如表3所示，SdG5A在0℃和25℃下可分別保持最高比活力27.8%和64.0%的水解活力，說明其具有較強(qiáng)的冷適性；而SdG5A-CD在0℃下的比活力僅為野生型的2.7%，在25℃下的比活力僅為45℃下的26.7%，說明linker-SBD結(jié)構(gòu)的缺失導(dǎo)致SdG5A的冷適性大幅下降。來源于鹽浮交替單胞菌（Alteromonas haloplanctis）A23的α-淀粉酶（AHA）是最早發(fā)現(xiàn)、目前研究最多的冷適α-淀粉酶，其最適溫度為25℃，在0℃下的催化活力為最適溫度下20%[18]。與AHA相比，SdG5A在0℃下的相對活力高于AHA，說明其具有良好的應(yīng)用前景。

表3 SdG5A和SdG5A-CD在不同溫度下的比活力Table 3 Specific activities of SdG5A and SdG5A-CD oct different temperature

為了探究SdG5A和SdG5A-CD在室溫下制備G5的效率，評價其應(yīng)用可行性，以10 g/dL的蠟質(zhì)玉米淀粉為底物，在25℃下反應(yīng)0～48 h，利用HPAEC-PAD分析水解產(chǎn)物，并計(jì)算淀粉轉(zhuǎn)化率和G5比例，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，當(dāng)SdG5A與蠟質(zhì)玉米淀粉反應(yīng)24 h時，G5得率（G5比例與淀粉轉(zhuǎn)化率的乘積）高達(dá)48.6%；然而當(dāng)反應(yīng)時間延長至48 h時，由于SdG5A發(fā)生了過度水解反應(yīng)，產(chǎn)物中的G5被進(jìn)一步降解為聚合度更低的小分子糖，導(dǎo)致G5得率降低（見圖2（a））。相比之下，由于SdG5A-CD在25℃下的水解活力較低，并且產(chǎn)物特異性較差，其水解蠟質(zhì)玉米淀粉生產(chǎn)G5的最高得率僅為SdG5A的9.5%，因此，SdG5A在室溫下制備G5的效率更高。此前，韓煦利用巨大芽孢桿菌（B.megaterium）來源的G5A突變體水解20 g/dL的木薯淀粉，在40℃下反應(yīng)36 h，可以獲得的最高G5得率為39.0%[19]。相比而言，利用SdG5A制備G5不僅得率更高，同時反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，能夠降低加熱和冷卻處理所引起的對產(chǎn)品和環(huán)境的不利影響，因此，SdG5A更適合用于G5的高效、綠色生產(chǎn)。

圖2 SdG5A和SdG5A-CD在25℃下水解蠟質(zhì)玉米淀粉生產(chǎn)G5的淀粉轉(zhuǎn)化率和G5比例Fig.2 Conversion rate and ratio of G5 arising from the hydrolyzation of waxy corn starch at 25℃by SdG5A and SdG5A-CD

2.2 SdG5A的空間結(jié)構(gòu)

相比于SdG5A-CD，SdG5A具有較強(qiáng)的冷適性，說明SdG5A的linker-SBD結(jié)構(gòu)對調(diào)控其冷適性具有重要作用。為了加深對SdG5A冷適性機(jī)制的理解，需要進(jìn)一步獲取其結(jié)構(gòu)信息。然而，目前對SdG5A晶體結(jié)構(gòu)的獲取難度較大。一方面，SdG5A與已報(bào)道的蛋白質(zhì)的同源性均較低，這使其無法通過同源模型化的方法對結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析和預(yù)測。在已報(bào)道序列的蛋白質(zhì)中，SdG5A與來源于海洋微生物Marinagarivorans algicola的淀粉酶（GenBank accession WP_053982064）同源性最高，序列相似度為67%[6]；在已報(bào)道晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中，SdG5A與來源于Pseudoalteromonas haloplanktis的淀粉酶（PDB ID：1G9H）的同源性最高，序列相似度為51%，但該酶不存在SBD結(jié)構(gòu)，因此無法為SdG5A完整結(jié)構(gòu)的解析和預(yù)測提供依據(jù)。另一方面，由于SBD的柔性過大，在溶液中呈高度無序性，且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在蛋白質(zhì)結(jié)晶過程中易發(fā)生降解，導(dǎo)致包括SdG5A在內(nèi)的麥芽低聚糖生成酶均無法通過X射線衍射的方法獲得含有SBD的完整結(jié)構(gòu)信息[20-21]。2021年7月，谷歌Deepmind團(tuán)隊(duì)和華盛頓大學(xué)David Baker團(tuán)隊(duì)分別發(fā)布了新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測工具AlphaFold2和RoseTTAFold[14-15]，該成果突破性地提高了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的準(zhǔn)確性，同時也為本研究中獲得SdG5A完整結(jié)構(gòu)提供重要工具。

分 別 利 用RoseTTAFold和AlphaFold2對SdG5A的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。利用ResQ計(jì)算單一結(jié)構(gòu)的TM-score，可評價模擬結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，在0～1.00時，分值越高說明模擬結(jié)構(gòu)越 準(zhǔn) 確[17]。RoseTTAFold和AlphaFold2模 擬 的SdG5A結(jié)構(gòu)的TM-score分別為0.71和0.65，說明RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性略高于AlphaFold2。利用ResQ同時計(jì)算兩個結(jié)構(gòu)的TMscore，可評價兩個結(jié)構(gòu)的相似性，若分值在0.50～1.00說明其具有相同的折疊方式[17]。RoseTTAFold與AlphaFold2模擬結(jié)構(gòu)的TM-score為0.78，說明二者的相似度較高。盡管利用RoseTTAFold和AlphaFold2模擬得到的SdG5A結(jié)構(gòu)中結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的折疊基本相同，但SBD的空間位置卻明顯不同（見圖3）。在RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)域的排列方式較為緊湊，SBD與催化位點(diǎn)相靠近；而在AlphaFold2模擬結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)域的排列方式較為松散，SBD遠(yuǎn)離催化位點(diǎn)。

圖3 SdG5A空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.3 Prediction of SdG5A spatial structures

為了明確SBD的位置，分析了兩個模擬結(jié)構(gòu)中結(jié)構(gòu)域之間的相互作用（見圖4）。結(jié)果表明，在AlphaFold2模擬結(jié)構(gòu)中，SBD與催化域之間不存在相互作用；但在RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)中，催化域、linker和SBD之間存在大量氫鍵相互作用，這些作用力使得RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)的整體構(gòu)象更加緊湊，有利于SBD發(fā)揮向催化域遞送底物的作用[22]。

圖4 RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)中催化域、SBD和linker之間的相互作用力Fig.4 Schematic diagram of the interactions within catalytic domain，SBD and linker in the structure predicted by RoseTTAFold

SdG5A的表面電荷分析結(jié)果表明，其催化域中的堿性氨基酸殘基的比例高于酸性氨基酸殘基，使其整體帶正電荷，凈電荷密度（堿性氨基酸殘基數(shù)目與酸性氨基酸殘基數(shù)目的差值占總氨基酸殘基數(shù)目的比例）為+6.1%；而在SBD中，酸性氨基酸殘基的比例高于堿性氨基酸殘基，使其整體帶負(fù)電荷，凈電荷密度為-4.1%[6]。由于催化域和SBD帶相反電荷，因此存在一定的靜電引力，這可能是RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)中催化域與SBD互相靠近的另一個原因。但氫鍵具有方向性，而靜電力不具有方向性，因此，產(chǎn)生這種構(gòu)象的主要原因仍然是催化域與SBD之間的氫鍵相互作用。

Jorgensen等利用小角衍射觀察到Aspergillus niger葡萄糖淀粉酶（glucoamylase，EC 3.2.1.3）可以在溶液中形成“頭對尾”的二聚體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以促使SBD向催化域靠近，而不必依賴于linker的運(yùn)動調(diào)整催化域和SBD的相對位置[23]。相應(yīng)地，對于整體構(gòu)象較為松散的AlphaFold2模擬結(jié)構(gòu)，也可能通過形成二聚體獲得更加緊湊的構(gòu)象，從而使SBD靠近催化位點(diǎn)。以AlphaFold2模擬的SdG5A結(jié)構(gòu)（見圖3（b））為模板，利用M-ZDock模擬SdG5A的二聚體結(jié)構(gòu)。由圖5（a）中可以看出，SdG5A的二聚體同樣呈現(xiàn)出“頭對尾”的結(jié)構(gòu)，其中一個單體的SBD靠近于另一個單體的催化位點(diǎn)。將該二聚體結(jié)構(gòu)與RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)疊加，發(fā)現(xiàn)后者的SBD與前者其中一個單體的SBD的位置接近 （見圖5（b））。該結(jié)果說明，RoseTTAFold和AlphaFold2所模擬的SdG5A結(jié)構(gòu)均可被認(rèn)為是準(zhǔn)確的，二者的區(qū)別在于RoseTTAFold所模擬的是SdG5A呈單體時的構(gòu)象，而AlphaFold2所模擬的是SdG5A呈二聚體時的構(gòu)象。

圖5 SdG5A二聚體空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.5 Structure prediction of dimeric SdG5A

為了判斷SdG5A形成二聚體的可能性，分別利用Native-PAGE和SDS-PAGE分析SdG5A在非變性和變性條件下的相對分子質(zhì)量（見圖6），結(jié)果表明，兩種方法測得的SdG5A相對分子質(zhì)量一致，說明SdG5A在溶液中以單體形式存在，因此，RoseTTAFold模擬的SdG5A結(jié)構(gòu)更加準(zhǔn)確。

圖6 SdG5A的變性電泳與非變性電泳分析Fig.6 SDS-PAGE and Native-PAGE analysis of SdG5A

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，以來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）的麥芽糖α-淀粉酶（maltogenic α-amylase，EC 3.2.1.133，BstA）的 晶 體 結(jié) 構(gòu)（PDB ID：1QHP）為參考結(jié)構(gòu)[24]，與SdG5A模擬結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對。一方面，BstA的功能與SdG5A相似，二者均能夠水解淀粉的α-1，4糖苷鍵，特異性地生成某一種聚合度的產(chǎn)物；另一方面，BstA的結(jié)構(gòu)組成與SdG5A相似，二者在C端均含有SBD。通過疊加SdG5A模擬結(jié)構(gòu)與BstA晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩個結(jié)構(gòu)中SBD的位置幾乎完全相同 （見圖7），說明RoseTTAFold模擬結(jié)構(gòu)的可信度較高。

圖7 SdG5A模擬結(jié)構(gòu)與BstA晶體結(jié)構(gòu)的比對Fig.7 Alignment of the predicted structure of SdG5A and the crystal structure BstA

2.3 SdG5A的柔性分析

在低溫條件下，蛋白質(zhì)的分子熱運(yùn)動較低，不利于酶對底物分子的獲取。因此，通過提高蛋白質(zhì)的整體或局部柔性來增強(qiáng)分子熱運(yùn)動，可以有效提高冷適酶在低溫下的催化效率。蛋白質(zhì)柔性可以通過B-factor、dn和RMSF進(jìn)行評價，其中，B-factor是衡量原子位置不確定性的一種指標(biāo)，反映了晶體中原子電子密度的模糊度[25]；dn是衡量原子不穩(wěn)定性的一種指標(biāo)，當(dāng)原子處于能量最低、最穩(wěn)定的自然態(tài)時，dn數(shù)值為0[17]；RMSF是衡量原子運(yùn)動自由程度的指標(biāo)，可以利用MD計(jì)算一定時間范圍內(nèi)每個原子相對于其平均位置的變化幅度而獲得。B-factor和dn反映的是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的靜態(tài)柔性，而RMSF反映的是動態(tài)柔性。B-factor、dn和RMSF的數(shù)值越大，說明相應(yīng)區(qū)域的柔性越高。

2.3.1 SdG5A的靜態(tài)柔性利用ResQ分析SdG5A的靜態(tài)柔性，包括B-factor（見圖8（a））和dn（見圖8（b）），并利用Pymol將SdG5A的B-factor映射到其空間結(jié)構(gòu)（見圖8（c））。

圖8 SdG5A的靜態(tài)柔性分析Fig.8 Analysis of the static flexibility of SdG5A

由圖8（a）和圖8（c）可知，linker區(qū)域的Bfactor值明顯高于催化域和SBD；從圖8（b）可知，linker和SBD區(qū)域的dn值均高于催化域，說明linker中原子位置的不確定性導(dǎo)致了linker-SBD區(qū)域中原子位置的不穩(wěn)定性，即高度靈活的linker可能帶動了SBD的運(yùn)動。

2.3.2 SdG5A的動態(tài)柔性在0℃和45℃下分別運(yùn)行MD，當(dāng)體系運(yùn)行至100 ns后，蛋白質(zhì)分子的均方根偏差介于0.5～0.6 nm，說明此時SdG5A結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。SdG5A的RMSF曲線如圖9（a）所示。結(jié)果表明，在45℃下蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)柔性較高；當(dāng)溫度降低至0℃時，催化域中的氨基酸殘基的RMSF發(fā)生不同程度的降低，而linker-SBD區(qū)域的RMSF未發(fā)生明顯變化，說明linker-SBD區(qū)域的柔性受溫度影響較小，且在0℃下仍然能夠保持較高的柔性。比較0℃下不同時刻SdG5A的整體構(gòu)象發(fā)現(xiàn)，催化域的中心結(jié)構(gòu)域在100 ns內(nèi)未發(fā)生明顯位移，而SBD可以在較大的空間范圍內(nèi)擺動（見圖9（b））?？紤]到SBD具有捕獲底物的能力[22]，linker-SBD結(jié)構(gòu)高柔性的分子特征有利于提高其在低溫下捕獲底物的效率，從而提高酶的催化活力。以上結(jié)果闡明了SdG5A和SdG5A-CD的冷適性存在差異的原因，并揭示了調(diào)控SdG5A冷適性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖9 MD分析SdG5A的動態(tài)柔性Fig.9 MD analysis of the dynamic flexibility of SdG5A

3 結(jié)語

目前已報(bào)道的G5A均為高溫酶，為了維持其酶反應(yīng)體系的溫度，需要消耗大量的能源、排放大量的溫室氣體，并且產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和感官品質(zhì)會受到高溫的影響而降低。為了解決上述問題，一方面可以加強(qiáng)對冷適G5A的開發(fā)和應(yīng)用；另一方面可以挖掘和總結(jié)冷適G5A的結(jié)構(gòu)特征，對非冷適G5A進(jìn)行定向改造。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，作者以SdG5A和SdG5A-CD為研究對象，通過異源表達(dá)體系的構(gòu)建、冷適性的表征、空間結(jié)構(gòu)的模擬和分子柔性的分析，證明了SdG5A在室溫下生產(chǎn)G5的可行性，并揭示了linker-SBD結(jié)構(gòu)高柔性的分子特征對調(diào)控酶冷適性的關(guān)鍵作用，可為其他淀粉酶分子改造的理性設(shè)計(jì)提供參考，為G5的高效、綠色合成提供理論基礎(chǔ)。