馮 驍， 池慧兵， 孟凡強(qiáng)， 陸兆新， 朱 萍， 呂鳳霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種天然存在的氨基酸，廣泛分布在原核與真核生物中。在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中，GABA為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，在神經(jīng)活動(dòng)中扮演重要的角色。國(guó)內(nèi)外研究表明，GABA具有調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)，增強(qiáng)記憶力，調(diào)節(jié)血壓心率，促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系等多種作用[2-6]。GABA已被添加至許多食品及其加工原料中，包括綠茶、小麥、酒曲[7-9]等，具有一定的保健功能。

GABA的制備方法主要有化學(xué)直接合成法[10]、植物富集提取法[11]、生物酶法[12]?；瘜W(xué)直接合成法在制備過程中會(huì)產(chǎn)生吡咯烷酮、丁內(nèi)酯、γ-氯丁氰等不安全副產(chǎn)物，且反應(yīng)條件苛刻；而植物富集提取法存在富集效率低等缺陷。相比之下，生物酶法具有安全性好、生產(chǎn)效率高與生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)，為目前較為理想的GABA制備方法。研究學(xué)者在動(dòng)物、植物、微生物中均發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）。但由于動(dòng)植物來源的GAD分離純化較為困難，因此，微生物來源的GAD研究較為廣泛，主要包括短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）等[13-16]，然而這些來源的GAD存在熱穩(wěn)定性差、pH穩(wěn)定性范圍較窄、與底物的親和力不高，以及后期產(chǎn)物的分離純化工藝煩瑣、耗能大、收益低等缺點(diǎn)，難以滿足工業(yè)應(yīng)用需求。如大腸桿菌GAD在50℃孵育2 h殘余酶活力僅剩40%；屎腸球菌GAD僅在pH 5.0～5.2的窄范圍內(nèi)較穩(wěn)定[17]；短乳桿菌Lb85GAD的底物親和力為22.9 mmol/L等[18-19]。因此，挖掘性能優(yōu)良的GAD基因，構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化平臺(tái)對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)GABA具有重要意義。

作者將釀酒酵母S288C來源的GAD基因進(jìn)行克隆，實(shí)現(xiàn)釀酒酵母谷氨酸脫羧酶在大腸桿菌中高效表達(dá)，并對(duì)重組GAD進(jìn)行分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)表征，以及全細(xì)胞制備GABA的最適條件探究，為GABA的高效生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒菌株E.coli BL21（DE3）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏；釀酒酵母谷氨酸脫羧酶（Saccharomyces cerevisiae glutamate decarboxylase）基因（GenBank NO.：GFP66652.1）由金斯瑞公司合成并克隆至質(zhì)粒pET-21a（+）中，酶切位點(diǎn)Nde I、Xho I。

1.1.2 主要試劑磷酸吡哆醛（PLP）、GABA標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、丹磺酰氯：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；四氫呋喃（色譜級(jí)）：永華化學(xué)股份有限公司產(chǎn)品；甲醇（色譜級(jí)）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：在100 mL LB培養(yǎng)基中加入1.8～2.5 g的瓊脂糖。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母GAD的轉(zhuǎn)化鑒定將重組質(zhì)粒pET-21a（+）-GAD轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)10～12 h，待單菌落長(zhǎng)出后于LB液體培養(yǎng)基中挑入單菌落并培養(yǎng)10～12 h，保存至甘油管中（甘油終體積分?jǐn)?shù)為15%），并收集菌體進(jìn)行測(cè)序，以確定轉(zhuǎn)化宿主成功。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵從甘油管中以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種入LB液體培養(yǎng)基中（含100 μg/mL氨芐青霉素），37℃、180 r/min培養(yǎng)10～12 h。以體積分?jǐn)?shù)為1%接種量轉(zhuǎn)接至新的LB培養(yǎng)基中，在菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)（OD600為0.6～0.8）加入IPTG（終質(zhì)量濃度100 μg/mL），16℃、180 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h。發(fā)酵完畢后8 000 r/min離心5 min，收集菌體，每100 mL發(fā)酵液用10 mL破碎緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl，pH 7.0）重懸菌體，200 W超聲破碎處理10 min。破碎液在4℃下12 000 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片，收集上清液。

1.2.3 ScGAD酶活力測(cè)定總反應(yīng)體系為500 μL，其中490 μL為底物緩沖液（0.2 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液，含0.04 mmol/L PLP、100 mmol/L L-谷氨酸），10 μL為酶液。在60℃反應(yīng)5 min，沸水浴5 min終止反應(yīng)。采用高效液相色譜法測(cè)定反應(yīng)生成的GABA的含量。在測(cè)定條件下每分鐘生成1 μmol GABA所需的酶定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.4 ScGAD的純化及蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測(cè)表達(dá)載體含有組氨酸標(biāo)簽，使用Ni2+親和層析法進(jìn)行純化。加入8 mL平衡緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、5 mmol/L咪唑，pH 7.0）進(jìn)行平衡，將粗酶液加載入鎳離子親和層析柱，反復(fù)上樣2次，加入8 mL清洗緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑，pH 7.0）清洗層析柱2次，以去除雜蛋白質(zhì)；加入8 mL洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑，pH 7.0）洗柱1次，收集洗脫液。采用SDS-PAGE（5 g/dL聚丙烯酰胺濃縮膠、12 g/dL分離膠）檢測(cè)ScGAD的純度，蛋白質(zhì)質(zhì)量采用Bradford法測(cè)定[20]，牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.2.5 ScGAD酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1）最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 將反應(yīng)體系先在不同溫度（20～70℃）中預(yù)熱。后加入10 μL酶液（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度0.2 mg/mL）反應(yīng)5 min，迅速置于沸水浴中5 min終止反應(yīng)，以最大酶活力為100%。將GAD在不同溫度（30～60℃）水浴不同時(shí)間（0.5～6.0 h），在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h進(jìn)行取樣測(cè)定酶活力。以0 h時(shí)的酶活力為100%，測(cè)定ScGAD在不同溫度下的殘余酶活力。

2）最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性 以最大酶活力為100%，在pH 2.4～7.0的緩沖液中分別加入酶液測(cè)定酶活力。將GAD酶液在不同pH緩沖液中（3.0～10.0），4℃條件下孵育12 h，調(diào)節(jié)pH至最適條件下測(cè)定酶活力，以孵育0 h處理的酶活力為100%，分別計(jì)算ScGAD在不同pH孵育后的殘余酶活力。

3）金屬離子對(duì)酶活力影響 在反應(yīng)體系中分別加入終濃度5 mmol/L的金屬離子Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+測(cè)定酶活力，以不添加金屬離子（對(duì)照組）的酶活力作為100%。

4）酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 在最適條件下，配置不同底物濃度（2～20 mmol/L）的緩沖體系，分別加入10 μL酶液反應(yīng)5 min，測(cè)定不同底物濃度下的酶活力，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，計(jì)算酶的Km和Vmax。

1.2.6 全細(xì)胞制備GABA的最適條件菌懸液制備：用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在600 nm處的吸光度以確定菌體渾濁程度，并控制在吸光度為5.0后終止發(fā)酵。取10%（體積分?jǐn)?shù)）發(fā)酵液?jiǎn)为?dú)離心烘干后稱質(zhì)量以計(jì)算菌體質(zhì)量，剩余發(fā)酵液離心后，加入10%發(fā)酵液體積的生理鹽水將菌體重懸，用于GABA制備及測(cè)定?？偡磻?yīng)體系為30 mL，其中全細(xì)胞添加量為3 mL菌懸液（含酶量為每克底物100 U，菌體干質(zhì)量0.13 g）。GABA生成效率計(jì)算方法如下式（1）：

式 中：y1為GABA生 成 效 率，g/（g·h）；m1為 生 成GABA的 質(zhì) 量，g；m2為 菌 體 干 質(zhì) 量，g；t為 反 應(yīng) 時(shí)間，h。

1）PLP濃度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響 在添加100 mmol/L底物條件下，反應(yīng)體系中分別加入不同濃度（0～0.10 mmol/L）的PLP反應(yīng)0.5 h，以不添加PLP的處理為對(duì)照組，測(cè)定不同PLP濃度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響。

2）底物濃度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響 在添加0.06 mmol/L PLP條件下，反應(yīng)體系中加入不同濃度（50～200 mmol/L）底物進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定不同底物濃度下全細(xì)胞制備GABA的效率。

3）pH對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響 在添加0.06 mmol/L PLP、100 mmol/L底物條件下，反應(yīng)體系使用 不 同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）緩 沖液進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定不同pH下全細(xì)胞制備GABA的效率。

4）溫度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響 在最適反應(yīng)體系與最適pH條件下，將反應(yīng)體系在不同溫度（35～65℃）下預(yù)熱后反應(yīng)，測(cè)定不同溫度下全細(xì)胞制備GABA的效率。

5）全細(xì)胞制備GABA的轉(zhuǎn)化率 在確定最優(yōu)條件后，將反應(yīng)體系在0.5～3.0 h內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定GABA的轉(zhuǎn)化率，計(jì)算方法如下式（2）：

式中：y2為GABA的轉(zhuǎn)化率；M1為生成GABA的濃度；M2為底物濃度。

1.2.7 GABA含量的測(cè)定GABA含量的測(cè)定使用改進(jìn)的高效液相色譜法柱前衍生法[21-23]，液相柱：Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，0.5 μm）使用丹黃酰氯（1-二甲氨基-萘-5-磺酰氯，DNS-CL）作為衍生劑。衍生體系400 μL，其中待測(cè)樣品20 μL，碳酸氫鈉緩沖液0.1 mol/L（pH 9.8）180 μL，丹磺酰氯-丙酮溶液（4 g/L）200 μL，于37℃下避光反應(yīng)1 h。流動(dòng)相：A甲醇，B四氫呋喃-甲醇-50 mmol/L乙酸鈉（pH 6.2，體積比5∶75∶420）；流量：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25℃；檢測(cè)時(shí)間：30 min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性回歸方程為y=8.106 7x-3.030 4，x為GABA濃度，y為信號(hào)峰面積，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 8，大于0.990 0，表明自變量與因變量之間的線性關(guān)系良好，可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 GABA standard curve

2 結(jié)果與分析

2.1 ScGAD的純化及SDS-PAGE分析

根據(jù)釀酒酵母全基因組序列進(jìn)行GAD基因克隆，編碼基因長(zhǎng)度為1 755 bp，無內(nèi)含子，總計(jì)585個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)理論相對(duì)分子質(zhì)量約為65 000。進(jìn)一步構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-21a（+）-GAD，并在E.coli BL21（DE3）中異源表達(dá)，其酶活力為2.06 U/mL。通過Ni2+親和層析純化單一電泳條帶（見圖2），與預(yù)測(cè)GAD相對(duì)分子質(zhì)量大小一致。純化結(jié)果如表1所示。經(jīng)親和純化后，純酶的回收率為65.3%，提高倍數(shù)為13.80倍，比活力為66.55 U/mg。

表1 ScGAD的分離純化Table 1 Separation and purification of ScGAD

圖2 pET-21a（+）-ScGAD純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of pET-21a（+）-ScGAD purified product

2.2 ScGAD的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 ScGAD的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性不同溫度下檢測(cè)酶活力發(fā)現(xiàn)（見圖3），ScGAD的最適反應(yīng)溫度為60℃。在20～60℃時(shí)，隨著溫度升高，酶活力逐漸升高；當(dāng)溫度超過60℃后，酶活力急劇下降。進(jìn)一步對(duì)酶的溫度穩(wěn)定性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ScGAD在30～50℃條件下，5.0 h內(nèi)仍具有約80%殘余酶活力；而60℃條件下，酶活力下降較快，6.0 h孵育反應(yīng)后，僅有20%的殘余酶活力。以上研究結(jié)果表明，ScGAD具有優(yōu)越的溫度穩(wěn)定性，對(duì)工業(yè)加工的應(yīng)用前景良好。

圖3 ScGAD的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.3 Optimal temperature and thermostabiligy of ScGAD

2.2.2 ScGAD的最適pH及pH穩(wěn)定性通過測(cè)定不同pH下的相對(duì)酶活力發(fā)現(xiàn)，ScGAD的最適反應(yīng)pH為4.0（見圖4）。在pH 2.4～4.0時(shí)，酶活力隨著pH的升高逐漸升高；在pH 4.0～5.6時(shí)酶活力隨著pH的升高緩慢下降。當(dāng)pH接近中性時(shí)，相對(duì)酶活力從50%急劇下降至無活性。該酶的最適pH與其他來源的谷氨酸脫羧酶的最適pH基本一致[24-25]，原因是微生物來源的GAD在酸性范圍內(nèi)具有活性，酶促反應(yīng)過程需要消耗溶液中的H+以催化底物脫羧生成GABA，當(dāng)溶液接近中性時(shí)，反應(yīng)體系中H+變少，無法完成底物催化，而過低的pH環(huán)境會(huì)引起酶變性失去酶活[26]。pH穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，GAD在pH 4.0～9.0具有良好的穩(wěn)定性，經(jīng)12 h孵育反應(yīng)，仍能保持70%以上殘余酶活力，其中pH為5.0時(shí)，ScGAD的酶活性最穩(wěn)定。

圖4 ScGAD的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性Fig.4 Optimal pH,pH stability of ScGAD

2.2.3 金屬離子對(duì)ScGAD的影響通過測(cè)定金屬離子對(duì)ScGAD的影響發(fā)現(xiàn)（見表2），Mg2+、Fe2+、Cu2+會(huì)抑制該酶10%～15%的酶活力，而其他金屬離子對(duì)酶活力的影響較小，幾乎沒有促進(jìn)或抑制作用。因此，后續(xù)GAD的工業(yè)應(yīng)用中不需要額外添加金屬離子，可節(jié)約生產(chǎn)成本。

表2 金屬離子對(duì)ScGAD相對(duì)酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions on the relative activity of ScGAD

2.2.4 ScGAD的動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究進(jìn)一步對(duì)ScGAD進(jìn)行酶促動(dòng)力學(xué)分析，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，計(jì)算重組酶對(duì)底物L(fēng)-谷氨酸的Km和Vmax，結(jié)果如圖5所示，米氏常數(shù)Km為14.28 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax為0.59 mmol/（L·min）。

圖5 ScGAD動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定曲線Fig.5 Kinetic parameters of ScGAD

2.3 全細(xì)胞制備GABA的最適條件探究

2.3.1 PLP濃度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響PLP作為輔酶可與底物L(fēng)-谷氨酸結(jié)合形成Schiff堿結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以降低谷氨酸脫羧反應(yīng)的活化能，從而提高酶促反應(yīng)速率[27]。通過考察PLP對(duì)GAD催化反應(yīng)的影響發(fā)現(xiàn)，添加0.10 mmol/L PLP對(duì)GABA生成效率提升最高，是無添加PLP對(duì)照組的8倍，可以達(dá)到16.7 g/（g·h）（見圖6）。而PLP添加濃度在0.06～0.10 mmol/L時(shí)，GABA的生成效率變化不大，綜合考慮PLP添加成本，最終選取PLP濃度為0.06mmol/L添加至全細(xì)胞反應(yīng)體系。

圖6 PLP濃度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響Fig.6 Effects of PLP concentration on the production of GABA in whole cells by ScGAD

2.3.2 底物濃度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響GABA制備過程中底物濃度變化可能會(huì)影響細(xì)胞膜兩側(cè)的滲透壓，進(jìn)而影響GABA生成效率，因此需要考察不同底物濃度對(duì)GABA制備過程的影響。如圖7所示，當(dāng)濃度小于100 mmol/L，隨著底物濃度的增大，產(chǎn)物的生成效率逐漸提高，且在濃度為100 mmol/L，達(dá)到最大生成效率22.2 g/（g·h）。而濃度超過100 mmol/L，GABA生成效率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，這可能是ScGAD的催化反應(yīng)存在底物抑制或過高的環(huán)境滲透壓抑制底物轉(zhuǎn)運(yùn)的原因，因此反應(yīng)體系中過高的底物濃度會(huì)影響細(xì)胞對(duì)于底物的轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。

圖7 底物濃度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響Fig.7 Effects of substrate concentration on the production of GABA in whole cells by ScGAD

2.3.3 pH對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響ScGAD是一種酸性酶，因此考察pH對(duì)GAD制備GABA的影響十分必要。如圖8所示，在pH 3.0～5.5時(shí)，GABA生成效率均較高，其中pH為4.0時(shí)生成效率最高，達(dá)到28.8 g/（g·h）。這說明GAD可在寬泛pH范圍內(nèi)制備GABA，滿足工業(yè)應(yīng)用中復(fù)雜多變的pH條件。

圖8 pH對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響Fig.8 Effects of pH on the production of GABA in whole cells by ScGAD

2.3.4 溫度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響溫度是影響GABA制備的重要因素之一，通過研究溫度對(duì)ScGAD全細(xì)胞制備GABA的影響發(fā)現(xiàn)，在35～50℃下，GABA生成效率均較低，最高僅能達(dá)到6.5 g/（g·h），而催化溫度在55～65℃時(shí)，GABA生成效率均較高，且在60℃下產(chǎn)物的生成效率最高達(dá)到35.9 g/（g·h）（見圖9）。因此60℃為GAD的最適反應(yīng)溫度，反應(yīng)溫度低于60℃，GAD相對(duì)酶活力低導(dǎo)致催化效率低，而反應(yīng)溫度高于60℃，重組酶的穩(wěn)定性受到影響。以上研究結(jié)果證明重組酶可在高溫下高效合成GABA。

圖9 溫度對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響Fig.9 Effects of temperature on the production of GABA in whole cells by ScGAD

2.3.5 全細(xì)胞制備GABA的轉(zhuǎn)化率在確定最優(yōu)條件后，通過研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)ScGAD全細(xì)胞制備GABA的轉(zhuǎn)化率發(fā)現(xiàn)，在0.5～2.5 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，GABA轉(zhuǎn)化率逐漸提高，但提高幅度逐漸變慢，可能原因是酶在60℃時(shí)穩(wěn)定性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到2.5 h時(shí)，GABA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%，產(chǎn)量為10.3 g/L，并隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)不再變化（見圖10）。以上研究結(jié)果說明重組酶可在較短的時(shí)間內(nèi)高效合成GABA。

圖10 反應(yīng)時(shí)間對(duì)全細(xì)胞制備GABA的影響Fig.10 Effects of reaction time on the preparation of GABA in whole cells by ScGAD

3 討論

近年來，谷氨酸脫羧酶因其可應(yīng)用于功能性物質(zhì)GABA生產(chǎn)已成為研究熱點(diǎn)之一。雖然研究學(xué)者們已從多種微生物中挖掘并表征了谷氨酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)，但這些來源的GAD難以滿足工業(yè)應(yīng)用需求。目前有關(guān)釀酒酵母谷氨酸脫羧酶研究較少[29]，作者通過對(duì)釀酒酵母谷氨酸脫羧酶基因進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)該酶的比活力高達(dá)66.55 U/mg，顯著高于一些微生物來源的GAD的比活力，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，比活力37.60 U/mg）[30]，以及短乳桿菌Lb85（Lactobacillus brevis，比活力38.46 U/mg）[31]等。

酶學(xué)性質(zhì)研究表明，ScGAD的熱穩(wěn)定較好，在50℃下孵育2 h的殘余酶活力高于大腸桿菌谷氨酸脫羧酶在50℃下的殘余酶活力（60%）[18]，且在30～50℃下孵育5.0 h后殘余酶活力仍約為80%。ScGAD的最適反應(yīng)pH為4.0，這與大部分其他來源的GAD的最適pH為弱酸性相一致[24-25，32]。值得關(guān)注的是，ScGAD在pH 4.0～9.0反 應(yīng)12 h仍 可 保 留70%以上殘余酶活力，比其他來源的GAD的pH穩(wěn)定范圍更寬泛[17，33]。因此，本研究中的ScGAD具有良好的熱穩(wěn)定性和寬泛的pH穩(wěn)定性，有利于其耐受食品加工過程中復(fù)雜多變的pH及溫度環(huán)境，在食品加工領(lǐng)域中具有廣闊應(yīng)用前景。另外，ScGAD的催化反應(yīng)體系不需要額外加入金屬離子，這與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[14]來源的GAD的性質(zhì)相一致。此外，ScGAD的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為14.28 mmol/L，表明其對(duì)底物L(fēng)-谷氨酸的親和力顯著高于植物來源GAD（米糠GAD，Km為37.30 mmol/L）[34]、（發(fā)芽粟谷GAD，Km為22.36 mmol/L）[35]以及微生物來源GAD（短乳桿菌CGMCC1306 GAD，Km為63.70 mmol/L）[19]。總之，ScGAD的優(yōu)良性質(zhì)，能夠滿足食品工業(yè)應(yīng)用的需求，以及對(duì)GABA的工業(yè)生產(chǎn)具有巨大的應(yīng)用潛力。

另外，國(guó)內(nèi)外對(duì)不同來源的GAD制備GABA也均有研究，李祥從乳酸菌中挖掘到一種谷氨酸脫羧酶LsGAD，其在添加6 g/L的L-谷氨酸后，24 h轉(zhuǎn)化率達(dá)到58%[36]；田靈芝等對(duì)植物乳桿菌來源的谷氨酸脫羧酶IPGAD進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化，在5 L發(fā)酵體系中，轉(zhuǎn)化24 h，生成GABA 204 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到97.92%[37]。作者通過全細(xì)胞制備GABA的最適條件研究發(fā)現(xiàn)，ScGAD的最適催化pH為4.0，這與其他研究者挖掘的其他來源的GAD的研究結(jié)果一致[38-39]；ScGAD最適催化溫度為60℃，而Yang等報(bào)道的唾液鏈球菌來源的酶最適催化溫度為55℃[40]，這可能是由于GAD的來源不同其性質(zhì)大不相同；ScGAD反應(yīng)體系中添加0.06 mmol/L PLP可有效提高GABA生成效率，這與徐林敏的報(bào)道研究[41]相一致；在最適催化條件下時(shí)，GABA的生成效率可達(dá)35.9 g/（g·h），反應(yīng)2.5 h可將底物催化生成GABA，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了99%，GABA質(zhì)量濃度達(dá)到10.3 g/L。該產(chǎn)率還有待進(jìn)一步提升，后續(xù)還將進(jìn)行擴(kuò)大反應(yīng)體系以及加入分批補(bǔ)料后的催化研究，同時(shí)通過酶分子改造提升其酶催化效率及其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。