張憶雪，周 明，譙英固，王呈諭，孫震曉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488)

人尿源性干細(xì)胞(human urine-derived stem cells，hUSCs)是從人尿液中分離培養(yǎng)出的一種具有良好增殖活性和多向分化能力的細(xì)胞亞群[1]。研究表明，hUSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的多種生物學(xué)特征，且取材方便、無創(chuàng)、成本較低，在組織修復(fù)、疾病治療等領(lǐng)域均有重要的研究價(jià)值[2-5]。然而，hUSCs與其他干細(xì)胞一樣，也存在隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，細(xì)胞干性逐漸減弱的問題，一定程度上影響了hUSCs的有效應(yīng)用[6]。

Bharadwaj等[7]研究發(fā)現(xiàn)，來自不同個(gè)體所培養(yǎng)的hUSCs均高表達(dá)腎臟及腎小球足細(xì)胞的特異基因和蛋白標(biāo)志物，揭示hUSCs可能來源于腎臟。淫羊藿作為補(bǔ)腎中藥的代表，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效[8]。淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿的主要活性成分，口服后經(jīng)腸道細(xì)菌分解能夠產(chǎn)生脫水淫羊藿素(dehydrated icaritin，DICT)等多種代謝產(chǎn)物[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，DICT能夠有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，修復(fù)裸鼠臨界性顱骨缺損[11-12]。此外，基于課題組前期利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)數(shù)據(jù)庫和分子對接技術(shù)對維持hUSCs干性的小分子化合物進(jìn)行篩選所得到的結(jié)果來看，DICT可能具有潛在的維持hUSCs干性的作用(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，本研究以hUSCs為研究對象，探討DICT對其干性的影響，為后續(xù)開展hUSCs相關(guān)研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品

脫水淫羊藿素，純度≥99%，購自上海源葉生物科技有限公司(批號YA0903SA13)。

1.2 主要試劑與儀器

角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(keratinocyte serum free medium，KSFM)培養(yǎng)基、高糖-DMEM培養(yǎng)基、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)細(xì)胞培養(yǎng)添加物購自Gibco公司；Ham’s F12培養(yǎng)基購自Corning公司；青霉素-鏈霉素購自Amresco公司；胎牛血清購自Biological Industries公司；人表皮生長因子EGF購自美國Peprotech公司；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa)購自北京拜爾迪生物科技有限公司；四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)購自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司；PE-Cy7鼠抗人CD31、PE鼠抗人CD34、FITC鼠抗人CD44、APC鼠抗人CD90抗體均購自BD Pharmingenn公司；大容量多管離心機(jī)(LXJ-IIB)購自安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司；MCO-18AIC(UV)細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Sanyo公司；ECLIPSE TE2000-S倒置相差顯微鏡購自Nikon公司；酶標(biāo)儀購自Bio-Tek公司；流式細(xì)胞儀(Beckman CytoFLEXS)購自美國Beckman公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudioTM6 Flex)購自美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 hUSCs的分離與培養(yǎng)無菌條件下收集健康志愿者新鮮尿液樣本200～300 mL至無菌燒杯中。參照文獻(xiàn)[13]，室溫下以1 000 r/min離心10 min，棄上清，用1 mL PBS緩沖液洗滌沉淀，室溫下再以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL hUSCs培養(yǎng)基輕柔重懸細(xì)胞后將其均勻接種在24孔板中，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃條件培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，記為P0代。培養(yǎng)后第3天補(bǔ)500μL培養(yǎng)基，第5、6天分別半換液，之后每48 h進(jìn)行一次半換液，待細(xì)胞長至匯合度為90%～100%時(shí)用胰酶消化傳代。通過倒置相差顯微鏡觀察hUSCs的細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

1.3.2 MTT法檢測hUSCs生長曲線及DICT對hUSCs活力的影響取生長狀況良好的P2代細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1 000個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，每孔200μL培養(yǎng)基，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)7 d。每天在鋪板同一時(shí)間點(diǎn)前4 h更換為100μL MTT工作液，繼續(xù)在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃條件下孵育4 h，棄去MTT培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，震蕩10～15 min至MTT代謝產(chǎn)物藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測吸光值，并繪制hUSCs的時(shí)間-吸光度生長曲線。DICT處理組細(xì)胞接種培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁并且生長良好時(shí)，去除培養(yǎng)基，分別加入含有0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol/L脫水淫羊藿素的培養(yǎng)基200μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作用時(shí)間為1～7 d。后續(xù)處理同上。按下列公式計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=D(570)DICT藥物組/D(570)對照組×100%

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測hUSCs表面標(biāo)志物取生長狀況良好的hUSCs的P2代細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS緩沖液洗滌重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為6×105個(gè)/mL，分別取200μL細(xì)胞懸液于兩個(gè)5 mL EP管中，并加入小鼠抗人抗體CD34-PE、CD31-PE-Cy7及CD44-FITC、CD90-APC，4℃、避光條件下孵育30 min，再加500μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，室溫下以300 g離心5 min，棄上清，加入200 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，過濾后上流式細(xì)胞儀檢測[14]。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測干性相關(guān)基因OCT-4、C-MYC的表達(dá)經(jīng)文獻(xiàn)挖掘，與間充質(zhì)干細(xì)胞干性相關(guān)的基因包括OCT-4、C-MYC、SOX2、NANOG、REX1等。Sato等[15]發(fā)現(xiàn)BIO能通過激活Wnt信號通路促進(jìn)胚胎干細(xì)胞干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OCT-4、REX1和NANOG的表達(dá)，從而維持胚胎干細(xì)胞干性和自我更新能力。李佳瑋等[16]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中OCT-4、SOX2、NANOG、C-MYC等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，提高細(xì)胞的干性水平。課題組前期研究表明，作為成體干細(xì)胞，hUSCs中的OCT-4、C-MYC基因表達(dá)較穩(wěn)定，與其干性相關(guān)性強(qiáng)。因此，本研究首先選擇OCT-4、C-MYC兩種基因作為判斷hUSCs干性強(qiáng)弱的檢測指標(biāo)。OCT-4、C-MYC與干細(xì)胞的干性維持密切相關(guān)，一般隨著干細(xì)胞繼代次數(shù)增加表達(dá)下降[17-19]。取生長狀況較好的P4代細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組平行設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，每孔加入1.5 mL培養(yǎng)基，在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁并且生長良好時(shí)，去除培養(yǎng)基，加入含有2.0 μmol/L脫水淫羊藿素的培養(yǎng)基2.5 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)，并拍照記錄。先按照RNA pure Total RNA Kit說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，再按照Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)對基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)中所用引物的序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS Statistics 20.0和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)對兩樣本均數(shù)進(jìn)行比較，采用單因素方差分析對多樣本均數(shù)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)hUSCs的形態(tài)學(xué)觀察

見圖1。從健康志愿者新鮮尿液中分離培養(yǎng)的hUSCs于接種后24～72 h后開始貼壁(圖1A)，大約6～8 d后細(xì)胞逐漸形成集落(圖1B)，8～12 d后細(xì)胞開始呈克隆狀生長(圖1C)，大約16 d后細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)到約90%～100%的匯合度(圖1D)開始進(jìn)行第1次傳代培養(yǎng)，23 d后P2代細(xì)胞仍保持活力，形態(tài)呈飽滿的梭形(圖1E)，35 d后P4代細(xì)胞形態(tài)仍保持良好(圖1F)。

圖1 hUSCs原代及繼代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2 hUSCs細(xì)胞生長曲線

MTT法檢測hUSCs細(xì)胞體外生長曲線，結(jié)果如圖2所示，基本呈S型曲線，1～4 d hUSCs增殖較快，細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)生長期，5～7 d細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期。

圖2 hUSCs生長曲線

2.3 hUSCs的表面標(biāo)志物鑒定

流式細(xì)胞術(shù)測定hUSCs表面標(biāo)志物結(jié)果如圖3所示，實(shí)驗(yàn)所用P2代hUSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44陽性率為74.10%，CD90陽性率為99.94%，CD34陽性率為2.12%，CD31陽性率為0.10%，表明hUSCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90和CD44，幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31。

圖3 hUSCs表面標(biāo)志物抗原表達(dá)

2.4 DICT對hUSCs活力的影響

MTT檢測0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol/L DICT對hUSCs細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖4所示，6個(gè)濃度的DICT作用于hUSCs 3～6 d后，均有維持其細(xì)胞活力的作用。與對照組比較，DICT給藥濃度為2.0 μmol/L時(shí)，第3～6天細(xì)胞活力均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；給藥濃度為1.5和2.5μmol/L時(shí)，第3～5天細(xì)胞活力均明顯升高(P＜0.01)，第6天差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。第7天時(shí)細(xì)胞活力均處于較低水平。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選用2.0μmol/L的DICT進(jìn)行后續(xù)干性基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖4 DICT對hUSCs細(xì)胞活力的影響

2.5 DICT作用后hUSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對2.0μmol/L DICT分別作用3 d和7 d后的P4代hUSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，2.0μmol/L DICT作用hUSCs 3 d后的生物學(xué)形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量基本無明顯變化；作用7 d后，hUSCs雖形態(tài)上變化不大，但細(xì)胞數(shù)量有所增加。

圖5 DICT作用于hUSCs的形態(tài)學(xué)觀察

2.6 DICT對hUSCs干性基因OCT-4、C-MYC mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果如圖6所示，與對照組對比，2.0μmol/L DICT組hUSCs干性基因OCT-4和C-MYC的mRNA表達(dá)量均顯著升高(P＜0.01)，表明2.0μmol/L DICT可使hUSCs干性基因OCT-4和C-MYC的表達(dá)上調(diào)。

圖6 DICT對hUSCs干性基因OCT-4、C-MYC mRNA表達(dá)的影響

3 討論

人尿源性干細(xì)胞作為一種來源廣泛、可在體外大量增殖的成體干細(xì)胞，現(xiàn)已在心血管、皮膚、骨骼修復(fù)以及疾病細(xì)胞造模等方面得到廣泛應(yīng)用[20-22]，但也存在著傳代過程中隨代數(shù)增加細(xì)胞出現(xiàn)衰老、分化等問題[23]。本研究基于課題組前期篩選結(jié)果、實(shí)驗(yàn)研究及相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研[24-26]，推測DICT可能具有維持hUSCs干性的作用，并選擇OCT-4、C-MYC兩種基因作為判斷hUSCs干性強(qiáng)弱的檢測指標(biāo)，在細(xì)胞及分子層面上分別探究DICT對hUSCs干性的影響。通過常溫離心法成功培養(yǎng)出形態(tài)良好、具有間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征的hUSCs，離心這一過程可將尿液中脫落的上皮細(xì)胞及雜質(zhì)去除，隨著繼代培養(yǎng)過程，尿液中其他存活的細(xì)胞不再增殖，僅hUSCs仍保持旺盛的增殖能力。此外，通過MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定DICT增強(qiáng)hUSCs活性的最適濃度，通過qPCR進(jìn)一步探究了DICT對hUSCs干性基因OCT-4和C-MYCmRNA表達(dá)的影響，結(jié)果表明，DICT在一定濃度下具有維持hUSCs干性的作用。

研究表明，影響間充質(zhì)干細(xì)胞干性的相關(guān)基因除OCT-4、C-MYC外還有NANOG、SOX2、REX1等，我們之前對這些基因在hUSCs中的表達(dá)及其與干細(xì)胞干性的相關(guān)性做過一些探索，發(fā)現(xiàn)SOX2和NANOG基因在hUSCs中低表達(dá)且表達(dá)不穩(wěn)定，REX1表達(dá)變化較小指示性較弱，而OCT4和C-MYC基因表達(dá)較穩(wěn)定且指示性強(qiáng)(結(jié)果未列出)，因此在本文研究DICT對hUSCs干性基因的影響中首先選擇這兩種基因作為研究對象。后續(xù)我們需要進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)志性基因的檢測，如對一些干細(xì)胞分化相關(guān)基因如ALP、SOX9、PPAR-γ2等表達(dá)的檢測，并借助生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)手段深入闡明其相關(guān)作用機(jī)制，以進(jìn)一步確認(rèn)促進(jìn)hUSCs干性的小分子化合物，為hUSCs的研究與臨床應(yīng)用提供支持[27]。

中醫(yī)經(jīng)典著作內(nèi)經(jīng)《素問·六節(jié)藏象論》中有記載“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“精”是生命的起源，主要儲存在腎中，因此被稱為腎精[28]。干細(xì)胞作為形成機(jī)體和各器官組織的原始細(xì)胞，在生命起源及生理功能上與“腎精”有較多共性，是腎精的重要細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)[29]。如前所述，淫羊藿是中醫(yī)臨床重要的補(bǔ)腎中藥之一[30]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，淫羊藿苷及其他淫羊藿成分也具有一定的促間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化作用[31-33]。此外，有關(guān)淫羊藿主要成分與其他藥物聯(lián)用對間充質(zhì)干細(xì)胞的影響也逐漸被關(guān)注：有實(shí)驗(yàn)表明，淫羊藿苷與雌激素聯(lián)用較單用顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，且能夠規(guī)避雌激素替代療法的副作用[34]；淫羊藿苷與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用比單用促進(jìn)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的效果更好[35]。今后有關(guān)DICT及其他淫羊藿成分對干細(xì)胞增殖、分化及干性維持的研究還可以在多藥聯(lián)用、3D模型構(gòu)建等領(lǐng)域繼續(xù)探索，這對解析淫羊藿的補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效作用具有重要意義。