凌 敏，施偉慶，張 薇，梁 婕

(江蘇省疾病預(yù)防控制中心毒理與風(fēng)險(xiǎn)評估研究所，江蘇 南京 210009)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種三肽，是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及磷酸丙糖脫氫酶的輔酶[1]。還原型谷胱甘肽是人體內(nèi)自身合成的一種活性成分，具有酶活性和抗氧化活性，是體內(nèi)重要的自由基清除劑[2]。臨床上還原型谷胱甘肽已經(jīng)廣泛用于多種疾病的治療。維生素C(vitamin C，Vit.C)系脯氨酸羥化酶等8種酶的輔助因子或組成成分，直接參與體內(nèi)的氧化-還原及羥化反應(yīng)[3]。Vit.C作為一種抗氧化劑，除了可以保護(hù)細(xì)胞免受有害因素所引起的氧化性損傷外，在機(jī)體的新陳代謝中包括蛋白質(zhì)的修飾、基因的表達(dá)以及生物防御功能的激活等均起著重要作用[4]。

本產(chǎn)品谷胱甘肽Vit.C片作為一種護(hù)肝片，對化學(xué)性肝損傷有一定的保護(hù)作用。本文根據(jù)2003年版《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，進(jìn)行30天喂養(yǎng)試驗(yàn)，通過觀察大鼠的一般表現(xiàn)、血液學(xué)及血生化指標(biāo)、組織病理學(xué)改變等對其進(jìn)行安全性評價(jià)。為谷胱甘肽Vit.C片的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

4周齡SD大鼠80只，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0011；屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(蘇)2017-0031。實(shí)驗(yàn)室溫度20～24°C，濕度40%～70%。試驗(yàn)期間動物自由飲水、攝食。

1.2 樣品

谷胱甘肽Vit.C片由南京某生物有限公司提供，生產(chǎn)批號2016062303。成人(體質(zhì)量以60 kg計(jì))推薦劑量為每人1 000 mg/d，即16.67 mg/(kg·d)。

1.3 主要試劑和儀器

生化試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司)，全自動生化分析儀(日本Olympus公司)，ADVIA?2120血細(xì)胞分析儀(德國Siemens公司)，RM-2245病理切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為低、中、高劑量組(分別為417、834、1 667 mg/kg，相當(dāng)于人體推薦劑量的25、50、100倍)和對照組(滅菌基礎(chǔ)飼料)。按劑量組設(shè)計(jì)要求分別稱取83、167和333 g的谷胱甘肽Vit.C片加入至2 kg基礎(chǔ)飼料中混勻后制成顆粒飼料，再以每日約100 g/mg的攝食量給于大鼠自由食用，連續(xù)喂養(yǎng)30 d。期間每天觀察動物的一般表現(xiàn)，每周記錄大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量，并與對照組比較。

1.5 血清生化和血液學(xué)指標(biāo)檢測

喂養(yǎng)30天后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血，進(jìn)行血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)等血清生化指標(biāo)檢測和血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)總數(shù)及中性粒細(xì)胞(NE)、淋巴細(xì)胞(LY)、單核細(xì)胞(MO)、嗜酸性粒細(xì)胞(EO)、嗜堿性粒細(xì)胞(BA)分類等血液學(xué)指標(biāo)檢測。

1.6 組織病理學(xué)檢查

采血結(jié)束后頸椎脫臼法處死大鼠，對各主要臟器進(jìn)行大體觀察，取肝、脾、腎、胃、睪丸或卵巢稱量并計(jì)算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)，臟器以10%甲醛固定后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)；若方差不齊，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)期間，各劑量組大鼠的生長發(fā)育良好，一般表現(xiàn)和行為均未見異常，亦無死亡情況；各劑量組雌雄大鼠多個(gè)觀察點(diǎn)的體質(zhì)量和總體質(zhì)量增量與對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠體質(zhì)量的影響(g，±s，n=10)

表1 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠體質(zhì)量的影響(g，±s，n=10)

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)第0天74±4 73±4 74±4 74±4 78±6 77±6 78±6 77±6第7天121±8 123±4 124±8 121±6 142±8 145±11 141±10 142±10第14天164±7 164±8 170±17 160±10 207±12 214±14 209±9 209±14第21天188±8 190±7 197±18 187±13 273±12 273±14 272±15 272±19第30天223±11 229±14 237±23 220±18 364±20 353±20 353±22 355±30體質(zhì)量增量148±11 156±16 163±23 145±18 286±21 276±17 275±22 278±26

2.2 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠攝食量及食物利用率的影響

由表2和表3可見，對照組相比，雌雄大鼠不同觀察點(diǎn)及總的進(jìn)食量和食物利用率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠每周進(jìn)食量及總進(jìn)食量的影響(g，±s，n=10)

表2 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠每周進(jìn)食量及總進(jìn)食量的影響(g，±s，n=10)

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)第1～7天119±10 117±7 120±9 118±9 137±9 137±10 133±14 134±9第8～14天155±12 161±9 164±15 153±12 175±10 182±13 176±11 179±9第15～21天137±7 142±9 139±6 135±7 196±7 189±8 192±9 190±9第22～30天165±8 174±12 174±14 166±14 253±19 244±18 244±15 251±19總進(jìn)食量576±24 594±29 597±24 572±29 761±21 753±36 745±35 754±30

表3 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠食物利用率的影響(%，±s，n=10)

表3 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠食物利用率的影響(%，±s，n=10)

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)第1～7天39.8±6.4 42.1±2.4 41.9±5.6 39.6±6.3 47.6±5.0 49.3±2.4 47.5±4.3 48.9±3.5第8～14天27.7±5.5 25.7±2.8 27.5±6.7 25.7±3.1 36.9±5.2 37.9±3.5 38.6±2.6 37.5±3.5第15～21天17.2±3.6 18.6±2.5 20.1±5.3 20.1±2.8 33.5±3.8 31.4±5.2 33.2±5.1 33.3±4.3第22～30天21.3±5.1 22.3±4.7 23.0±5.4 19.6±6.2 36.3±6.8 32.6±3.7 33.0±5.1 32.7±6.6總食物利用率25.8±2.2 26.2±1.8 27.3±3.3 25.4±2.5 37.6±2.1 36.6±1.2 36.9±2.8 36.8±3.0

2.3 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

由表4和表5可見，對照組相比，各劑量組大鼠的血常規(guī)及白細(xì)胞分類值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明谷胱甘肽Vit.C片對大鼠的血液學(xué)指標(biāo)未造成明顯影響。

表4 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠血常規(guī)的影響(±s，n=10)

表4 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠血常規(guī)的影響(±s，n=10)

白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(HGB).

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)WBC/(×109/L)7.7±2.4 7.7±1.4 7.1±1.5 7.9±1.9 8.5±1.7 9.1±1.5 8.8±1.8 8.7±2.0 RBC/(×1012/L)6.6±0.3 6.6±0.2 6.5±0.3 6.6±0.1 6.6±0.2 6.7±0.3 6.6±0.4 6.5±0.3 PLT/(×109/L)1 104±166 1 113±180 1 060±140 1 089±142 1 112±121 1 061±113 1 120±137 1 152±128 HGB/(g/dL)11.8±0.5 11.8±0.5 11.7±0.6 12.1±0.4 11.9±0.4 11.9±0.6 11.9±0.6 11.8±0.6

表5 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠白細(xì)胞分類的影響(%，±s，n=10)

表5 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠白細(xì)胞分類的影響(%，±s，n=10)

中性粒細(xì)胞(NE)、淋巴細(xì)胞(LY)、單核細(xì)胞(MO)、嗜酸性粒細(xì)胞(EO)、嗜堿性粒細(xì)胞(BA).

BA 0.16±0.08 0.17±0.07 0.18±0.09 0.19±0.07 0.17±0.08 0.16±0.07 0.20±0.05 0.19±0.07性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)NE 17.6±4.4 17.5±4.4 17.8±6.6 14.3±4.0 18.6±5.2 17.8±3.8 15.9±3.5 16.8±3.4 LY 76.6±5.2 77.2±5.0 75.5±8.4 79.7±4.8 76.7±5.6 77.5±4.0 78.4±3.9 78.2±3.5 MO 3.2±1.0 2.8±0.7 3.9±0.9 3.3±0.9 3.2±1.1 3.2±0.5 3.9±0.8 3.4±0.8 EO 1.6±0.7 1.3±0.4 1.8±1.5 1.7±1.3 0.6±0.2 0.9±0.3 1.0±0.3 0.8±0.3

2.4 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠血生化指標(biāo)的影響

由表6可見，與對照組相比，高劑量組雄性大鼠BUN值和雌性大鼠CRE值均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但數(shù)值仍在本實(shí)驗(yàn)室歷史正常值范圍內(nèi)。其余各劑量組的多項(xiàng)血生化指標(biāo)值與對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表6 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠部分血生化的影響(±s，n=10)

表6 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠部分血生化的影響(±s，n=10)

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHO)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)。與對照組相比，*P＜0.05.

性別雌性雄性組別對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)對照組低劑量組(417 mg/kg)中劑量組(834 mg/kg)高劑量組(1 667 mg/kg)ALT/(U/L)41±7 40±8 37±7 42±11 53±9 47±7 46±9 45±8 AST/(U/L)151±21 149±29 150±27 164±36 160±40 137±22 172±16 169±21 GLU/(mmol/L)5.9±0.3 5.9±0.4 5.8±0.4 5.6±0.4 6.2±0.8 6.6±0.3 5.7±0.6 5.7±0.3 TG/(mmol/L)0.85±0.26 0.80±0.39 0.92±0.42 0.78±0.17 1.34±0.52 1.14±0.31 1.37±0.43 0.98±0.37 CHO/(mmol/L)2.39±0.47 2.43±0.49 2.56±0.40 2.63±0.57 2.05±0.17 2.00±0.27 2.11±0.27 2.32±0.27 TP/(g/L)68±4 68±5 67±5 69±5 58±2 57±3 58±2 58±3 ALB/(g/L)40±3 40±3 39±3 40±3 30±1 30±1 31±1 31±1 BUN/(mmol/L)5.3±0.9 5.2±0.7 5.5±0.9 5.7±0.6 4.0±0.5 4.3±0.5 4.4±0.5 4.7±0.5*CRE/(μmol/L)25±2 25±3 26±1 28±4*22±2 21±1 22±2 22±1

2.5 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠臟器系數(shù)及組織病理的影響

從表7可見，與對照組相比，各劑量組大鼠臟器系數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。大體檢查均未發(fā)現(xiàn)各劑量組臟器出現(xiàn)明顯異常，高劑量組的各大鼠肝、脾、腎、胃、卵巢或睪丸均未出現(xiàn)與谷胱甘肽Vit.C片有明顯相關(guān)的組織病理學(xué)改變(見圖1)。

表7 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠臟器系數(shù)的影響(%，±s，n=10)

表7 谷胱甘肽Vit.C片對大鼠臟器系數(shù)的影響(%，±s，n=10)

*：雌鼠未作卵巢系數(shù)檢測.

性別雌性睪丸系數(shù)*----0.88±0.11 0.86±0.14 0.88±0.13 0.89±0.09雄性組別對照組低劑量(417 mg/kg)中劑量(834 mg/kg)高劑量(1 667 mg/kg)對照組低劑量(417 mg/kg)中劑量(834 mg/kg)高劑量(1 667 mg/kg)肝系數(shù)3.68±0.21 3.80±0.34 3.64±0.29 3.68±0.27 3.61±0.22 3.51±0.38 3.52±0.31 3.51±0.32腎系數(shù)0.88±0.03 0.88±0.06 0.87±0.06 0.84±0.07 0.86±0.09 0.84±0.05 0.86±0.06 0.86±0.08脾系數(shù)0.23±0.04 0.24±0.04 0.26±0.09 0.23±0.03 0.24±0.03 0.24±0.04 0.25±0.03 0.25±0.02

圖1 各胱甘肽Vit.C片連續(xù)30天喂養(yǎng)后的大鼠組織切片圖(×200)

3 討論

氧化還原狀態(tài)的失衡在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中均扮演著重要角色，氧化應(yīng)激反應(yīng)會引起組織炎癥和損傷，谷胱甘肽的主要生理作用之一就是作為體內(nèi)的一種重要抗氧化劑，可以通過清除或中和人體中產(chǎn)生的各種有害過氧化物質(zhì)和自由基，從而降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及控制炎癥的作用[5]。Vit.C作為體內(nèi)的另一種重要抗氧化劑，可以抑制細(xì)胞釋放氧、清除細(xì)胞內(nèi)外氧自由基、參與體內(nèi)氧化-還原及羥化反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化作用[6]。Vit.C通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)受損組織細(xì)胞的修復(fù)[7]。研究表明谷胱甘肽和Vit.C均具有抵抗自由基攻擊和脂質(zhì)過氧化的能力，從而起到保護(hù)機(jī)體免受外源性有毒物質(zhì)損害，減少肝臟炎癥的作用[8-10]。臨床上也常用谷胱甘肽聯(lián)合Vit.C治療肝內(nèi)膽汁淤積癥、感染性疾病致肝功能損害、原發(fā)性肝癌、酒精性肝病等[11-14]。

本試驗(yàn)通過給予以417、834和1 667 mg/kg劑量(相當(dāng)于推薦攝入劑量的25、50和100倍)的谷胱甘肽Vit.C片摻入基礎(chǔ)飼料中喂養(yǎng)大鼠30天，并且在本實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)條件下，該樣品30天喂養(yǎng)試驗(yàn)高劑量組雌雄大鼠實(shí)際攝入劑量分別達(dá)2 095和1 983 mg/kg，相當(dāng)于推薦攝入劑量的125和118倍，結(jié)果顯示：各劑量組動物一般情況良好，體質(zhì)量未發(fā)生明顯異常改變；各劑量組雌雄大鼠每周體質(zhì)量、每周及總進(jìn)食量、每周及總食物利用率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；血液學(xué)指標(biāo)及生化指標(biāo)結(jié)果均顯示在正常值范圍內(nèi)；臟器系數(shù)及高劑量組主要臟器的組織病理學(xué)檢查也未見明顯異常。結(jié)果表明谷胱甘肽Vit.C片在本試驗(yàn)條件下未出現(xiàn)明顯的損害效應(yīng)，具有較好的安全性。