顧婷立，劉亞華，錢 靚，章 茜

牙周炎是一種牙周支持組織的慢性感染性疾病[1]。在炎癥條件下，人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)成骨分化能力降低，無法實現(xiàn)有效的牙周支持組織再生[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)參與多種生物過程[3]，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一種與牙周炎進(jìn)展有關(guān)的LncRNA。研究顯示MALAT1在牙周炎患者的hPDLSCs中明顯高表達(dá)[4]，可促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞中炎性因子的分泌[5]，但MALAT1在牙周炎中的分子機(jī)制尚不清楚。既往研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)可以通過干擾牙周細(xì)胞的分化、再生和修復(fù)來調(diào)節(jié)牙齒發(fā)育網(wǎng)絡(luò)[6-7]。微小RNA-383-5p(miRNA-383-5p，miR-383-5p)可參與調(diào)節(jié)hPDLSCs的成骨分化[8]。此外，細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)在多種細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，已被證實與糖尿病小鼠的牙周炎癥有關(guān)[9-10]。本研究首次探討了MALAT1/miR-383-5p/SOCS3軸在hPDLSCs增殖、凋亡以及成骨分化中的作用及LncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為牙周修復(fù)提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

hPDLSCs(PC-025h)(賽奧斯，中國武漢)，牙齦卟啉單胞菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(SMB00610)(Sigma，美國)，青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(10378016)、胎牛血清(1009914C)和DEME培養(yǎng)基(11965118)(Gibco，美國)，PrimeScript cDNA合成試劑盒(D6110A)、Green Premix Ex Taq(RR420A)(TAKARA，日本)，一抗SOCS3(ab280884)、GAPDH(ab8245)、PCNA(ab29)、Ki-67(ab92742)、Bcl-2(ab32124)、Bax(ab32503)、OSX(ab209484)和OCN(ab133612)(Abcam，英國)，Immun-StarTMHRP化學(xué)發(fā)光試劑盒(1705040)(Bio-Rad，美國)，CCK-8試劑盒(CA1210)(Solarbio，中國)，TUNEL凋亡試劑盒(AT2190)、BCIP/NBT顯色試劑盒(APR1100)、茜素紅S(alizarin red S，ARS)染色液(A39470)(吉至，中國上海)，成骨誘導(dǎo)試劑盒(FY200006)(弗元生物，中國上海)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測定試劑盒(mlE3570)(酶聯(lián)生物，中國上海)，TNF-α ELISA試劑盒(EK0525)、IL-6 ELISA試劑盒(EK0410)和IL-1β ELISA試劑盒(EK0392)(博士德，中國武漢)，雙熒光素酶檢測試劑盒(LF001)(Gene Copoeia，美國)。

SpectraMax iD3型多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)，7500實時熒光定量PCR儀器(ABI，美國)，OmegaLum C 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(aplegen，美國)、DMi8熒光顯微鏡(Leica，德國)。

1.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

取第3～5代hPDLSCs用于實驗，將細(xì)胞按以下分組處理。Control組：不做處理；LPS組：僅用LPS處理；LPS+si-NC組：轉(zhuǎn)染si-NC后LPS處理；LPS+si-MALAT1組：轉(zhuǎn)染靶向MALAT1的小干擾RNA(si-MALAT1)后LPS處理；LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組：轉(zhuǎn)染si-MALAT1和miR-383-5p抑制物(in-miR-383-5p)后LPS處理；LPS+si-MALAT1+SOCS3組：轉(zhuǎn)染si-MALAT1和SOCS3過表達(dá)質(zhì)粒(SOCS3)后LPS處理。LPS終濃度1 mg/L[11]，所有細(xì)胞處理48 h后用于后續(xù)實驗。

1.3 ELISA實驗

收集各組hPDLSCs細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6和IL-1β水平。酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得相應(yīng)的細(xì)胞因子水平。

1.4 RT-qPCR實驗

提取各組hPDLSCs總RNA，使用PrimeScript cDNA合成試劑盒制備cDNA。隨后使用Green Premix Ex Taq試劑進(jìn)行RT-qPCR，引物序列見表1。使用2-ΔΔct法歸一化為GAPDH/U6表達(dá)。

表1 引物序列表

1.5 Western blot實驗

使用RIPA裂解緩沖液提取各組hPDLSCs總蛋白，經(jīng)定量后通過適當(dāng)?shù)腟DS-PAGE分離蛋白(50 μg/泳道)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后使用5%脫脂牛奶在TBST緩沖液中封閉2 h。將膜與SOCS3、PCNA、Ki-67、Bcl-2、Bax、OSX、OCN和GAPDH一抗(1∶1 000)4 ℃過夜孵育。一抗孵育后使用HRP偶聯(lián)的二抗(1∶1 000)在室溫下培養(yǎng)45 min。經(jīng)Immun-StarTMHRP化學(xué)發(fā)光試劑顯影后于檢測器上觀察蛋白質(zhì)條帶?；叶戎凳褂肐mage J量化。

1.6 CCK-8檢測

將hPDLSCs細(xì)胞(1×104個/孔)接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，4 h后再使用酶標(biāo)儀測量450 nm處OD值。

1.7 TUNEL檢測

將hPDLSCs細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min后，使用0.2% Triton X-100透化8 min。加入TUNEL溶液在37 ℃下孵育60 min，PBS洗滌后再加入DAPI染色液對細(xì)胞核染色8 min。使用熒光顯微鏡觀察6個視野中的凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)(綠色熒光)÷總細(xì)胞數(shù)(藍(lán)色熒光)×100%。

1.8 ALP染色和活性分析

將轉(zhuǎn)染的hPDLSCs細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中并在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，①ALP活性分析：收集細(xì)胞后按照ALP活性測定試劑盒說明書操作，在微孔板分光光度計520 nm波長處檢測細(xì)胞的OD值；②ALP染色：PBS洗滌細(xì)胞后使用4%多聚甲醛固定30 min，向每孔添加適量的BCIP/NBT溶液避光孵育后進(jìn)行拍照。

1.9 ARS染色

將轉(zhuǎn)染的hPDLSCs細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中并在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后，PBS洗滌后加入4%多聚甲醛固定30 min，加入ARS染色溶液染色30 min。使用倒置顯微鏡對礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行拍照，酶標(biāo)儀于520 nm波長下檢測OD值。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測

使用Starbase數(shù)據(jù)庫確定MALAT1和miR-383-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)，并預(yù)測miR-383-5p的潛在靶標(biāo)SOCS3。構(gòu)建含有預(yù)測miR-383-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型MALAT1/3′-UTR-SOCS3(WT-MALAT1/WT-3′-UTR-SOCS3)和突變型MALAT1/3′-UTR-SOCS3(MUT-MALAT1/MUT-3′-UTR-SOCS3)，并克隆到psiCHECK-2表達(dá)載體上，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將WT-MALAT1/3′-UTR-SOCS3或MUT-MALAT1/3′-UTR-SOCS3和miR-383-5p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染到hPDLSCs細(xì)胞中。48 h后根據(jù)試劑盒說明分析熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，并在本研究中以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間比較采用獨(dú)立t檢驗，三組或三組以上的差異比較采用單因素方差分析和Turkey′s事后檢驗。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLSCs細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)情況

表2顯示，與Control組比較，LPS組hPDLSCs細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高(P<0.05)。與LPS+si-NC組比較，LPS+si-MALAT1組hPDLSCs細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯降低(P<0.05)。與LPS+si-MALAT1組比較，LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組和LPS+si-MALAT1+SOCS3組hPDLSCs細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明顯升高(P<0.05)。

表2 各組hPDLSCs細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6水平

2.2 hPDLSCs細(xì)胞中MALAT1、miR-383-5p和SOCS3表達(dá)情況

與Control組比較，LPS組hPDLSCs細(xì)胞中MALAT1和SOCS3表達(dá)水平均升高，miR-383-5p表達(dá)水平降低(P<0.05)。與LPS+si-NC組比較，LPS+si-MALAT1組hPDLSCs細(xì)胞中MALAT1和SOCS3表達(dá)水平均降低，miR-383-5p表達(dá)水平升高(P<0.05)。與LPS+si-MALAT1組比較，LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組hPDLSCs細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平變化無差異(P>0.05)，miR-383-5p表達(dá)水平降低，SOCS3表達(dá)水平升高(P<0.05)；LPS+si-MALAT1+SOCS3組hPDLSCs細(xì)胞中MALAT1和miR-383-5p表達(dá)水平變化無差異(P>0.05)，SOCS3表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖1、表3)。

a～f依次為Control組、LPS組、LPS+si-NC組、LPS+si-MALAT1組、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組和LPS+si-MALAT1+SOCS3組

表3 各組hPDLSCs細(xì)胞中MALAT1、miR-383-5p和SOCS3表達(dá)

2.3 hPDLSCs細(xì)胞增殖活力、凋亡情況

與Control組比較，LPS組hPDLSCs細(xì)胞活力降低，凋亡指數(shù)升高；細(xì)胞中PCNA、Ki-67、Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高(P<0.05)。與LPS+si-NC組比較，LPS+si-MALAT1組hPDLSCs細(xì)胞活力升高，凋亡指數(shù)降低；細(xì)胞中PCNA、Ki-67、Bcl-2蛋白水平升高，Bax蛋白水平降低(P<0.05)。與LPS+si-MALAT1組比較，LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組和LPS+si-MALAT1+SOCS3組hPDLSCs細(xì)胞活力降低，凋亡指數(shù)升高；細(xì)胞中PCNA、Ki-67、Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高(P<0.05)(表4、圖2～3)。

a～f依次為Control組、LPS組、LPS+si-NC組、LPS+si-MALAT1組、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組和LPS+si-MALAT1+SOCS3組

表4 各組hPDLSCs細(xì)胞活力、凋亡指數(shù)以及PCNA、Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白水平統(tǒng)計

2.4 hPDLSCs細(xì)胞成骨分化情況

與Control組比較，LPS組hPDLSCs細(xì)胞中ALP染色和活性、ARS鈣沉積物的濃度減少，細(xì)胞中OSX和OCN蛋白水平降低(P<0.05)。與LPS+si-NC組比較，LPS+si-MALAT1組hPDLSCs細(xì)胞中ALP染色和活性、ARS鈣沉積物的濃度升高，細(xì)胞中OSX和OCN蛋白水平升高(P<0.05)。與LPS+si-MALAT1組比較，LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組和LPS+si-MALAT1+SOCS3組hPDLSCs細(xì)胞中ALP染色和活性、ARS鈣沉積物的濃度減少，細(xì)胞中OSX和OCN蛋白水平降低(P<0.05)(表5、圖4～5)。

a～f依次為Control組、LPS組、LPS+si-NC組、LPS+si-MALAT1組、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組和LPS+si-MALAT1+SOCS3組

表5 各組hPDLSCs細(xì)胞中ALP活性、ARS染色和OSX、OCN蛋白水平統(tǒng)計

a～f依次為Control組、LPS組、LPS+si-NC組、LPS+si-MALAT1組、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組和LPS+si-MALAT1+SOCS3組

2.5 MALAT1、miR-383-5p和SOCS3在hPDLSCs細(xì)胞中的關(guān)系

miR-383-5p與MALAT1或SOCS3 3′-UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖6)。雙熒光素酶結(jié)果顯示(表6)，轉(zhuǎn)染miR-383-5p mimics能特異性降低WT-MALAT1或WT-3′-UTR-SOCS3的熒光素酶活性(P<0.05)，而不能特異性降低MUT-MALAT1或MUT-3′-UTR-SOCS3的熒光素酶活性(P>0.05)；同時轉(zhuǎn)染miR-NC對WT-MALAT1或WT-3′-UTR-SOCS3與MUT-MALAT1或MUT-3′-UTR-SOCS3熒光素酶活性均無影響(P>0.05)。因此可得出，在hPDLSCs細(xì)胞中MALAT1與miR-383-5p之間存在相互作用關(guān)系，miR-383-5p與SOCS3之間存在相互作用關(guān)系。

表6 雙熒光素酶報告基因測定miR-383-5p與MALAT1或SOCS3 3′-UTR靶向關(guān)系

圖6 Starbase網(wǎng)站預(yù)測miR-383-5p與MALAT1或SOCS3 3′-UTR互補(bǔ)位點(diǎn)

3 討 論

牙周炎是一種慢性疾病，藥物治療可作為機(jī)械清除菌斑牙石的輔助治療[12]。hPDLSCs因具有高增殖、自我更新和多分化能力，在牙周炎組織修復(fù)中至關(guān)重要[2]。本研究通過LPS構(gòu)建hPDLSCs細(xì)胞炎癥模型發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后hPDLSCs表達(dá)促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平升高，與Nie等[11]報道一致。LPS還可通過抑制軟骨細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白(PCNA、Ki-67)表達(dá)，同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，本研究結(jié)果與之相似。ALP活性和礦化程度是成骨分化的標(biāo)志[14]。本研究中LPS刺激后hPDLSCs中ALP的活性和礦化程度均受到抑制，同時成骨分化標(biāo)志物OCN和轉(zhuǎn)錄因子OSX的表達(dá)下降。以上數(shù)據(jù)表明，LPS刺激在誘導(dǎo)hPDLSCs炎癥和凋亡損傷的同時也削弱了細(xì)胞增殖和成骨分化能力。

a～f依次為Control組、LPS組、LPS+si-NC組、LPS+si-MALAT1組、LPS+si-MALAT1+in-miR-383-5p組和LPS+si-MALAT1+SOCS3組

MALAT1高表達(dá)可促進(jìn)帕金森病等疾病的發(fā)展[15]，下調(diào)MALAT1表達(dá)可能有利于治療疾病。MALAT1通過上調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子2促進(jìn)hPDLSCs的增殖[4]。此外，MALAT1還可通過海綿化miR-20a和激活TLR4促進(jìn)LPS刺激的人牙齦成纖維細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[5]。MALAT1敲低后可通過miR-769-5p/HIF3A軸削弱LPS刺激下hPDLSCs表達(dá)促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的水平，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可明顯上調(diào)hPDLSCs中MALAT1的表達(dá)，進(jìn)一步結(jié)果表明敲低MALAT1不僅抑制了LPS刺激的hPDLSCs促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的分泌，同時增強(qiáng)了細(xì)胞活力并抑制了細(xì)胞凋亡。此外，MALAT1敲低部分恢復(fù)了LPS刺激下hPDLSCs下調(diào)的成骨分化能力。以上這些結(jié)果表明敲低MALAT1可能抑制牙周炎的發(fā)生和發(fā)展。

LncRNA通過海綿化miRNA并調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控多個生物過程，如LncRNA HOTAIRM1海綿化miR-433-5p促進(jìn)PIK3CD表達(dá)，進(jìn)而加速多囊卵巢綜合征的發(fā)展[17]。越來越多的研究表明，MALAT1可以作為一種內(nèi)源競爭RNA來調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)和靶基因的活性[16]。通過使用生物信息學(xué)對MALAT1預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行分析，確定了很多潛在的靶點(diǎn)包括miR-383-5p、miR-4524b-5p、miR-503-5p等，這些靶點(diǎn)多與人類癌癥的發(fā)展相關(guān)。其中，miR-383-5p可通過抑制HDAC9表達(dá)促進(jìn)hPDLSCs的成骨分化[8]。以往研究表明，miR-383-5p對前列腺癌等多種癌癥的生長具有抑制作用[18]。因此，本研究選擇miR-383-5p進(jìn)行機(jī)制研究。有研究表明，MALAT1下調(diào)后可通過與miR-383-5p直接作用來調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1也可以通過與hPDLSCs中miR-383-5p結(jié)合發(fā)揮作用，下調(diào)MALAT1表達(dá)可明顯上調(diào)miR-383-5p表達(dá)。此外，LPS刺激后，hPDLSCs中miR-383-5p表達(dá)降低，提示MALAT1可能通過miR-383-5p參與牙周炎發(fā)展過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-383-5p表達(dá)可部分減弱MALAT1敲低對hPDLSCs的影響，表明MALAT1可能通過海綿化miR-383-5p對牙周炎產(chǎn)生影響。miR-383-5p的靶基因是SOCS3。脫氫丁香酚可通過抑制STAT3/SOCS3通路改善LPS誘導(dǎo)的哮喘模型肺部炎癥[20]；SOCS3還被證實可作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子[21]。Wang等[10]研究證實，降低SOCS3的表達(dá)可抑制衰老相關(guān)分泌表型，進(jìn)而抑制糖尿病小鼠牙周炎癥的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的hPDLSCs中SOCS3表達(dá)升高，且miR-383-5p可靶向調(diào)控SOCS3表達(dá)，而過表達(dá)SOCS3可部分逆轉(zhuǎn)MALAT1敲低后對hPDLSCs細(xì)胞的影響，證實了下調(diào)MALAT1通過調(diào)控miR-383-5p/SOCS3軸減弱LPS誘導(dǎo)的hPDLSCs炎癥損傷。

綜上，本研究首次提供證據(jù)表明，下調(diào)MALAT1通過miR-383-5p減少SOCS3表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的hPDLSCs炎癥和凋亡，促進(jìn)hPDLSCs增殖和成骨分化。這可能為未來牙周炎靶向治療方案的發(fā)展提供新的實驗依據(jù)。然而，本研究僅在細(xì)胞層面對MALAT/miR-383-5p/SOCS3機(jī)制進(jìn)行了探究，仍需在體內(nèi)進(jìn)一步研究驗證；其次，SOCS3如何在hPDLSCs中發(fā)揮作用仍有待進(jìn)一步探索。