王春暉,潘 卓,唐忠明

王春暉,潘卓,湖州市第一人民醫(yī)院外科 浙江省湖州市 313000

唐忠明,湖州市第一人民醫(yī)院消化科 浙江省湖州市 313000

0 引言

急性胰腺炎是胰腺的一種炎癥性疾病,輕癥以胰腺水腫和出血為主,重癥可出現(xiàn)組織壞死,預(yù)后較差[1,2].長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類不編碼蛋白的RNA分子,廣泛參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡和炎癥等調(diào)控過程[3,4].如lncR-RGD1566401的上調(diào)表達(dá)能夠促進(jìn)大鼠急性胰腺炎AR42J細(xì)胞凋亡[5].LncRNA漿細(xì)胞瘤多樣異位基因1(plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)可通過調(diào)控微小RNA(miR)-30a-5p表達(dá),促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞自噬,加重急性胰腺炎[6].LncRNA核內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄物1(nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)下調(diào)可通過海綿miR-365a-3p緩解雨蛙肽誘導(dǎo)的腺泡細(xì)胞炎癥損傷[7].

已有研究報(bào)道lncRNA H19在急性胰腺炎中異常表達(dá),與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[8].但lncRNA H19在胰腺腺泡細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步探究.本研究利用雨蛙肽誘導(dǎo)胰腺AR42J細(xì)胞構(gòu)建體外急性胰腺炎細(xì)胞模型,以期揭示lncRNA H19在細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料 人胰腺AR42J細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫;改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基購自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國(guó)Promega公司;雨蛙肽購自美國(guó)BD公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國(guó)Invitrogen公司;TRIzol試劑購自大連寶生物科技有限公司;膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡試劑盒購自美國(guó)Cell Signaling公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自北京天根生化科技公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理: 胰腺AR42J細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2條件中,待細(xì)胞融合至60%-90%時(shí),更換含有濃度100 nM雨蛙肽的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,建立胰腺損傷細(xì)胞模型.

細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組: 使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑,根據(jù)試劑說明書,分別將終濃度為30 nM-50 nM的si-NC、si-H19、miR-NC、miR-30a-5p、si-H19與anti-miRNC、si-H19與anti-miR-30a-5p轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞.轉(zhuǎn)染48 h后,更換常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后再更換含100 nM雨蛙肽的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,根據(jù)轉(zhuǎn)染基因不同,分別將細(xì)胞記為雨蛙肽+si-NC組、雨蛙肽+si-H19組、雨蛙肽+miRNC組、雨蛙肽+miR-30a-5p組、雨蛙肽+si-H19+antimiR-NC組、雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p組.

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)H19和miR-30a-5p表達(dá)水平: 采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.使用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng).循環(huán)條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán),60 ℃延長(zhǎng)5 min.2-ΔΔCt方法計(jì)算H19和miR-30a-5p相對(duì)表達(dá)水平.

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡: 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次,與500 μL的結(jié)合緩沖液混勻.先加入10 μL的Annexin V-FITC,再加入5 μL的PI,混勻后避光孵育10 min.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率.

1.2.4 ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6水平: 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6水平,按照試劑盒附帶的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)步驟.

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H19和miR-30a-5p的靶向關(guān)系: 將含有miR-30a-5p結(jié)合位點(diǎn)的H19野生型(wildtype,WT)序列或突變型(mutant-type,MUT)序列克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告基因載體WTH19和MUT-H19.將miR-30a-5p、miR-NC分別與WT-H19或者M(jìn)UT-H19共轉(zhuǎn)染至雨蛙肽誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞,測(cè)定各組細(xì)胞的熒光素酶活性.并將si-NC、si-H19、pcDNANC、pcDNA-H19分別轉(zhuǎn)染至雨蛙肽誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞中,參照RT-qPCR步驟檢測(cè)細(xì)胞miR-30a-5p表達(dá)水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組比較行t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn).統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性用aP＜0.05表示,同一表中另一套P值,則用cP＜0.05.

2 結(jié)果

2.1 H19和miR-30a-5p在雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中的表達(dá) 與正常胰腺細(xì)胞比較,雨蛙肽誘導(dǎo)損傷的胰腺炎細(xì)胞中H19表達(dá)水平顯著升高,miR-30a-5p表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).見表1.

表1 H19和miR-30a-5p在雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中的表達(dá)(mean±SD,n=9)

2.2 低表達(dá)H19對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡、炎癥因子和自噬的影響 與雨蛙肽+si-NC組比較,雨蛙肽+si-H19組H19表達(dá)水平顯著降低;細(xì)胞存活率顯著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低;微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)-I蛋白表達(dá)顯著降低、LC3-II蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05).見表2和圖1.

圖1 敲低H19對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞炎癥和自噬的影響.A: 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎癥因子的分泌;B: 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá).雨蛙肽+si-NC組 vs 雨蛙肽+si-H19組,aP＜0.05.TNF-α: 腫瘤壞死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ: 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ.

表2 敲低H19對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞存活的影響(mean±SD,n=9)

2.3 高表達(dá)miR-30a-5p對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞存活、炎癥因子和自噬的影響 與雨蛙肽+miR-NC組比較,雨蛙肽+miR-30a-5p組miR-30a-5p表達(dá)水平顯著升高;細(xì)胞存活率顯著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低;LC3-I蛋白表達(dá)顯著降低、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05).見表3和圖2.

圖2 高表達(dá)miR-30a-5p對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞炎癥和自噬的影響.A: 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎癥因子的分泌;B: 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá).雨蛙肽+miR-NC組 vs 雨蛙肽+miR-30a-5p組,aP＜0.05.TNF-α: 腫瘤壞死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ:微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ.

表3 高表達(dá)miR-30a-5p對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞存活影響(mean±SD,n=9)

2.4 H19靶向miR-30a-5p表達(dá) LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)H19和miR-30a-5p之間存在結(jié)合位點(diǎn),見圖3.雙熒光素酶報(bào)告顯示,與轉(zhuǎn)染miR-NC比較,轉(zhuǎn)染miR-30a-5p可降低WT-H19的相對(duì)熒光素酶活性(P＜0.05),而對(duì)MUT-H19的相對(duì)熒光素酶活性無顯著影響(P＞0.05),見表4.

圖3 H19和miR-30a-5p靶向結(jié)合圖.LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)H19和miR-30a-5p之間存在結(jié)合位點(diǎn).WT-H19: H19野生型;MUT-H19:H19突變型.

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)(mean±SD,n=9)

RT-qPCR檢測(cè)顯示,與雨蛙肽+si-NC組比較,雨蛙肽+si-H19組細(xì)胞miR-30a-5p表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05);與雨蛙肽+pcDNA-NC組比較,雨蛙肽+pcDNA-H19組細(xì)胞miR-30a-5p表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05),見表5.

表5 qRT-PCR檢測(cè)miR-30a-5p表達(dá)(mean±SD,n=9)

2.5 低表達(dá)miR-30a-5p可以逆轉(zhuǎn)低表達(dá)H19對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞凋亡、炎癥因子和自噬的影響 與雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC比較,雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p組miR-30a-5p表達(dá)顯著降低;細(xì)胞存活率顯著降低;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高;LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05).見表6和圖4.

圖4 低表達(dá)miR-30a-5p可以逆轉(zhuǎn)低表達(dá)H19對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞炎癥和自噬的影響.A: 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎癥因子的分泌;B:蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá).雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC組 vs 雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p組,aP＜0.05.TNF-α: 腫瘤壞死因子-α;IL-1β: 白介素-1β;IL-6: 白介素-6;LC3-Ⅰ: 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅰ;LC3-Ⅱ: 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ.

表6 低表達(dá)miR-30a-5p可以逆轉(zhuǎn)低表達(dá)H19對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞存活的影響(mean±SD,n=9)

3 討論

急性胰腺炎是一種比較常見的消化系統(tǒng)疾病,成年人發(fā)病概率比較高,根據(jù)病理分型可分為間質(zhì)水腫型和壞死型兩種.引起該病的病因非常多,在我國(guó)最常見的是膽石癥、酒精和高脂血癥[9,10].

LncRNA H19在急性胰腺炎患者的血清中表達(dá)升高,且對(duì)于急性胰腺炎診斷和嚴(yán)重程度的預(yù)判具有一定臨床價(jià)值[11].重癥急性胰腺炎大鼠胰腺中miR-30a-5p表達(dá)顯著降低[12].本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),與正常胰腺細(xì)胞比較,雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎細(xì)胞中H19表達(dá)水平顯著升高,miR-30a-5p表達(dá)水平顯著降低.此外,有研究表明沉默lncRNA H19可減少雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡,其可能成為治療急性胰腺炎的潛在有效靶點(diǎn)[13].本實(shí)驗(yàn)研究表明,與雨蛙肽+si-NC組比較,雨蛙肽+si-H19組H19表達(dá)水平顯著降低;細(xì)胞存活率顯著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低;LC3-I蛋白表達(dá)顯著降低、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高.

miRNA是一類長(zhǎng)度約19-22個(gè)核苷酸的非編碼RNA,是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[14,15].已經(jīng)有研究報(bào)道,miR-155抑制劑能夠降低重癥急性胰腺炎大鼠炎癥因子,減輕重癥急性胰腺炎急性肺損傷[16].急性胰腺炎患者外周血miR-16和miR-192表達(dá)及其與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[17].miR-7a-5p可促進(jìn)急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞增殖能力[18].本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,與雨蛙肽+miRNC組比較,雨蛙肽+miR-30a-5p組miR-30a-5p表達(dá)水平顯著升高;細(xì)胞存活率顯著升高;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低;LC3-I蛋白表達(dá)顯著降低、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高.

本實(shí)驗(yàn)研究顯示,與雨蛙肽+si-H19+anti-miR-NC比較,雨蛙肽+si-H19+anti-miR-30a-5p組miR-30a-5p表達(dá)顯著降低;細(xì)胞存活率顯著降低;TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高;LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)顯著升高、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著降低.有類似的研究報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)一致.LncRNA β-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-反義5(β-1,3-galactosyltransferase 5-AS1,B3GALT5-AS1)靶向miR-361-3p調(diào)節(jié)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞增殖及凋亡[19].miR-141-3p靶向調(diào)控CUE結(jié)構(gòu)域蛋白2(CUE domain-containing protein 2,CUEDC2)基因影響雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞損傷[20].miR-7靶向特異性蛋白3(specific protein 3,Sp3)影響急性胰腺炎腺泡細(xì)胞增殖和凋亡[21].

4 結(jié)論

綜上所述,下調(diào)H19靶向上調(diào)miR-30a-5p抑制雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞凋亡、炎癥因子分泌和自噬.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

急性胰腺炎是一種死亡率較高的嚴(yán)重疾病,嚴(yán)重威脅著人類健康.探究影響急性胰腺炎進(jìn)程的分子機(jī)制,有望為其治療提供理論依據(jù).

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

許多長(zhǎng)鏈非編碼RNA被證實(shí)參與了急性胰腺炎進(jìn)程,但是H19在急性胰腺炎進(jìn)程中的作用和潛在分子機(jī)制值得進(jìn)一步揭示.對(duì)H19作用的探究可能為其成為急性胰腺炎的治療靶點(diǎn)提供證據(jù).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究希望通過揭示調(diào)控急性胰腺炎進(jìn)程的潛在分子機(jī)制,為急性胰腺炎的治療提供有效分子靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)方法

雨蛙肽誘導(dǎo)建立胰腺損傷細(xì)胞模型.通過細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡;酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)評(píng)估炎癥因子的分泌;蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá).雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中H19和miR-30a-5p靶向結(jié)合關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

H19敲低可以改善雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞凋亡、炎癥和自噬.H19可以靶向miR-30a-5p,且其敲低對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞損傷的影響可以被miR-30a-5p抑制劑所逆轉(zhuǎn).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

H19通過靶向miR-30a-5p促進(jìn)雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞損傷,表明其可能對(duì)急性胰腺炎進(jìn)程有促進(jìn)作用.

展望前景

H19可能是急性胰腺炎治療的潛在分子靶點(diǎn).未來可以在臨床水平以及動(dòng)物水平進(jìn)一步證實(shí)H19/miR-30a-5p調(diào)控急性胰腺炎進(jìn)程的結(jié)論.