王珍，李瀠，呂海江，王露，鄭博，李亞靜

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）作為一種復(fù)雜多因素的視網(wǎng)膜變性疾病，是目前臨床上老年人致盲的主要病因[1-2]。越來越多的研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，由受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（receptorinteracting protein kinase 3，RIPK3）和混合系列蛋白激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domainlike，MLKL）所構(gòu)成的RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路，可能通過介導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞的壞死性凋亡在干性年齡相關(guān)性黃斑變性（dry age-related macular degeneration，dAMD）中發(fā)揮作用[5-6]。黃芩苷是中藥黃芩的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等多種作用[7-8]，可通過多種途徑抑制RPE 細(xì)胞的損傷凋亡，進(jìn)而保護(hù)RPE 細(xì)胞[9-10]。但是，黃芩苷在保護(hù)RPE細(xì)胞以及對dAMD起到積極干預(yù)作用的具體機(jī)制錯綜復(fù)雜，本實驗以RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路為研究切入點(diǎn)，明確該信號通路參與RPE 細(xì)胞的壞死性凋亡以及黃芩苷對RPE 細(xì)胞的調(diào)控作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

RPE 細(xì) 胞ARPE-19（美 國American Tissue Culture Collection 公司），細(xì)胞計數(shù)試劑-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、4'6-二脒基-2-苯基吲哚（4'6-Diamidino-2-Phenylindole，DAPI，中國上海碧云天生物技術(shù)研究所，C0037、C1002），胎牛血清（美國猶他州大學(xué)，SH30070.03），黃芩苷（中國Selleck生物科技有限公司，S2269），蛋白印跡膜再生液（北京佰奧萊博生物科技有限公司，ZN1923），RIPK1抗體、RIPK3抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、山羊抗兔IgG 抗體（艾博抗貿(mào)易有限公司，ab300617、ab226297、ab8245、ab205718），高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）抗體（美國Cell Signaling Technology公司，6893）。

水套式CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，F(xiàn)orma 3111），超凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-2FD），微孔板式多功能酶標(biāo)儀（德國伯托公司，LB941），Western Blot 系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，轉(zhuǎn)印槽：Trans-Blot；電泳槽：Criterion?）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，在含有青霉素（濃度為100 U/mL）、鏈霉素（濃度為100 μg/mL）、10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ARPE-19 細(xì)胞，在37℃含5%CO2和95%濕度的空氣中孵育。當(dāng)細(xì)胞融合至85%時，棄去舊培養(yǎng)基，洗滌消化后收集細(xì)胞。離心后以1∶3 的比例進(jìn)行傳代，2 d 進(jìn)行1 次換液，穩(wěn)定傳代后取2～4 代用于實驗。

1.3 分組與處理

將ARPE-19 細(xì)胞分為3 個組：（1）對照組（control group，CG），正常培養(yǎng)48 h；（2）模型組（model group，MG），先正常培養(yǎng)24 h 后，給予含1 mg/mL 碘酸鈉的完全培養(yǎng)基刺激24 h；（3）黃芩苷組（baicalin group，BG），黃芩苷濃度設(shè)定為，0.1、1.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L，含有以上不同濃度黃芩苷的培養(yǎng)基孵育24 h 后，給予含1 mg/mL碘酸鈉的完全培養(yǎng)基刺激24 h。按照上述分組處理方式處理后，再繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。

1.4 CCK-8法檢測ARPE-19細(xì)胞活力

在96 孔板中接種ARPE-19 細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，分組處理細(xì)胞后，每孔加10 μL 的CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h，以酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度（optical density，OD）值。

1.5 免疫熒光法觀察細(xì)胞形態(tài)

吸出各組對數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行DAPI 染色，洗滌后封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)。

1.6 Western Blot 法檢測各組細(xì)胞RIPK1、RIPK3、HMGB1蛋白的表達(dá)水平

從ARPE-19 細(xì)胞中分別提取總蛋白20 μg，經(jīng)凝膠、電泳和轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，與RIPK1 抗體（稀釋比例1∶1,000）、RIPK3 抗體（稀釋比例1∶5,000）、HMGB1 抗體（稀釋比例1∶1,000）、GAPDH 抗體（稀釋比例1∶1,000）一抗（均為鼠抗）在4℃下孵育過夜后，洗滌3 次，與二抗（山羊抗兔，稀釋比例1∶5,000）孵育1 h，再次洗滌3 次后進(jìn)行顯影。用酶標(biāo)儀測定光密度（optical density，OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷安全濃度范圍測定

8組間不同濃度黃芪苷處理ARPE-19細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.120，P=0.000）。兩兩比較：與0 μmol/L 組比較，0.1、1.0、10.0、25.0 μmol/L 組的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），50.0、100.0、200.0μmol/L 組的細(xì)胞活力均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t50.0=3.236，P=0.032；t100.0=6.165，P=0.004；t200.0=7.840，P=0.001）。與25.0 μmol/L 組比較，1.0、10.0、50.0 μmol/L 組的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），0.1μmol/L組的細(xì) 胞活力升高（t=4.848，P=0.008），100.0、200.0 μmol/L 組的細(xì)胞活力降低（t100.0=9.714，P=0.001；t200.0=9.485，P=0.001），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，黃芩苷的安全濃度范圍為0～25.0μmol/L（表1）。

表1 不同濃度黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞活性的影響（，n=3）

表1 不同濃度黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞活性的影響（，n=3）

注：* 與0 μmol/L 組比較，P<0.05；# 與25.0 μmol/L 組比較，P<0.05

2.2 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞的最佳有效濃度

6 組間細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=75.789，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，其余各組細(xì)胞活力均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（tMG=12.769，t0.1=12.137，t1.0=10.542，均P=0.000；t10.0=8.188，P=0.001；t25.0=5.237，P=0.006）；與MG 組比較，黃芩苷1.0、10.0、25.0μmol/L 濃度組細(xì)胞活力均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t1.0=4.869，P=0.008；t10.0=8.824，P=0.001；t25.0=9.854，P=0.001），0.1 μmol/L 濃度組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)黃芩苷濃度為25.0 μmol/L 時，細(xì)胞活性最高，與0.1、1.0、10.0μmol/L 濃度組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t0.1=8.987，P=0.001；t1.0=6.809，P=0.002；t10.0=3.320，P=0.029），故本實驗選擇25.0μmol/L 黃芩苷進(jìn)行后續(xù)試驗（表2）。

表2 黃芪苷對ARPE-19細(xì)胞的最佳有效濃度（，n=3）

表2 黃芪苷對ARPE-19細(xì)胞的最佳有效濃度（，n=3）

注：* 與CG 組比較，P<0.05；# 與MG 組比較，P<0.05；&與25.0μmol/L組比較，P<0.05；CG 對照組；MG 模型組；BG 黃芩苷組

2.3 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞的最佳給藥時間

3 組間不同給藥時間的細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F24h=46.332，F(xiàn)48h=82.269，F(xiàn)72h=210.724，均P=0.000）。兩兩比較，（1）24 h：與CG 組比較，MG 組細(xì)胞活力下降（t=8.118，P=0.001）；與MG 組比較，BG 組細(xì)胞 活力升 高（t=8.632，P=0.001），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）48 h：與CG 組比較，MG 組細(xì)胞活力下降（t=12.330，P=0.000）；與MG組比較，BG組細(xì)胞活力升高（t=12.148，P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（3）72 h：與CG組比較，MG組細(xì)胞活力下降（t=26.873，P=0.000）；與MG 組比較，BG組細(xì)胞活力升高（t=10.539，P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。上述數(shù)據(jù)表明，與MG 組比較，在不同的給藥時間BG 組的細(xì)胞活力均有提高，故最短的24 h為最佳給藥時間。

表3 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞的最佳給藥時間（，n=3）

表3 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞的最佳給藥時間（，n=3）

注：*與CG 相比，P<0.05；#與MG 相比，P<0.05；CG 對照組；MG模型組；BG 黃芩苷組

2.4 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞形態(tài)的影響

在24 h、48 h 或72 h 時，CG 組ARPE-19 細(xì)胞核均呈強(qiáng)熒光，細(xì)胞質(zhì)無熒光；MG組ARPE-19細(xì)胞核均呈現(xiàn)核濃縮，染色加深，部分細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂；BG 組ARPE-19 細(xì)胞核均呈現(xiàn)強(qiáng)熒光，核碎裂現(xiàn)象減少（圖1）。

圖1 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞形態(tài)的影響（免疫熒光染色，×400）

2.5 黃芩苷對ARPE-19 細(xì)胞RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路的影響

檢測黃芩苷給藥24 h 后的ARPE-19 細(xì)胞RIPK1、RIPK3 和HMGB1 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，3 組間RIPK1、RIPK3、HMGB1 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FRIPK1=34.303，F(xiàn)RIPK3=31.690，F(xiàn)HMGB1=11.148，均P=0.000）。兩兩比較，（1）RIPK1：與CG組比較，MG 組RIPK1 表達(dá)水平升高（t=7.352，P=0.002）；與MG組比較，BG組RIPK1表達(dá)水平下降（t=7.012，P=0.002），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）RIPK3：與CG 組比較，MG 組RIPK3 表達(dá)水平升高（t=6.926，P=0.002）；與MG 組比較，BG 組RIPK3 表達(dá)水平下降（t=6.085，P=0.004），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（3）HMGB1：與CG 組比較，MG 組HMGB1 表達(dá)水平升 高（t=3.785，P=0.019）；與MG 組比較，BG 組HMGB1表達(dá)水平下降（t=3.386，P=0.028），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2、表4）。

表4 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路的影響（，n=3）

表4 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路的影響（，n=3）

注：*與CG組比較，P<0.05；#MG組比較，P<0.05；RIPK1受體相互作用蛋白激酶1；RIPK3 受體相互作用蛋白激酶3；HMGB1 高遷移率族蛋白B1；CG 對照組；MG 模型組；BG 黃芩苷組

圖2 黃芩苷對ARPE-19細(xì)胞RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路的影響

3 討論

目前，AMD 的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，可能與氧化應(yīng)激、光損傷、炎癥、遺傳基因等因素相關(guān)[11]。AMD 可分為干性和濕性2 種類型，濕性AMD(wet age-related macular degeneration,wAMD)臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，但dAMD 發(fā)病率更高[12]。dAMD 早期在視網(wǎng)膜下出現(xiàn)一種稱為玻璃膜疣的沉積，晚期則出現(xiàn)RPE細(xì)胞廣泛變性的地圖樣萎縮，導(dǎo)致嚴(yán)重的視野喪失[13]?，F(xiàn)階段，對于dAMD 則無有效的預(yù)防或治療手段[14]。雖然目前dAMD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但有研究[15]發(fā)現(xiàn)RPE 細(xì)胞的凋亡致使其他正常細(xì)胞生理功能缺失，可能導(dǎo)致dAMD 視網(wǎng)膜形成玻璃膜疣沉積，從而增加形成dAMD 的風(fēng)險。RPE 細(xì)胞位于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間，由表面極化的色素上皮細(xì)胞組成，具有多種重要的生理功能[16]?，F(xiàn)已有研究[17-20]證實，RPE 細(xì)胞的凋亡與dAMD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

黃芩是一種常見的藥用植物，是治療肺部疾病、黃疸、高血壓等最常用的中藥[21-22]。近期，越來越多的研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對急、慢性炎癥有抑制作用和抗過敏作用[25]，能通過抗血管生成、抗凋亡、等途徑對視網(wǎng)膜病變、AMD 等眼部疾病發(fā)揮積極的治療作用。本研究首先應(yīng)用不同濃度黃芩苷處理ARPE-19 細(xì)胞，通過CCK-8 檢測細(xì)胞增殖活力，確定了黃芩苷的安全濃度范圍為0～25.0μmol/L；然后通過CCK-8 進(jìn)一步檢測各組細(xì)胞增殖活力，選擇了25.0 μmol/L 的黃芩苷濃度為ARPE-19 細(xì)胞干預(yù)的最佳有效濃度；最后通過評價各組24 h、48 h、72 h不同時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活力，確定選擇24 h 作為最佳給藥時間。

有研究[5]在AMD患者和模型小鼠中檢測到RPE細(xì)胞膜通透性降低、RIPK1 和RIPK3 激活、HMGB1釋放，且能觀察到細(xì)胞腫脹、空泡等細(xì)胞壞死性凋亡的特征。也有研究[6]證明，在不同AMD 動物模型中，RIPK1 抑制劑能保護(hù)RPE 細(xì)胞免受壞死性凋亡的影響，維持了視網(wǎng)膜的視覺功能，是臨床dAMD治療候選藥物之一。壞死性凋亡是一種由RIPK1 和RIPK3 以及MLKL 介導(dǎo)的促炎細(xì)胞死亡形式，可介導(dǎo)HMGB1 的釋放，HMGB1 釋放的減少提示MLKL通路受到了抑制[26]。本課題組通過前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)在碘酸鈉誘導(dǎo)的人ARPE-19 細(xì)胞凋亡模型中，RIPK1、RIPK3、pRIPK3、MLKL、pMLKL、HMGB1 的蛋白表達(dá)水平較CG 組升高。由此可見，RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路的激活可能導(dǎo)致了RPE 細(xì)胞的壞死性凋亡，并且與RPE 細(xì)胞的壞死性凋亡一起參與并促進(jìn)了dAMD的發(fā)生發(fā)展。本實驗通過免疫熒光法觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示BG 組ARPE-19 細(xì)胞核均呈現(xiàn)強(qiáng)熒光，核碎裂現(xiàn)象減少，提示黃芩苷能有效維持ARPE-19 細(xì)胞核穩(wěn)定，抑制細(xì)胞增殖，從而保護(hù)RPE 細(xì)胞。本實驗通過Western Blot 實驗，經(jīng)黃芩苷給藥24 h 后，發(fā)現(xiàn)RIPK1、RIPK3 和HMGB1蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示黃芩苷可抑制細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞壞死性凋亡。這些結(jié)果表明，在細(xì)胞實驗中，黃芩苷可抑制ARPE-19 細(xì)胞的增殖、維持細(xì)胞核的穩(wěn)定性，下調(diào)RIPK1、RIPK3 和HMGB1 蛋白表達(dá)，提示黃芩苷可能是新的RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路抑制劑，可以為dAMD的干預(yù)以及治療提供新的策略。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路介導(dǎo)參與了RPE 細(xì)胞的壞死性凋亡。黃芩苷通過調(diào)控RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路抑制碘酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死性凋亡，對RPE 細(xì)胞起到保護(hù)作用，從而對dAMD 起到積極的干預(yù)作用。本研究可為dAMD 的治療提供新的思路和理論依據(jù)，但本實驗樣本量有限，還需后期擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗證、研究。