龐云娟， 劉康連*， 龐蘭英， 謝庚霖， 龍文洲， 劉 元

(1.廣西壯族自治區(qū)玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 玉林 537000，2.廣西壯族自治區(qū)玉林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 玉林 537000，3.廣西子持醫(yī)藥科技有限公司，廣西 南寧 530299)

依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)瑤方祛濕合劑和瑤方胃安合劑的微生物計(jì)數(shù)法進(jìn)行適用性試驗(yàn)研究，為有抑菌作用，且不適宜采用平皿傾注法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的液體制劑提供適用性試驗(yàn)的方法參考。

1 材料

1.1 菌株 枯草芽孢桿菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌(實(shí)驗(yàn)室傳代批號(hào)枯草-3-20200422、黑曲-2-20150330、金葡-2-20200401、白念-3-20200401、銅綠-2-20200401、大腸-2-20200401)，上述菌株的0代(凍干粉菌種)均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)室復(fù)活并傳代培養(yǎng)[1-2]。對(duì)枯草芽孢桿菌種進(jìn)行顯微形態(tài)確認(rèn)，對(duì)黑曲霉菌種進(jìn)行菌落形態(tài)確認(rèn)后，對(duì)其余4個(gè)菌種進(jìn)行VITEK鑒定確認(rèn)，制備成甘油凍存管于超低溫冰箱保存。實(shí)驗(yàn)之前取甘油凍存管菌種傳代培養(yǎng)，制成新鮮肉湯菌液，黑曲霉制成孢子菌懸液。

1.2 藥物 瑤方祛濕合劑(批號(hào)190923、190924、190925)和瑤方胃安合劑(批號(hào)190916、190917、190918)均由玉林市中醫(yī)醫(yī)院提供。

1.3 試劑 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)、麥康凱液體培養(yǎng)基(MacB)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MacC)，均為購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司。

1.4 儀器 電子天平(日本島津公司，型號(hào)EK-1200i)；霉菌培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠，型號(hào)LRH-150-M，校準(zhǔn)溫度點(diǎn)23.0 ℃)；生化培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)SPX-150F-Ⅱ，校準(zhǔn)溫度點(diǎn)33.0 ℃)；生化培養(yǎng)箱(德國(guó)賓得公司，型號(hào)KB115，校準(zhǔn)溫度點(diǎn)42.0 ℃)；Ⅱ級(jí)生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)BHC-1300HA2)；立式壓力蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司，型號(hào)SQ810C，校準(zhǔn)溫度點(diǎn)121.0 ℃和115.0 ℃)；細(xì)菌鑒定及藥敏測(cè)試儀(法國(guó)生物梅里埃公司，型號(hào)VITEK 2)；顯微鏡(德國(guó)徠卡公司，型號(hào)DM500)；微生物潔凈實(shí)驗(yàn)室(潔凈度B、C、D級(jí))、圓周振蕩器(德國(guó)IKA公司，型號(hào)S25) ；超低溫冰箱(新加坡ESCO公司，型號(hào)VVS-439B-1)；普通冰箱(美的集團(tuán)股份有限公司，型號(hào)BCD-229UTM)；微生物檢驗(yàn)儀(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司，型號(hào)HTY-310)；電動(dòng)助吸器(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)Easypet 3)。

2 方法

2.1 菌懸液的制備 根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》四部通則1105[1]中關(guān)于試驗(yàn)菌液的制備和使用要求，并參考文獻(xiàn)[3-6]制備方法進(jìn)行接種培養(yǎng)，取肉湯菌液或孢子菌液0.1 mL加至9.9 mL生理鹽水中，作為1×10-1級(jí)別，混合均勻后從1×10-1級(jí)別中取1 mL加至9 mL生理鹽水中，作為1×10-2級(jí)別，再依次制備成1×10-3～1×10-6級(jí)別的菌懸液，依次吸取1 mL注皿培養(yǎng)進(jìn)行菌液計(jì)數(shù)。取菌數(shù)不大于10 000 cfu級(jí)別的菌懸液作為平皿傾注法試驗(yàn)的使用菌懸液，備用；取菌數(shù)不大于100 cfu級(jí)別的菌懸液作為薄膜過(guò)濾貼膜法試驗(yàn)和控制菌檢查試驗(yàn)的使用菌液，備用。

2.2 供試液的制備 用稀釋液(滅菌的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)將樣品原液依次制成1∶2、1∶5、1∶10、1∶20的供試液。

2.3 預(yù)試驗(yàn)

2.3.1 初步平皿傾注法預(yù)試驗(yàn) 于10 mL瑤方祛濕合劑和瑤方胃安合劑(原液及1∶2、1∶5、1∶10供試液)以及稀釋液中，分別加入0.1 mL “2.1” 項(xiàng)下不大于10 000 cfu的金黃色葡萄球菌懸液[3-21]，充分搖勻；再取10 mL瑤方祛濕合劑和瑤方胃安合劑(原液、1∶2供試液)以及稀釋液，分別加入0.1 mL “2.1” 項(xiàng)下不大于10 000 cfu的白色念珠菌懸液，充分搖勻[6]。上述含藥菌液分別傾注于平皿中，每皿1 mL，其中白色念珠菌平皿傾注SDA，金黃色葡萄球菌平皿傾注TSA，瓊脂凝固后，將SDA平皿放到霉菌培養(yǎng)箱23 ℃培養(yǎng)不超過(guò)5 d，將TSA平皿放生化培養(yǎng)箱33 ℃培養(yǎng)不超過(guò)3 d。若預(yù)試驗(yàn)回收比值達(dá)不到0.5，則繼續(xù)進(jìn)行薄膜過(guò)濾法預(yù)試驗(yàn)。

2.3.2 薄膜過(guò)濾法預(yù)試驗(yàn) 沖洗液為滅菌0.9%氯化鈉溶液，沖洗量從100 mL開始，瑤方祛濕合劑和瑤方胃安合劑(1∶10供試液)10 mL過(guò)膜[6-9]。若樣品溶液產(chǎn)生堵膜的，則需要采取原液稀釋(1∶20，1 mL/皿)、原液稀釋結(jié)合培養(yǎng)基稀釋(1∶10、1∶20，0.5 mL/皿)的平皿傾注法，及1∶10供試液1 mL/膜的薄膜過(guò)濾法進(jìn)行進(jìn)一步的預(yù)試驗(yàn)[10]。

2.4 微生物計(jì)數(shù)方法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4.1 霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證(平皿傾注法) 于10 mL瑤方祛濕合劑和瑤方胃安合劑(原液，各3個(gè)批號(hào))以及稀釋液中，分別加入0.1 mL “2.1” 項(xiàng)下不大于10 000 cfu的黑曲霉、白色念珠菌懸液，充分搖勻，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行注皿，傾注SDA，黑曲霉試驗(yàn)組SDA平皿培養(yǎng)不超過(guò)3 d[14-17]。

2.4.2 需氧菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證(薄膜過(guò)濾貼膜法) 將滅菌薄膜過(guò)濾杯套緊泵頭，濾杯先加入約20 mL稀釋液潤(rùn)濕濾膜(此時(shí)不抽濾)，再分別加入供試液(瑤方祛濕合劑1∶10供試液10 mL，瑤方胃安合劑1∶10供試液1 mL，試驗(yàn)組)、稀釋液(菌液組)、供試液(供試品對(duì)照組)，然后分別取“2.1” 項(xiàng)下不大于100 cfu的菌液1 mL，并緩慢地把菌液分散打進(jìn)薄膜過(guò)濾杯中與試驗(yàn)組溶液或者菌液組溶液相混，抽濾，分別按100 mL/膜的沖洗量沖洗，濾干后取膜貼種于提前備好的TSA平板(7 cm)[18-21]，于生化培養(yǎng)箱33 ℃培養(yǎng)，其中枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的貼膜試驗(yàn)組平皿培養(yǎng)不超過(guò)1 d，金黃色葡萄球菌、黑曲霉試驗(yàn)組培養(yǎng)不超過(guò)3 d，白色念珠菌試驗(yàn)組平皿培養(yǎng)不超過(guò)5 d。

回收比值=(試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù))/菌液組菌落數(shù)?；厥毡戎祽?yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，若任比值低于0.5，應(yīng)重點(diǎn)分析樣品是否存在批次差異；若任比值大于2，應(yīng)重點(diǎn)分析實(shí)驗(yàn)操作以及菌液的穩(wěn)定性，并重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)研究[22]。

2.5 控制菌-大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)(增菌液常規(guī)法) 分別取瑤方祛濕合劑3批和瑤方胃安合劑3批1 mL原液(或1∶10，10 mL)，接種于100 mL TSB，分為試驗(yàn)組、陰性菌對(duì)照組。試驗(yàn)組加入不大于100 cfu的大腸埃希菌，陰性菌對(duì)照組加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌，放置于生化培養(yǎng)箱33 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL各組培養(yǎng)物接種于100 mL MacB，放置于生化培養(yǎng)箱42 ℃培養(yǎng)24 h，取MacB培養(yǎng)物劃線接種于MacC瓊脂平板，放置于生化培養(yǎng)箱33 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)[23-26]。

3 結(jié)果

3.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法預(yù)試驗(yàn) 如表1～2所示，瑤方祛濕合劑和瑤方胃安合劑都有抑制金黃色葡萄球菌的作用，采用原液稀釋10倍以內(nèi)(含)的平皿傾注法均不能消除其抑菌作用。瑤方祛濕合劑采用原液薄膜過(guò)濾貼膜法(1∶10，10 mL，沖洗100 mL/膜)回收比值為0.83?，幏轿赴埠蟿?∶10供試液10 mL薄膜過(guò)濾會(huì)發(fā)生堵膜，1∶20 (1 mL/皿)、1∶10 (0.5 mL/皿)、1∶20 (0.5 mL/皿)也不能消除其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用，而減少薄膜過(guò)濾的樣品量可以解決薄膜過(guò)濾堵膜的問(wèn)題，采用原液稀釋10倍薄膜過(guò)濾貼膜法(1∶10，1 mL，沖洗100 mL/膜)回收比值為0.65。

表1 初步平皿傾注法預(yù)試驗(yàn)——金黃色葡萄球菌回收比值(cfu/皿，n=2)

3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法預(yù)試驗(yàn) 如表3所示，瑤方祛濕合劑和瑤方胃安合劑都沒(méi)有抑制白色念珠菌的作用，采用原液平皿傾注法(原液1 mL/皿)即可滿足回收比值的要求。

3.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)驗(yàn)證 如表4所示，采用原液薄膜過(guò)濾貼膜法(1∶10，10 mL，沖洗100 mL/膜)、原液稀釋10倍薄膜過(guò)濾貼膜法(1∶10，1 mL，沖洗100 mL/膜)分別對(duì)瑤方祛濕合劑、瑤方胃安合劑進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)，TSA平皿上5種試驗(yàn)菌的回收比值均符合要求；采用原液平皿傾注法(原液1 mL/皿)對(duì)瑤方祛濕合劑、瑤方胃安合劑進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，SDA平皿上2種試驗(yàn)菌的回收比值均符合要求，符合《中國(guó)藥典》2020年版四部1105的規(guī)定。

表2 薄膜過(guò)濾法預(yù)試驗(yàn)和進(jìn)一步的預(yù)試驗(yàn)——金黃色葡萄球菌回收比值(cfu/皿，n=2)

表3 平皿傾注法預(yù)試驗(yàn)——白色念珠菌回收比值(cfu/皿，n=2)

表4 2種合劑微生物計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)的回收比值

3.4 控制菌-大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn) 如表5所示，采用增菌液常規(guī)法對(duì)瑤方祛濕合劑、瑤方胃安合劑的控制菌-大腸埃希菌進(jìn)行適用性試驗(yàn)，符合《中國(guó)藥典》2020年版四部1106的規(guī)定。

表5 2種合劑大腸埃希菌的適用性試驗(yàn)

4 討論

瑤方祛濕合劑、瑤方胃安合劑表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)白色念珠菌、大腸埃希菌幾乎沒(méi)有抑菌作用，所以本研究重點(diǎn)在于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)。合劑的需氧菌總數(shù)不得過(guò)1×102cfu/mL，驗(yàn)證方案一般先按照原液1 mL/皿、原液稀釋2倍1 mL/皿、原液稀釋5倍1 mL/皿、原液稀釋10倍1 mL/皿的順序進(jìn)行，當(dāng)原液沒(méi)有抑菌作用時(shí)選原液1 mL/皿的方法；當(dāng)原液1 mL/皿的加菌回收比值達(dá)不到0.5的時(shí)候，要對(duì)原液稀釋平皿法、薄膜過(guò)濾法、以及實(shí)驗(yàn)室自身的資源進(jìn)行綜合考量。實(shí)驗(yàn)室具備較好的薄膜過(guò)濾資源，且容易過(guò)濾的樣品采用薄膜過(guò)濾法1∶10供試液10 mL(即原液1 mL)/膜的方法更優(yōu)；實(shí)驗(yàn)室缺乏薄膜過(guò)濾相應(yīng)資源的，也可考慮原液稀釋平皿法。當(dāng)原液稀釋10倍1 mL/皿的加菌回收比值仍達(dá)不到0.5的要求，而且1∶10供試液10 mL(即原液1 mL)過(guò)濾產(chǎn)生堵膜的情況，應(yīng)考慮1∶10供試液1 mL薄膜過(guò)濾的情況，能夠過(guò)濾的話，還是優(yōu)先選擇1∶10供試液1 mL薄膜過(guò)濾的方法。