張軍, 吳淑寧, 陳嘉麗, 彭大偉, 李杰, 李杏, 李鴿姿

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院深圳醫(yī)院 深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院甲狀腺乳腺外科,廣東省深圳市518020)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生是多基因、多因素共同作用的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程[1]?；熕幬镒仙即?PTX)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡是治療乳腺癌的主要方法之一，但其對(duì)不同亞型乳腺癌細(xì)胞的治療作用機(jī)制研究較少[2]。既往研究表明，miR-363-5p作為一種微小RNA可參與腫瘤發(fā)展進(jìn)程，與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。例如，上調(diào)miR-363-5p能夠增強(qiáng)順鉑對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷[4]。三結(jié)構(gòu)域蛋白14(tripartite motif 14,TRIM14)作為T(mén)RIM家族中的一員，受miR-363-5p調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞發(fā)展[5]，目前，關(guān)于化療藥物在不同乳腺癌細(xì)胞系中的抑制效果是否與miR-363-5p調(diào)控TRIM14相關(guān)少見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本研究擬探討紫杉醇處理不同乳腺癌細(xì)胞中miR-363-5p與TRIM14的調(diào)控關(guān)系以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討化療藥物誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的潛在新機(jī)制和新治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

miRNA mimics(模擬物)、miRNA inhibitor(干擾物)、siRNA(陰性對(duì)照)和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒均由南京金斯瑞公司合成。SYBR Green qPCR Mix購(gòu)自Bimake公司(B21203)。TRIM14抗體購(gòu)自SAB公司(C40149)。Paclitaxel、GAPDH抗體購(gòu)自深圳市文樂(lè)生物科技有限公司(A4393、ER1901-65)。膜聯(lián)蛋白V-FITC細(xì)胞凋亡染色檢測(cè)試劑盒購(gòu)自ThermoFisher公司(88-8005-74)。5-氟尿嘧啶(5-FU)和PTX購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司(ZC-51406)。蒽環(huán)素(AC)購(gòu)自北京中源合聚生物科技有限公司(Ab141394)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀QuantStudio5購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析儀ImageQuant LAS 4000購(gòu)自美國(guó)Cytiva公司。流式細(xì)胞儀CytoFLEX購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 乳腺癌細(xì)胞和組織

乳腺癌Luminal A亞型細(xì)胞系MCF-7(MCF-7組)、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growthfactor receptor 2，HER2)亞型細(xì)胞系MDA-MB-435(MDA-MB-435組)購(gòu)自PROCELL公司(CL-0149、CL-0289)。乳腺癌Basal亞型細(xì)胞系MCF-12A(MCF-12A組)購(gòu)自DSMZ公司(DC679)。3種乳腺癌細(xì)胞系均于含10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。研究化療藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞miR-363-5p和TRIM14的影響時(shí)，每種細(xì)胞均分為對(duì)照組、5-FU組、PTX組、AC組，對(duì)照組用磷酸鹽緩沖液處理，另外3組各用25 mg/L 5-FU、6 nmol/L PTX、25 nmol/L AC處理48 h后開(kāi)展后續(xù)研究。研究miR-363-5p和TRIM14對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響時(shí)，使用Lipofectamine 2000根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染miRNA模擬物、miRNA干擾物及miRNA陰性對(duì)照至不同乳腺癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染完成48 h后開(kāi)展后續(xù)研究。乳腺癌組織取自2019年11月—2021年5月本院確診乳腺癌病例并行手術(shù)的乳腺癌組織標(biāo)本，其中Luminal A型53例、Luminal B型63例、HER-2(+)ER(-)PR(-)型78例、HER-2(-)ER(-)PR(-)型34例。所有患者均簽署知情同意書(shū)，并且本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞和組織miR-363-5p和TRIM14 mRNA水平

使用TRIzol試劑提取細(xì)胞和乳腺癌組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。在25 μL反應(yīng)液中加入12.5 μL SYBR Green Mix、0.5 μL前引物、0.5 μL反向引物、2 μL cDNA和9.5 μL ddH2O。ABI 7300系統(tǒng)上完成反應(yīng)：95 ℃ 10 min；40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s。靶基因表達(dá)用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化并使用2-ΔΔct方法計(jì)算。引物序列TRIM14：5′-GGATTTGTGTCTCCGTTCTG-3′(sense)和5′-TCTGTCTGCCTGGTATTCTG-3′(antisense)；miR-363-5p：5′-CGGTATTGCACATTACTAAGTTGCA-3′(sense)和5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(antisense)；GAPDH：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′(sense)和5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′(antisense)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞凋亡率

使用膜聯(lián)蛋白-V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)3種細(xì)胞系凋亡率。細(xì)胞處理完成后，收集所有細(xì)胞，室溫下與膜聯(lián)蛋白V和PI一起在黑暗中孵育15 min。單獨(dú)使用膜聯(lián)蛋白V或PI染色作為對(duì)照。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞TRIM14蛋白水平

使用RIPA裂解液獲取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量。將等量蛋白質(zhì)加載到10%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。1 h后，使用5%BSA封閉，完成之后與抗體TRIM14(1∶800稀釋)、GAPDH(1∶3 000稀釋)4 ℃過(guò)夜孵育。次日將印跡與用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h。然后將印跡用TBST洗滌兩次。最后通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯影。

1.6 免疫組化檢測(cè)乳腺癌組織TRIM14表達(dá)水平

對(duì)不同亞型乳腺癌組織切片進(jìn)行免疫組化染色并分析TRIM14表達(dá)水平。染色完成之后，HamamatzuNanozoomer 2.0HT上掃描，通過(guò)圖像分析軟件Olympus cellSens Dimension計(jì)算陽(yáng)性率。

1.7 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析miR-363-5p對(duì)TRIM14的活性影響

miR-363-5p和TRIM14的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)網(wǎng)站Targetscan得到。將TRIM14的3′-UTR片段插入熒光素酶終止密碼子下游的pGL3載體。并使用快速定點(diǎn)誘變?cè)噭┖猩赏蛔冃?mut-)TRIM14。用0.4 μg螢火蟲(chóng)熒光素酶的報(bào)告載體和0.08 μg海腎熒光素酶pRLTK的對(duì)照載體，以及添加或不添加0.5 μg miR-363-5p模擬物，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用雙熒光素酶法連續(xù)測(cè)定螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 7.0軟件和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量的比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)或單向方差分析(ANOVA)。Pearson相關(guān)系數(shù)用于分析4種亞型乳腺癌組織中miR-363-5p和TRIM14表達(dá)水平的相關(guān)性。P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同化療藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡率、miR-363-5p及TRIM14 mRNA的影響

與對(duì)照組比較，不同化療藥物處理均能顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡(P<0.05)，化療藥物處理乳腺癌細(xì)胞后，miR-363-5p表達(dá)均上升，TRIM14 mRNA表達(dá)下降(P<0.05；表1)。

表1 不同化療藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞系凋亡率、miR-363-5p及TRIM14 mRNA的影響

2.2 TRIM14是miR-363-5p的靶向調(diào)控基因

通過(guò)TargetScan分析miR-363-5p的靶向基因。mRNA比對(duì)分析顯示，TRIM14 mRNA序列的3′-UTR包含兩個(gè)推測(cè)的miR-363-5p結(jié)合位點(diǎn)(圖1A)。將miR-363-5p可能的結(jié)合位點(diǎn)分別克隆到pGL3載體，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miRNA與陰性對(duì)照比較，miR-363-5p模擬物和pGL3-wt 3′-UTR載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性明顯下降(圖1B)。

圖1 TRIM14是miR-363-5p的直接靶點(diǎn)

2.3 miR-363-5p靶向抑制TRIM14促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡

MCF-7、MDA-MB-435、MCF-12A細(xì)胞TRIM14蛋白和mRNA水平在過(guò)表達(dá)miR-363-5p后下降，敲低miR-363-5p后上升(圖2A、B)。抑制miR-363-5p表達(dá)后，3種乳腺癌細(xì)胞凋亡率減少，促進(jìn)miR-363-5p表達(dá)后凋亡率增加(圖2C)；而TRIM14反之(圖2D)。

圖2 miR-363-5p靶向TRIM14調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡

2.4 不同亞型乳腺癌組織中miR-363-5p、TRIM14 mRNA和蛋白水平的比較

乳腺癌組織中TRIM14蛋白表達(dá)從高到低依次為L(zhǎng)uminal A、Luminal B、HER-2(+)ER(-)PR(-)和HER-2(-)ER(-)PR(-)型(P<0.05；圖3A和B)。Luminal A、Luminal B、HER-2(+)ER(-)PR(-)和HER-2(-)ER(-)PR(-)乳腺癌組織中TRIM14 mRNA表達(dá)逐漸降低(P<0.05；圖3C)，而miR-363-5p表達(dá)逐漸升高(P<0.05；圖3D)。同時(shí)，Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，3種亞型miR-363-5p和TRIM14 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

圖3 4種亞型乳腺癌組織中miR-363-5p、TRIM14 mRNA和蛋白水平的比較

3 討 論

雖然乳腺癌的存活率在過(guò)去幾年明顯提高，但其化療方法仍然存在局限性[6-7]，因此，仍然需要尋找新的靶點(diǎn)來(lái)描述腫瘤進(jìn)展，為治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供信息。本研究分別使用3種化療藥物5-FU、PTX、AC單獨(dú)處理后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-435、MCF-12A的凋亡率均顯著上升。

在本研究中，過(guò)表達(dá)miR-363-5p后，MCF-7、MDA-MB-435、MCF-12A細(xì)胞凋亡率上升。MCF-7是乳腺癌Luminal A亞型細(xì)胞系，MDA-MB-435是HER2亞型細(xì)胞系，MCF-12A是Basal亞型細(xì)胞系。因此miR-363-5p介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡可能是化療藥物誘導(dǎo)乳腺癌凋亡的另一潛在的廣譜機(jī)制。

miRNA是一種由22個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA[8]。miRNA與mRNA的3′非編碼區(qū)相互作用，促進(jìn)mRNA降解，從而抑制mRNA翻譯[9]。過(guò)表達(dá)miR-363-5p后，MCF-7、MDA-MB-435、MCF-12A細(xì)胞TRIM14蛋白和mRNA下降。另外，熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miR-363-5p能夠直接靶向作用TRIM14。因此，miR-363-5p能夠靶向抑制TRIM14的表達(dá)。

本研究敲低TRIM14后，MCF-7、MDA-MB-435、MCF-12A細(xì)胞凋亡率上升。TRIM蛋白質(zhì)家族由一個(gè)RING域、兩個(gè)B-box域和一個(gè)卷曲螺旋區(qū)域組成[10]。最近的研究表明，TRIM家族成員可能充當(dāng)致癌基因或腫瘤抑制基因[11]。在乳腺癌中，TRIM44可以通過(guò)增強(qiáng)核因子-κB信號(hào)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[12]。TRIM28通過(guò)調(diào)節(jié)TWIST1和EMT24增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[13]。另一方面，TRIM29在人乳腺癌中充當(dāng)缺氧誘導(dǎo)的腫瘤抑制基因[14]。TRIM14是TRIM家族的成員，位于染色體9q22[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，TRIM14過(guò)表達(dá)促進(jìn)了舌鱗狀細(xì)胞癌的侵襲性[16]，人骨肉瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中TRIM14上調(diào)[17]。因此，TRIM14可能是針對(duì)乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。TRIM14是一種泛素化連接酶，基于泛素內(nèi)部不同的賴(lài)氨酸殘基，已鑒定出7種不同類(lèi)型的多聚泛素化鏈(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)，并顯示出不同修飾底物命運(yùn)[17]。其中K6的多聚泛素化反應(yīng)在DNA損傷反應(yīng)中大量增加以修復(fù)DNA損傷。5-FU能夠與胸苷酸合成酶結(jié)合，抑制此酶的活性，使脫氧胸苷酶缺乏，DNA損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。因此，TRIM14的表達(dá)減少伴隨了K6多聚泛素鏈的減少，可能導(dǎo)致了細(xì)胞無(wú)法修復(fù)DNA損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在本研究中，TRIM14蛋白表達(dá)水平從高到低依次為L(zhǎng)uminal A、Luminal B、HER-2(+)ER(-)PR(-)和HER-2(-)ER(-)PR(-)乳腺癌亞型。本研究中的乳腺癌組織樣本均是患者接受新輔助化療后收集的，TRIM14的表達(dá)水平對(duì)化療敏感，因此TRIM14在惡性程度高的類(lèi)型反而表達(dá)低。同時(shí)，Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，3種亞型miR-363-5p和TRIM14 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，化療藥物誘導(dǎo)后，miR-363-5p的表達(dá)上升，miR-363-5p靶向抑制TRIM14的表達(dá)，最終促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。