許詣， 秦建品， 沈文婷

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院襄陽市中心醫(yī)院兒科，湖北省襄陽市 441021)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，隨著病情發(fā)展，可導(dǎo)致患者因終末期腎病而死亡，機(jī)體免疫系統(tǒng)異常激活引發(fā)的全身炎癥是其主要發(fā)病機(jī)制[1-2]。抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)信號(hào)激活，減輕炎癥，降低免疫復(fù)合物沉積，進(jìn)而降低腎細(xì)胞凋亡，改善LN癥狀[3-4]。人參皂苷能降低炎癥介質(zhì)表達(dá)，減弱過氧化反應(yīng)，對(duì)風(fēng)濕性疾病具有較好的療效[5]，且人參皂苷Rg1可阻斷膿毒癥小鼠TLR4/NF-κB/NLRP3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕組織炎癥損傷[6]。本文觀察人參皂苷對(duì)LN小鼠腎損傷及NF-κB/NLRP3通路的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人參皂苷Rg1(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；醋酸潑尼松片(上海信誼藥廠有限公司)；FITC標(biāo)記的羊抗小鼠抗IgG熒光抗體(北京中杉金橋公司)；小鼠抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠抗雙鏈(double-stranded DNA，dsDNA)抗體酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；小鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、兔源NF-κB p65一抗、兔源PCNA一抗、兔源NLRP3抗體、兔源GAPDH一抗、羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒、HE染色試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)。

Combas c311全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司)；RT6500酶標(biāo)儀(美國雷杜公司)；DM750正置光學(xué)顯微鏡(徠克顯微系統(tǒng)有限公司)；YKY-1000四激發(fā)倒置熒光顯微鏡(上海永科光學(xué)儀器有限公司)；YGQ-3126F輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；PowerPac 3000轉(zhuǎn)膜儀、Mini PROTEAN蛋白電泳儀(美國伯樂公司)；Image Master凝膠成像分析儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 動(dòng)物及分組

60只C57BL/6紅斑狼瘡(MRL/lpr)雌性小鼠及12只C57BL/6雌性小鼠購自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(鄂)2018-0009]，體質(zhì)量18～22 g，12周齡。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)范條例進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度22～24 ℃，濕度50%～55%，12 h/12 h明暗循環(huán)光照。

將60只MRL/lpr雌性小鼠隨機(jī)均分為模型組、人參皂苷低(29 mg/kg)、中(58 mg/kg)、高(116 mg/kg)劑量組、醋酸潑尼松(6 mg/kg)組，每組12只，另12只C57BL/6雌性小鼠設(shè)為對(duì)照組。將人參皂苷Rg1和醋酸潑尼松分別制為相應(yīng)質(zhì)量濃度的人參皂苷藥液[7]和醋酸潑尼松藥液[8]，給藥組小鼠以10 mL/kg的劑量灌胃，模型組和對(duì)照組以相同劑量的生理鹽水灌胃，每天上午灌胃1次，共給藥21天。

1.3 觀察小鼠一般情況及測定腎功能指標(biāo)

小鼠末次給藥結(jié)束后，觀察各組小鼠一般情況，包括食量、活動(dòng)情況、體質(zhì)量、精神狀態(tài)、毛色等。收集其24 h內(nèi)尿液，然后以乙醚麻醉小鼠，自頸動(dòng)脈采血1.2 mL，離心收集血清，全自動(dòng)生化分析儀測定尿液24 h尿蛋白及血清肌酐(creatinine，Cr)含量，剩余血清保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 HE染色檢測小鼠腎組織病理改變情況

處死小鼠，解剖取出腎臟，剪下0.5 g腎組織，勻漿并采用細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒分別提取其細(xì)胞核蛋白及細(xì)胞漿蛋白，保存在-80 ℃冰箱。其余腎組織進(jìn)行固定、脫水、透明、包埋處理后，2 μm切片，脫蠟、梯度乙醇浸泡、PBS漂洗處理后，行HE染色，再次脫水、透明后封片，普通光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.5 免疫熒光染色檢測腎組織IgG免疫復(fù)合物沉積

腎組織切片經(jīng)脫蠟、梯度乙醇浸泡、PBS漂洗處理后，滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠抗IgG熒光抗體，避光，室溫孵育3 h，PBS漂洗3遍，避光封片，通過熒光顯微鏡觀察并拍照，以軟件Image Pro Plus 6.0對(duì)圖像熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ含量

酶聯(lián)免疫吸附法測定血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ水平，具體按照各試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 Western blotting檢測腎組織NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白

BCA法測定細(xì)胞核蛋白及細(xì)胞漿蛋白樣品液蛋白總含量，混入適量上樣緩沖液，煮沸5 min變性，各組分別取20 μg蛋白，加入SDS-PAGE濃縮膠上樣孔中，110 V恒壓電泳并濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，使用3%牛血清白蛋白溶液室溫孵育硝酸纖維素膜，封閉膜上蛋白，分別使用兔源NF-κB p65、NLRP3、GAPDH、PCNA一抗溶液4 ℃孵育8 h，TBST溶液漂洗，采用羊抗兔二抗溶液室溫孵育2 h，TBST溶液再次漂洗，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液，顯影蛋白條帶，凝膠成像分析儀拍照并使用Image-J軟件分析圖像蛋白條帶灰度值，最后得出NLRP3、核內(nèi)NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況及腎功能比較

對(duì)照組小鼠飲食、活動(dòng)正常，毛色光滑。模型組小鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少、食欲減退、毛色暗淡，體質(zhì)量較對(duì)照組明顯減輕。人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組小鼠上述癥狀較模型組得到改善，且人參皂苷高劑量組和醋酸潑尼松組上述癥狀改善最明顯。與對(duì)照組比較，模型組小鼠24 h尿蛋白、Cr含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，其他給藥組小鼠24 h尿蛋白、Cr含量降低，且人參皂苷各組呈劑量依賴性遞減(P<0.05；表1)。人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組小鼠24 h尿蛋白、Cr含量比較，差異無顯著性(P>0.05)。

表1 各組小鼠24 h尿蛋白、Cr含量比較(n=12)

2.2 各組腎組織病理形態(tài)比較

對(duì)照組小鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，未見病理損傷。模型組小鼠腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，呈空泡及顆粒狀，腎小球系膜彌漫性增生，有節(jié)段性白金耳樣結(jié)構(gòu)形成，并有炎癥細(xì)胞浸潤，腎組織發(fā)生嚴(yán)重病理損傷。與模型組比較，人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組小鼠腎組織上述病理損傷減輕，且人參皂苷劑量越高，病理損傷越輕；人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組小鼠腎組織形態(tài)幾乎恢復(fù)正常，兩者無明顯差異(圖1)。

圖1 各組小鼠腎組織病理形態(tài)(HE染色，400×)

2.3 各組腎組織IgG免疫復(fù)合物沉積比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織有大量IgG免疫復(fù)合物沉積，其熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組小鼠腎組織IgG免疫復(fù)合物沉積減少，其熒光強(qiáng)度降低，且人參皂苷各組呈劑量依賴性遞減(P<0.05)。人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組小鼠腎組織IgG免疫復(fù)合物沉積及其熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖2)。

圖2 各組小鼠腎組織IgG免疫復(fù)合物沉積及免疫熒光強(qiáng)度

2.4 各組血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ含量比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組上述指標(biāo)含量降低，且人參皂苷各組呈劑量依賴性遞減(P<0.05)。人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組上述指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表2)。

表2 各組小鼠血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ和NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白比較(n=12)

2.5 各組腎組織NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白(核內(nèi)NF-κB p65、NLRP3)表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，人參皂苷低、中、高劑量組及醋酸潑尼松組上述指標(biāo)相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低，且人參皂苷各組呈劑量依賴性遞減(P<0.05)。人參皂苷高劑量組與醋酸潑尼松組相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表2)。

3 討 論

LN的主要病理特征為免疫系統(tǒng)異常激活，SLE特異性標(biāo)志物抗dsDNA抗體、ANA含量及血清炎癥因子水平明顯升高，大量IgG免疫復(fù)合物沉積于腎組織[9-11]。本文中MRL/lpr雌性小鼠精神萎靡、食欲減退、毛色暗淡，體質(zhì)量較正常小鼠明顯減輕，血清ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β、IFN-γ含量明顯升高，腎組織發(fā)生明顯病理損傷，腎功能指標(biāo)異常，腎組織有IgG免疫復(fù)合物沉積，表明MRL/lpr雌性小鼠具有LN的主要臨床癥狀，可作為LN模型用來研究。

人參皂苷是傳統(tǒng)名貴中藥人參干燥根莖的主要有效成分，具有抑制炎癥、減弱氧化應(yīng)激等藥理活性，其家族成員人參皂苷Rg1可下調(diào)NF-κB信號(hào)，降低促炎因子表達(dá)釋放，減弱氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷；人參皂甙Rg3能明顯降低腎細(xì)胞凋亡，緩解糖尿病腎病大鼠腎組織損傷[12-13]。本文結(jié)果顯示，人參皂苷可改善小鼠精神萎靡、食欲減退、毛色暗淡、體質(zhì)量減輕等癥狀，減輕LN小鼠腎組織病理損傷，降低24 h尿蛋白、Cr、ANA、抗dsDNA抗體、IL-1β及IFN-γ含量、腎組織IgG免疫復(fù)合物沉積，表明人參皂苷可降低LN小鼠炎癥因子水平，緩解其免疫系統(tǒng)異常激活，減少IgG免疫復(fù)合物沉積，減輕腎組織炎性損傷，改善腎功能障礙，并隨劑量升高而作用增強(qiáng)。

NF-κB/NLRP3在LN的發(fā)生及疾病進(jìn)展過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用，激活該信號(hào)，可啟動(dòng)炎癥，導(dǎo)致LN發(fā)生發(fā)展；抑制NF-κB激活，可下調(diào)NLRP3炎癥小體生成，阻斷炎癥，減輕SLE引起的腎臟氧化應(yīng)激和炎癥損傷，修復(fù)腎功能[14-15]。本研究以不同劑量人參皂苷處理LN小鼠，可降低其腎組織核內(nèi)NF-κB及NLRP3蛋白表達(dá)水平，并隨劑量升高而作用增強(qiáng)，表明人參皂苷改善小鼠LN臨床癥狀可能是通過NF-κB/NLRP3通路蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，人參皂苷可降低NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移和NLRP3蛋白表達(dá)，減弱炎癥，降低腎組織IgG免疫復(fù)合物沉積，減輕腎損傷，修復(fù)腎功能，改善MRL/lpr小鼠臨床癥狀，為SLE和LN的臨床治療提供了新思路，阻滯NF-κB/NLRP3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是其藥理機(jī)制，但本文的證據(jù)還存在一定不足，后續(xù)需通過激活和抑制該通路進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，以便對(duì)其進(jìn)行更準(zhǔn)確全面的闡述。