符國(guó)宏， 趙宇青， 鄭楊慈， 吳開李， 李立新， 王連臣

(三亞中心醫(yī)院 海南省第三人民醫(yī)院普外科，海南省三亞市572000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常見的惡性腫瘤，其高死亡率與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，轉(zhuǎn)移性CRC患者5年生存率僅10%～15%[1]。miRNAs是單鏈、內(nèi)源性非編碼RNA，可靶向靶基因3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[2]。有研究表明，miRNAs通過調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[3-4]。miR-708、miR-150抑制CRC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。miR-299-3p對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用也在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、胃癌和前列腺癌中得到證實(shí)[6-7]。干細(xì)胞基因如OCT4B1在致癌和腫瘤行為中發(fā)揮重要作用，如子宮內(nèi)膜癌[8]。最近研究表明，miR-299-3p可維持內(nèi)皮細(xì)胞OCT4B1穩(wěn)態(tài)和生理功能，且下調(diào)OCT4B1的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡[9]。但miR-299-3p與OCT4B1在CRC細(xì)胞中的功能仍不清楚。本研究擬探討miR-299-3p靶向OCT4B1調(diào)控CRC細(xì)胞SW480增殖、遷移、侵襲及凋亡的作用，為CRC治療靶點(diǎn)的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone)；HiPerFect Transfection Reagent(德國(guó)大通基因生物科技)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)(美國(guó)Sigma公司)；AnnexinV-FITC、碘化丙啶(美國(guó)BioLegend生物科技)；Transwell室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；MatrigelTMBasement Membrane Matrix(北京明陽科華生物科技有限公司)；TRIzol?試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)通用應(yīng)用生物科技)；AB ScriptII cDNA第一鏈合成試劑盒(中國(guó)碧云天生物科技)；10%胎牛血清、Taq Man miRNA Assay Probes、SYBR Premix ExTaqTMReal-Time PCR Kit(賽默飛世)；OCT4B1、β-肌動(dòng)蛋白一抗、辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗(美國(guó)細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人CRC SW480細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。將SW480細(xì)胞分為NC組、mimics組、inhibitor組，分別轉(zhuǎn)染miR-NC(空白載體)、miR-299-3p過表達(dá)載體(miR-299-3p mimics)、miR-299-3p低表達(dá)載體(miR-299-3p inhibitor)質(zhì)粒，所有質(zhì)粒由GeneBio Pharma(中國(guó)上海)設(shè)計(jì)和合成。

1.3 細(xì)胞活力及單克隆形成數(shù)的測(cè)定

將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以4×103個(gè)/孔接種到96孔板并孵育72 h。將細(xì)胞與10 μL CCK-8溶液37 ℃共孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)量每個(gè)時(shí)間點(diǎn)光密度(OD)，并計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

將各組SW480細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞，以4×105個(gè)/孔接種到6孔培養(yǎng)板，24 h后將50個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)2周，將細(xì)胞用結(jié)晶紫-福爾馬林溶液染色10 min，并計(jì)數(shù)細(xì)胞單克隆形成數(shù)。

1.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染72 h后，收獲細(xì)胞，PBS洗滌2次，4 ℃ 70%乙醇固定1 h。細(xì)胞與50 μL RNase1室溫下孵育10 min以降解RNA。將細(xì)胞在4 ℃下15 g離心5 min，然后加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶室溫下暗處雙染色30 min。使用FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

1.5 Transwell室法測(cè)定細(xì)胞侵襲

細(xì)胞侵襲使用Transwell室在37 ℃、50 μL MatrigelTMBasement Membrane Matrix下預(yù)包被2 h進(jìn)行評(píng)估。SW480細(xì)胞加入上室，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，遷移到下室的細(xì)胞10%甲醇固定30 s，0.1%結(jié)晶紫染色后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.6 qRT-PCR測(cè)定miR-299-3p、OCT4B1 mRNA表達(dá)

使用TRIzol?試劑從細(xì)胞系中提取總RNA，并使用Taq Man microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒或ABS criptII cDNA第一鏈合成試劑盒在37 ℃ 60 min或98 ℃ 10 min合成cDNA。使用Taq Man miRNA Assay Probes或SYBR Premix ExTaqTMReal-Time PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。熱循環(huán)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，60 ℃ 1 min。miR-299-3p和OCT4B1表達(dá)分別以U6和β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，并使用2-ΔΔCq方法計(jì)算。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

引物序列：miR-299-3p正向5′-TCGACUTGCGA TCGATCGAUTCGATCGATCU-3′，反向5′-UTCGATC TAGCUTCGATCGTAUTCGATCGATCA-3′；U6正向5′-TGUTGTGCTAGCTAGCTAGCTAGCAUTGCTAGCT AGU-3′，反向5′-TUGTGCTAGCTAGCTAGCUTUGTGATCGATCGATGC-3′；OCT4B1正向5′-TCGATCGTACGTAGCTAGCTAGCTAGTGCTAGCTAGCTA-3′，反向5′-TGCTAGCTAGTGTCGTAGCUTCGATCGTA GCTAGCTAGC-3′；β-肌動(dòng)蛋白正向5′-TCGATCGTAGCTAGCTAGCTAGGGTAGCTAGCTAGCTAGCTA GCTGGGTGTC-3′，反向5′-TGTGCTAGCTACGTGG GGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGGGTC-3′。

1.7 蛋白印記法測(cè)定OCT4B1蛋白表達(dá)

用RIPA裂解液從細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)樣品，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)水平。將等量蛋白質(zhì)樣品(30 μg)在10% SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在含有0.2% Tween-20(TBST)的Tris緩沖鹽水中室溫封閉膜2 h。然后，將膜與OCT4B1和GAPDH的一抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗滌后，將膜與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶二抗室溫下孵育2 h，并通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)捕獲印記信號(hào)。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

miR-299-3p與OCT4B1的結(jié)合位點(diǎn)通過網(wǎng)站Targetscan得到(http://www.targetscan.org/vert_72/)。用0.4 μg螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體和0.08 μg海腎熒光素酶pRLTK對(duì)照載體，添加或不添加0.5 μg miR-299-3p mimic，共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用雙熒光素酶法連續(xù)測(cè)定螢火蟲和海腎熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-299-3p抑制OCT4B1的表達(dá)

與NC組比較，miR-299-3p水平mimics組升高，inhibitor組降低，且mimics組高于inhibitor組；OCT4B1 mRNA和蛋白水平mimics組降低，inhibitor組升高，且mimics組低于inhibitor組(P<0.05；表1和圖1)。

圖1 各組SW480細(xì)胞OCT4B1蛋白的比較

表1 各組SW480細(xì)胞miR-299-3p、OCT4B1 mRNA和蛋白水平的比較

2.2 miR-299-3p靶向調(diào)控OCT4B1

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-299-3p與OCT4B1序列之間存在結(jié)合位點(diǎn)；與NC組比較，miR-299-3p mimic和pGL3-wt 3′-UTR載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(圖2)。

圖2 OCT4B1靶向調(diào)控miR-299-3p

2.3 各組SW480細(xì)胞存活率和單克隆形成數(shù)的比較

與NC組比較，細(xì)胞存活率和單克隆形成數(shù)mimics組降低，inhibitor組升高，且mimics組低于inhibitor組(P<0.05；圖3)。

圖3 各組SW480細(xì)胞存活率和單克隆形成數(shù)的比較

2.4 各組SW480細(xì)胞凋亡率和侵襲能力的比較

與NC組比較，細(xì)胞凋亡率mimics組升高，inhibitor組降低，且mimics組高于inhibitor組；細(xì)胞穿膜數(shù)mimics組降低，inhibitor組升高，且mimics組低于inhibitor組(P<0.05；圖4)。

圖4 各組SW480細(xì)胞凋亡率和侵襲能力的比較

3 討 論

CRC是全球最常見的惡性胃腸道腫瘤類型，其危險(xiǎn)因素包括肥胖、吸煙、遺傳因素和慢性腸道炎癥，CRC的主要治療策略已取得進(jìn)展，但其長(zhǎng)期生存率仍然很低，特別是在晚期、局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。治療這些患者的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是對(duì)CRC發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足。microRNAs(miRNAs/miRs)由19～25個(gè)核苷酸組成，是一組非編碼內(nèi)源性RNA分子，miRNA參與癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，尤其是在CRC中。miR-299-3p，miRNA家族的一員，通過靶向不同的相關(guān)分子在各種癌癥類型中發(fā)揮抑制作用。有研究報(bào)道，過表達(dá)miR-299-3p直接靶向重組信號(hào)結(jié)合蛋白Jκ抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，miR-299-3p靶向I型膠原蛋白α1抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。miR-299-3p的低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的臨床病理參數(shù)相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，mimics組存活率、單克隆形成數(shù)、穿膜數(shù)低于inhibitor組和NC組，而凋亡率高于NC組；inhibitor組存活率、單克隆形成數(shù)、穿膜數(shù)高于NC組，凋亡率低于NC組；inhibitor組存活率、單克隆形成數(shù)、穿膜數(shù)高于mimics組，凋亡率低于NC組，表明miR-299-3p可抑制直腸癌細(xì)胞SW480增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)其凋亡，miR-299-3p是CRC的腫瘤抑制因子。

據(jù)報(bào)道，OCT4B1通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制凋亡進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展。OCT4B1是影響肝癌患者生存的獨(dú)立因素，其表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)[15]。已證明miR-299-3p可以下調(diào)OCT4B1的表達(dá)，這可能影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，miR-299-3p和miR-223可以降低OCT4B1 mRNA表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞周期蛋白E的活性和細(xì)胞周期進(jìn)程[16]。在肺癌的體外細(xì)胞試驗(yàn)中，抑制miR-157會(huì)增加凋亡細(xì)胞的數(shù)量，這可能是由于內(nèi)源性O(shè)CT4B1通過一種未知機(jī)制降低細(xì)胞周期蛋白E的活性，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡；此外，促進(jìn)OCT4B1的表達(dá)可導(dǎo)致HCT116細(xì)胞活力增加和細(xì)胞凋亡抑制，而在轉(zhuǎn)染miR-299-3p后OCT4B1產(chǎn)生了相反的結(jié)果[17-18]。這說明HCT116細(xì)胞的增殖和凋亡與OCT4B1的作用可能存在直接關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，mimics組細(xì)胞miR-299-3p高于inhibitor組和NC組，OCT4B1 mRNA和蛋白低于inhibitor組和NC組；inhibitor組細(xì)胞miR-299-3p低于inhibitor組和NC組，OCT4B1 mRNA和蛋白高于inhibitor組和NC組；inhibitor組細(xì)胞miR-299-3p低于mimics組、OCT4B1 mRNA和蛋白高于mimics組，這提示miR-299-3p能明顯抑制OCT4B1 mRNA和蛋白的表達(dá)。

綜上所述，miR-299-3p過表達(dá)可抑制SW480細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，同時(shí)促進(jìn)其凋亡；其機(jī)制可能與miR-299-3p明顯抑制OCT4B1 mRNA與蛋白的表達(dá)有關(guān)。