張慧 李筱榮 Zhou Lei

1天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點實驗室，天津 300384；2Singapore Eye Research Institute，Singapore 999002

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者常見的眼底并發(fā)癥，是世界范圍內(nèi)主要的致盲眼病之一。目前DR的治療方式包括激光光凝、玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物和玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)，但這些方法僅適用于疾病中晚期，其療效在不同患者間差異較大，因此需要基于病變不同階段的分子病理機制、新型生物標(biāo)志物和個性化治療方案等多個層面對DR進(jìn)行更系統(tǒng)的理解。近年來，高通量組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)在DR基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的飛速發(fā)展，蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)研究是系統(tǒng)研究生命活動的有用工具，蛋白質(zhì)或代謝物的變化代表了遺傳和環(huán)境因素的相互作用，并提供了與基因組、轉(zhuǎn)錄組的互補信息，為我們提供了全面了解DR病理機制和治療靶點的新途徑。目前許多研究者從對DR患者的眼內(nèi)液、淚液和血液等各種生物樣本的組學(xué)分析中積累了大量的組學(xué)數(shù)據(jù)，為系統(tǒng)探究DR的生物標(biāo)志物以及病理機制提供了豐富的信息資源。然而，這些激增的海量數(shù)據(jù)也使研究者面臨著一個重大挑戰(zhàn)，即如何從海量數(shù)據(jù)中獲取有意義的信息，因此在組學(xué)研究中采取合適的策略和前沿的技術(shù)以節(jié)約樣本，提高組學(xué)數(shù)據(jù)的利用率，從而系統(tǒng)深入地探討DR的發(fā)病機制和探索新型生物標(biāo)志物以及治療靶點是實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的方向之一。

1 利用蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)技術(shù)尋找DR新型生物標(biāo)志物

研究表明，DR的發(fā)生具有很多危險因素和經(jīng)典的生物標(biāo)志物。流行病學(xué)調(diào)查顯示，長的糖尿病病程和血糖控制欠佳是DR進(jìn)展的危險因素，也是致盲性DR的預(yù)測因素。血液中糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)含量可反映血糖控制水平，是最早被發(fā)現(xiàn)的DR生物標(biāo)志物之一。除血液外，DR患者房水和玻璃體中VEGF、色素上皮衍生因子和人血管緊張肽Ⅱ等蛋白濃度升高也一定程度上增加眼部產(chǎn)生新生血管的風(fēng)險，故也認(rèn)為是DR生物標(biāo)志物[1]。但是隨著大規(guī)模糖尿病隊列研究的開展，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的單一生物標(biāo)志物在對疾病的深入研究中顯示出一定的局限性，如研究表明HbA1c并不是糖尿病患者發(fā)生微血管并發(fā)癥的獨立預(yù)測因子，其對DR早期病變風(fēng)險的預(yù)測值僅為11%[2]，故仍待尋找更多糖尿病微血管并發(fā)癥的生物標(biāo)志物。此外眼內(nèi)液樣本的獲取為有創(chuàng)性，房水和玻璃體液中的生物標(biāo)志物研究在臨床應(yīng)用方面仍存在很大限制。蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)研究利用組學(xué)高通量大數(shù)據(jù)的特點，可對DR患者的多種樣本進(jìn)行蛋白譜和代謝譜分析，并可借助靶向組學(xué)和人工智能算法等技術(shù)，為探索DR新型生物標(biāo)志物提供了極大的便利。

1.1 人工智能算法助力生物標(biāo)志物的快速篩選

蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)的主要優(yōu)勢是短時高效地獲取大量蛋白質(zhì)和小分子代謝物的原始信息，并借助人工智能和機器算法對大數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，尋找多種生物標(biāo)志物的組合，以獲得最優(yōu)診斷。Torok等[3-4]將機器算法引入DR患者淚液的蛋白組學(xué)研究中以發(fā)現(xiàn)新的DR生物標(biāo)志物組合。該團(tuán)隊首先評估了6種不同機器學(xué)習(xí)算法的診斷效力，包括支持向量機、遞歸分區(qū)、隨機森林、樸素貝葉斯、邏輯回歸、K-最近鄰等，發(fā)現(xiàn)效果最好的遞歸分區(qū)法確定的生物標(biāo)志物敏感性和特異性分別為74%和48%，診斷效力欠佳。隨后該團(tuán)隊采取結(jié)合眼底微動脈瘤以及淚液蛋白的方法建立診斷模型，敏感性和特異性分別提高至87%和68%。由此可見，僅用機器學(xué)習(xí)算法選擇和分類的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物用于篩選目的特異性和敏感性較低，而結(jié)合眼底特征建立混合模型診斷性能較高。在代謝組學(xué)的研究中，Sun等[5]對增生性DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)人群的血漿代謝物進(jìn)行綜合分析，使用基于最小絕對收縮和選擇算子正則化邏輯回歸(least absolute shrinkage and selection operator regularization logistic regression，LASSO-LR)的機器學(xué)習(xí)模型建立和評估基于所選代謝物水平的風(fēng)險評分，發(fā)現(xiàn)4種循環(huán)血漿代謝物(假尿苷、谷氨酸、亮氨酰亮氨酸和N-乙酰色氨酸)與PDR顯著相關(guān)。由此可見，與傳統(tǒng)生物標(biāo)志物只能從某一方面反映DR進(jìn)展風(fēng)險不同，機器算法結(jié)合組學(xué)技術(shù)可快速篩選生物標(biāo)志物的組合，有利于對DR進(jìn)展風(fēng)險進(jìn)行系統(tǒng)評估。

1.2 靶向組學(xué)研究提供生物標(biāo)志物的高效驗證

傳統(tǒng)蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)為疾病表達(dá)譜的最大程度表征，采取非靶向定量技術(shù)對樣本的所有蛋白及代謝物進(jìn)行分析。受生物樣本復(fù)雜性的影響，樣本中低豐度的蛋白多肽信號容易受高豐度蛋白多肽信號的限制，因此難以發(fā)現(xiàn)具有關(guān)鍵作用的低豐度蛋白。靶向定量技術(shù)可以彌補上述非靶向定量的不足，更有針對性地分析蛋白的特定化學(xué)特征，偏向于對蛋白和代謝物的定量分析。靶向組學(xué)技術(shù)具有高通量、高準(zhǔn)確性、可重復(fù)性的優(yōu)點，基于早期的差異蛋白組/代謝組的數(shù)據(jù)，即便是生物樣本量少也能夠同時驗證多個標(biāo)志物。我們使用高分辨率的多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(multiple reaction monitoring，MRM)在1 μl的人類淚液樣本中量化了47種人類淚液蛋白[6]，極大地提高了樣本利用度。

針對DR生物標(biāo)志物的非靶向蛋白組學(xué)研究往往采取ELISA和Western blot 方法進(jìn)行靶蛋白驗證，盡管結(jié)果可靠，但是存在驗證周期長、成本高、樣本利用率低的局限性，尤其是特別稀缺的樣本很難同時驗證多個候選生物標(biāo)志物。靶向組學(xué)為DR生物標(biāo)志物的大規(guī)?？焖衮炞C提供了技術(shù)平臺。在蛋白組學(xué)研究中，Kim等[7]首先用MRM技術(shù)對DR患者玻璃體液和血漿中12個目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量測定，隨后擴大驗證范圍，在血漿樣本中應(yīng)用MRM技術(shù)驗證了54種蛋白生物標(biāo)志物[8]，其中4種蛋白標(biāo)志物組合構(gòu)成一種多蛋白生物標(biāo)志物模型，對無DR的糖尿病患者和非增生期DR(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)患者診斷的AUC為0.99，對DR早期診斷具有重要意義。平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)(parallel reaction monitoring，PRM)也用于尋找玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗(intravitreal injection of ranibizumab，IVR)術(shù)后的生物標(biāo)志物[9]。She等[9]對比了IVR治療前后PDR患者玻璃體蛋白譜的差異，并在驗證集的樣本中通過PRM驗證了7種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與發(fā)現(xiàn)集相一致，可以作為IVR治療的生物標(biāo)志物。在代謝組學(xué)研究中，許國旺研究團(tuán)隊[10]采取多平臺代謝組學(xué)方法全面表征血清代謝譜篩選和驗證DR生物標(biāo)志物，并用MRM技術(shù)在驗證集中進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)12-羥基二十碳四烯酸和2-哌啶酮的生物標(biāo)志物組合在區(qū)分DR和糖尿病方面比HbA1c診斷效能更好，有助于DR早期診斷。與基于抗體的檢測相比，臨床蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)中的靶向組學(xué)研究具有幾大優(yōu)勢，如不需要抗體、檢測范圍廣泛、高通量分析能力以及檢測成本低等，因此在篩選生物標(biāo)志物領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。

1.3 蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)有助于無創(chuàng)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

近年來隨著組學(xué)樣本制備技術(shù)的進(jìn)步，使得無創(chuàng)收集的各種體液樣本生物標(biāo)志物研究成為可能。淚液獲取方便快捷且完全無創(chuàng)，盡管淚液并不直接與視網(wǎng)膜相鄰，但是淚液成分會受到糖尿病的影響，因此部分研究通過對淚液的蛋白質(zhì)和代謝物變化進(jìn)行分析而尋找DR的生物標(biāo)志物。與無DR的糖尿病患者相比，NPDR患者淚液中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2/-5/-18、腫瘤壞死因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2/-3/-9濃度升高。與非PDR和健康受試者相比，PDR患者的IL-5/IL-18和MMP-3/MMP-9等蛋白的相對豐度上調(diào)[11]，提示炎癥可能參與DR的發(fā)生和進(jìn)展。另一方面，腸道菌群研究的不斷深入將腸代謝與DR 的進(jìn)展聯(lián)系在一起，研究表明健康人群與糖尿病及DR患者之間的腸道微生物群組成存在顯著差異，DR患者糞便中肌肽、琥珀酸、煙酸和煙酰胺水平顯著低于健康對照組[12]。Ye等[13]還根據(jù)PDR患者糞便的16S rRNA基因測序和非靶向代謝組學(xué)結(jié)果構(gòu)建了一個基于糞便代謝物的分類器，以準(zhǔn)確區(qū)分PDR患者和無DR的糖尿病患者。這表明DR患者的腸道菌群種屬改變可能導(dǎo)致糞便代謝物的改變并參與DR進(jìn)展，是新型無創(chuàng)DR生物標(biāo)志物的來源。

2 蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)研究探究DR進(jìn)展的病理機制

2.1 橫斷面研究現(xiàn)狀

DR是慢性進(jìn)行性糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜微血管滲漏和阻塞從而引起一系列的眼底病變，病程具有明顯的階段性，各期具有相對不同的病理特征。因此在某一時段同時收集處于不同病理階段的DR患者樣本進(jìn)行差異蛋白或代謝物分析有利于對DR病理機制的深刻理解。截至目前，人們已經(jīng)對DR患者的視網(wǎng)膜增生膜、玻璃體液、房水、血漿或血清等多種生物樣本進(jìn)行蛋白組學(xué)或代謝組學(xué)研究[1]，DR患者玻璃體中含有的大量蛋白質(zhì)和代謝物是DR組學(xué)研究的主要對象。研究表明，補體和凝血級聯(lián)通路在DR患者玻璃體中被激活[14]，房水蛋白組學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)了炎癥蛋白的高表達(dá)以及補體和凝血級聯(lián)通路的上調(diào)[15]，表明DR進(jìn)展伴隨炎癥反應(yīng)及凝血功能障礙，提示臨床治療DR的同時應(yīng)采取抗炎和促積血吸收等多種策略。上述研究中研究者多選取黃斑裂孔、黃斑前膜和視網(wǎng)膜脫離患者的眼內(nèi)液作為對照組，然而，研究發(fā)現(xiàn)這3種疾病也存在著各自蛋白表達(dá)譜的異常[16-18]。另外健康人和糖尿病患者存在極大的代謝差異[19]，因此DR的研究應(yīng)選取單純糖尿病患者的生物樣本作為對照。與眼內(nèi)液相比較，血液樣本的獲取更簡單，并可將健康人群和單純糖尿病患者的血液作為對照，研究中應(yīng)用更廣泛。

研究表明，DR患者血漿、血清及血漿中的細(xì)胞外囊泡含有大量可以促進(jìn)DR進(jìn)展的蛋白質(zhì)和代謝物，一方面可以作為生物標(biāo)志物進(jìn)行大規(guī)模驗證，一方面可以作為DR的新治療靶點進(jìn)行探索。我們對PDR患者血漿外泌體進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析[20]，隨后用ELISA在更大的樣本量中對靶點進(jìn)行驗證，結(jié)果表明PDR患者血漿外泌體中的腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8(tumor necrosis factor-α induced protein 8，TNFAIP8)表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步體外實驗證實，TNFAIP8促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移，是DR的潛在治療靶點。在代謝組學(xué)研究中，我們采用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行了基于人群的巢式病例對照代謝組學(xué)研究[21]，調(diào)整混雜因素后鑒定出11種與DR有關(guān)的代謝物，隨后在另一個同等樣本量的獨立樣本集中進(jìn)行驗證，結(jié)果表明2-脫氧核糖酸和3,4-二羥基丁酸是DR新型代謝生物標(biāo)志物，戊糖磷酸途徑被鑒定為與DR相關(guān)的關(guān)鍵代謝失調(diào)通路，這表明氧化應(yīng)激參與DR的發(fā)病機制，這些發(fā)現(xiàn)為縱向代謝組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。然而，針對血液樣本的蛋白組學(xué)研究可能會受到一些混雜因素的影響，血液采集和隨后的制備錯誤可能導(dǎo)致血小板蛋白和凝血相關(guān)蛋白污染[22]，最終導(dǎo)致生物標(biāo)志物的選擇出現(xiàn)偏倚。因此必須嚴(yán)格控制樣本的收集及制備過程，以不斷提高生物標(biāo)志物的特異性及穩(wěn)健性。

2.2 在蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)研究中開展隊列研究的必要性

上述研究為橫斷面研究方法，樣本收集難度低，可以在短期內(nèi)發(fā)現(xiàn)與DR不同病理階段相關(guān)的蛋白或者代謝物，但是無法體現(xiàn)同一個體發(fā)展的連續(xù)性和代際效應(yīng)，無法確定差異代謝物與疾病或其嚴(yán)重程度之間的因果關(guān)系。一些由橫斷面研究確定的生物標(biāo)志物可能代表短期代謝紊亂，而不是與DR發(fā)展相關(guān)的慢性風(fēng)險因素，因此采用蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)策略展開隊列研究是十分必要的。在隊列研究中，以DR的加重作為觀察終點篩選出的差異蛋白或代謝物指向DR的危險因素，而以糖尿病不進(jìn)展為DR作為觀察終點可以篩選出DR的保護(hù)因素，為臨床新藥的研發(fā)提供治療靶點。截至目前，在基于蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的DR臨床研究領(lǐng)域仍然缺乏大量的縱向研究。一項針對Ⅰ型糖尿病患者的隊列研究納入了648名受試者，受試者被分為無DR、輕度NPDR、中度NPDR、PDR和伴有纖維化的PDR。在首先進(jìn)行的針對血清的代謝組學(xué)橫斷面研究結(jié)果顯示，2,4-二羥基丁酸、3,4-二羥基丁酸、核糖酸、核糖醇和三酰甘油50∶ 1和50∶ 2與DR具有相關(guān)性。在5年的隨訪中采用COX等比例風(fēng)險模型進(jìn)行DR進(jìn)展的危險因素分析，發(fā)現(xiàn)血清中較高的3,4-二羥基丁酸水平是DR進(jìn)展的生物標(biāo)志物[23]?？v向的隊列研究更關(guān)注疾病的動態(tài)變化，借助組學(xué)技術(shù)動態(tài)隨訪DR患者的蛋白和代謝物表達(dá)譜變化，是探尋DR風(fēng)險因素的最佳手段，具有極大的研究價值。

3 蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)對抗VEGF治療方案的探究推動了DR精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展

蛋白組學(xué)/代謝組學(xué)反映了基因、環(huán)境和生活方式的變化，是精準(zhǔn)醫(yī)療中應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域之一?？筕EGF藥物已廣泛用于PDR患者的術(shù)前抑制新生血管中，以減少術(shù)中出血，其作用除直接拮抗VEGF外，分子機制尚不完全清楚。多項研究對雷珠單抗治療前后的玻璃體進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析[9]，發(fā)現(xiàn)除VEGF蛋白水平降低外，載脂蛋白C1和MMP組織抑制劑等蛋白的表達(dá)水平也降低，這些蛋白質(zhì)在脂代謝以及炎癥、新生血管等方面具有促進(jìn)作用。另一項研究表明，術(shù)前康柏西普玻璃體注射可以減少載脂蛋白A2和高敏反應(yīng)蛋白C水平，通過抑制補體激活通路和炎癥反應(yīng)來改善PDR患者手術(shù)預(yù)后[24]。此外，臨床上抗VEGF藥物的選擇依賴醫(yī)生的經(jīng)驗，導(dǎo)致部分患者治療效果欠佳，甚至出現(xiàn)反復(fù)注射后的眼部不適癥狀[25]。一項研究對3種常用的玻璃體內(nèi)抗VEGF藥物(雷珠單抗、阿柏西普和康柏西普)治療PDR患者后房水蛋白質(zhì)水平變化進(jìn)行比較[26]，發(fā)現(xiàn)視黃酸受體反應(yīng)蛋白1、醛脫氫酶3A1和視黃醇結(jié)合蛋白4在3種抗VEGF藥物治療后都受到特異性調(diào)節(jié)，這表明3種藥物有共同的作用通路。但是，VEGF受體1和受體2等蛋白在不同的抗VEGF藥物組中存在差異表達(dá)，可以解釋這些患者存在抗VEGF治療反應(yīng)的異質(zhì)性，為將來針對不同患者精準(zhǔn)選擇抗VEGF藥物提供了依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)注射貝伐單抗后的患眼玻璃體纖維化蛋白表達(dá)增加[27]。另一項不區(qū)分抗VEGF藥物的研究也表明，相較于未經(jīng)治療和術(shù)前接受全視網(wǎng)膜光凝的患者，術(shù)前接受玻璃體腔注藥的患者玻璃體纖連蛋白和纖維蛋白原α、β和γ鏈的表達(dá)增加[28]，提示臨床上在應(yīng)用抗VEGF藥物的同時，探索抗VEGF和抗纖維蛋白-纖連蛋白復(fù)合物形成聯(lián)合給藥能有效改善玻璃體腔注藥術(shù)后的玻璃體視網(wǎng)膜纖維化改變。對抗VEGF術(shù)后玻璃體及房水蛋白質(zhì)的表征有助于深入理解不同藥物的作用機制，不斷改進(jìn)治療方案，推進(jìn)DR的精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)展。

蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)在DR研究領(lǐng)域已廣泛用于生物標(biāo)志物的尋找、發(fā)病機制的探索和新的治療靶點的探索等。目前對DR患者眼內(nèi)液、淚液及血液等生物樣本的表征繪制了較為完整的蛋白質(zhì)和代謝物表達(dá)譜，在完整表征的基礎(chǔ)上應(yīng)用人工智能方法和靶向組學(xué)技術(shù)提高了驗證生物標(biāo)志物的效率，有利于快速篩選新型生物標(biāo)志物。采取橫斷面或者隊列研究方法尋找差異蛋白和差異代謝物以及相關(guān)的通路為DR發(fā)病機制的研究提供了全新的思路。在臨床研究中，基于患者個體差異進(jìn)行的組學(xué)研究更加貼近實際需求，最終目的是根據(jù)患者的異質(zhì)性定制個性化的治療方案，推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的開展。盡管蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)研究取得了部分研究成果，但到目前為止，由于缺乏長期的隊列研究和多中心大樣本的驗證，利用蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)方法尋找DR生物標(biāo)志物和治療靶點仍然面臨一定的挑戰(zhàn)，其臨床適用性依賴于所采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。研究者應(yīng)提前制定研究計劃，包括確保最高數(shù)據(jù)質(zhì)量和最低分析變異性的所有關(guān)鍵步驟，這包括樣本類型、樣本收集、樣本量、樣本處理和數(shù)據(jù)分析。此外，我們應(yīng)始終將組學(xué)實驗設(shè)計與臨床需求相結(jié)合，并進(jìn)行充分的驗證和基礎(chǔ)研究，以確保組學(xué)結(jié)果的可靠性和臨床適用性。

利益沖突本研究作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明李筱榮、Zhou Lei：參與選題、文章智力性內(nèi)容修改和最終定稿；張慧：參與資料的收集、論文撰寫和修改