農(nóng) 微， 韋金銳， 陳柏承， 衛(wèi)智權(quán)

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200)

心腦血管疾病已連續(xù)多年位居我國人民死亡原因的首位，而且其發(fā)病率仍不斷增長，其中動脈粥樣硬化是心腦血管疾病最主要的危險因素[1]，早期缺乏特異癥狀，當發(fā)現(xiàn)時大多數(shù)已出現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的粥樣硬化斑塊，故預(yù)防的意義大于后期的治療。研究表明，動脈粥樣硬化與低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)及其氧化修飾形成的氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein，ox-LDL)密切相關(guān)[2]，ox-LDL可使血管內(nèi)皮細胞過表達細胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管粘附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)、P-選擇素(P-selectin)與巨噬細胞趨化蛋白1(macrophage chemotactic protein 1, MCP-1)，提升血管內(nèi)皮細胞趨化血液循環(huán)中的單核細胞的能力，單核細胞逐漸衍變?yōu)榕菽毎M而形成早期動脈粥樣硬化病變的脂質(zhì)條紋，此后相繼出現(xiàn)粥樣和纖維粥樣斑塊及復合病變[3]。由上述病理過程可知，血管內(nèi)皮細胞趨化單核細胞是動脈粥樣硬化進程起始的關(guān)鍵，設(shè)法減少ox-LDL誘導的血管內(nèi)皮細胞過表達ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin，或能在早期遏止動脈粥樣硬化病理進程。

他汀類藥物已被證明對于預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生是有效的，但長期治療仍缺乏足夠的安全性保證，故尋找安全性更高的新型藥物非常重要[4]。金花茶葉為山茶科植物金花茶Camelliachrysantha(Hu) Tuyama的葉片，主要分布于中國廣西境內(nèi)，性平，味微苦、澀，是廣西壯族的傳統(tǒng)用藥，具有良好的清熱解毒作用[5]，本實驗以其提取物為對象，采用體外含藥血清藥理學實驗結(jié)合體內(nèi)活性實驗來考察其基于負調(diào)控血管內(nèi)皮細胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin表達，從而抑制ox-LDL誘導的單核細胞趨化、粘附，以減輕動脈粥樣硬化的潛在作用，以期為該藥材開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株與動物 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)、THP-1人單核細胞株，均購自中國科學院昆明細胞庫。SPF級雄性SD大鼠10只，購自北京大學醫(yī)學部(實驗動物科學部)，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0010；6周齡SPF級C57BL/6JGpt雄性小鼠8只、6周齡ApoE-/-雄性小鼠24只，均購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2018-0008，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度21～25 ℃，相對濕度70%～80%。

1.2 藥材與藥物 金花茶葉購自廣西峰下花貿(mào)易有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室廖月葵高級實驗師鑒定為山茶科植物大葉金花茶Camelliachrysantha(Hu) Tuyama var.macrophyllaS. L. Mo et S. Z. Huang的干燥葉片。辛伐他汀購自廈門力卓藥業(yè)有限公司，批號181105。

1.3 試劑 RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、Accutase膠原酶細胞解離液、Pen Strep青鏈霉素混合液(美國Gibco公司，批號2120425、1828728、8117266、1952692、1881461)；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)、FBS培養(yǎng)基、ECGS培養(yǎng)基、P/S Solution培養(yǎng)基(美國Scien Cell公司，批號28755、29009、29065、28331)；CCK-8細胞增殖活性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所，批號DV652)；蛋白電泳預(yù)制膠(南京金斯瑞生物科技有限公司，批號C35252003)；ox-LDL、組織細胞裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記羊抗兔IgG(北京索萊寶科技有限公司，批號H7980、20190903、20190910、20190909)；Image-iT 細胞固定與透化試劑盒(美國Life Technologies公司，批號1968179)；小鼠抗人CD14- Alexa Fluor 488單抗(美國Invitrogen公司，批號2016143)；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)單抗(英國Abcam公司，批號GR202362-1)；兔抗人ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin單抗(美國Cell Signaling Technology公司，批號02、02、01、05)；HRP標記兔抗小鼠IgG[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號G218AA0001]。

1.4 儀器 細胞共培養(yǎng)板(無錫耐思生命科技股份有限公司，批號071719XS01)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)；冷凍干燥儀(美國IXRF公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；5430R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Infinite 200 Pro酶標儀(瑞士Tecan公司)；LSR Fortessa多色分析流式細胞儀(美國BD公司)；Mini-PROTEAN垂直電泳儀、Mini Trans-blot轉(zhuǎn)印儀、Chemi Doc成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；ASP300S全自動組織脫水機、RM2245半自動輪轉(zhuǎn)切片機、EG1150H石蠟包埋機(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 THP-1人單核細胞與HUVEC細胞的體外培養(yǎng) THP-1細胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基，HUVEC細胞采用ECM內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，均添加10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素，初始細胞密度2×105/mL，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、5%CO2、飽和濕度，細胞長至約70%時即可進行細胞傳代。

2.2 提取物制備 準確稱取500 g金花茶葉，粉碎后過40目篩。先后以10、8倍量75%乙醇回流提取各1次(時間分別為2、1.5 h)，合并提取液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀與水浴鍋除去醇味，所得膏狀物用冷凍干燥儀干燥成為固態(tài)干粉，稱取干粉質(zhì)量后折算為生藥量，最終每1 g固態(tài)干粉狀提取物相當于生藥13.53 g，密閉置于干燥容器內(nèi)，在-40 ℃下冷凍保存，臨用時以蒸餾水稀釋后使用。

2.3 提取物含藥血清、空白對照血清制備 10只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機分為空白對照組3只，每天灌胃給予蒸餾水2 mL，連續(xù)7 d；給藥組7只，每天灌胃給予金花茶葉提取物(生藥量0.8 g/kg)，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，下腔動脈穿刺采血，分離血清，56 ℃滅活30 min，分裝后在-40 ℃下冷凍保存[6-8]。

2.4 提取物含藥血清、空白對照血清的細胞安全性實驗 取對數(shù)生長期HUVEC細胞，初始密度2×105/mL，分別設(shè)置添加10% FBS的正常組和添加5%、10%、15%、20%金花茶葉含藥血清或空白血清的給藥組。細胞培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度，以正常組為100%細胞增殖活性，計算給藥組細胞增殖活性。

2.5 提取物含藥血清干預(yù)ox-LDL誘導的HUVEC趨化單核細胞 取對數(shù)生長期HUVEC與THP-1單核細胞，設(shè)置正常組、模型組、空白血清組、金花茶葉含藥血清組，給藥組根據(jù)細胞安全性實驗結(jié)果選擇適宜濃度，并對HUVEC細胞進行24 h孵育預(yù)處理，而正常組和模型組不作預(yù)處理。預(yù)處理結(jié)束后，加入100 μg/mL ox-LDL孵育24 h，更換新鮮培養(yǎng)液，取細胞共培養(yǎng)板，上層接種THP-1單核細胞，下層接種HUVEC細胞，共同培養(yǎng)24 h，分別收獲上下層所有細胞，用于流式細胞術(shù)分析或總蛋白提取[9]。

2.6 提取物減輕動脈粥樣硬化的體內(nèi)活性實驗 采用高脂飼料飼喂ApoE基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠以復制動脈粥樣硬化小鼠模型，8只C57BL/6JGpt雄性小鼠作為正常組，飼喂小鼠正常飼料；24只ApoE-/-雄性小鼠分為模型組、辛伐他汀組、金花茶葉提取物組，每組8只，給予高脂飼料(含21%脂肪和0.15%膽固醇)喂養(yǎng)8周。從第9周開始，在原有飼喂方式的基礎(chǔ)上，正常組、模型組小鼠每天灌胃給予蒸餾水2 mL，辛伐他汀組小鼠每天灌胃給予藥物10 mg/kg，金花茶葉提取物組每天灌胃給予提取物5 g/kg，連續(xù)8周。第16周末，各組小鼠脫頸椎處死，迅速剖胸切取主動脈弓，一部分主動脈弓縱向剖開并仔細分離動脈內(nèi)膜，將內(nèi)膜置于-80 ℃下冷凍保存，另一部分主動脈弓于10%中性甲醛固定[10-11]。

2.7 流式細胞術(shù)檢測HUVEC+單核細胞共培養(yǎng)體系中的單核細胞數(shù)目占比 收集處理完畢的細胞，以膠原酶細胞解離液室溫處理10 min使其解離為單個細胞，Image-it Fix-Perm kit進行細胞固定處理，加入1∶1 000稀釋的小鼠抗人CD14-Alexa Fluor 488單抗，在4 ℃下避光孵育120 min，4 ℃預(yù)冷的PBS輕柔洗滌3次，進行流式細胞術(shù)分析。

2.8 免疫印跡法檢測ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin蛋白表達 收集處理完畢的細胞與主動脈弓內(nèi)膜組織(盡量剪碎)，裂解液4 ℃裂解處理30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清并進行蛋白定量，上樣量為20 μg，恒壓100 V條件下電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，封閉，ICAM-1(1∶1 200)、VCAM-1(1∶1 000)、MCP-1(1∶1 000)、P-selectin(1∶1 200)、GAPDH(1∶1 300)一抗4 ℃孵育過夜，次日二抗(1∶2 000)室溫孵育60 min，超敏化學發(fā)光液孵育3 min，即以ChemiDoc成像系統(tǒng)成像。

2.9 小鼠主動脈弓組織動脈粥樣硬化斑塊觀察 取10%中性甲醛固定的小鼠主動脈弓，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟至水，HE染色，中性樹膠封片，在光鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 HUVEC、THP-1細胞形態(tài)觀察 HUVEC細胞每4～5 d以1∶3比例傳代1次，細胞貼壁生長，顯微鏡下可見細胞呈長梭形，部分呈不規(guī)則多邊形；THP-1細胞每3～4天以1∶3比例傳代1次，細胞懸浮生長，顯微鏡下細胞呈圓形，有聚集生長的趨勢，見圖1。

3.2 細胞安全性實驗 與正常組(10%胎牛血清)比較，5%、10%金花茶葉含藥血清或空白血清組HUVEC細胞增殖活性無明顯變化(P>0.05)，而15%、20%金花茶葉含藥血清或空白血清組細胞增殖活性降低(P<0.05，P<0.01)，見圖2。因此，選擇10%作為后續(xù)血清藥理實驗的適宜濃度。

3.3 金花茶葉提取物含藥血清抑制HUVEC趨化單核細胞 正常組單核細胞比例為(1.14±0.26)%，與正常組比較，模型組HUVEC的趨化單核細胞數(shù)增加(P<0.01)，為(12.77±0.15)%；與模型組比較，金花茶葉含藥血清組、空白血清組可見HUVEC趨化單核細胞數(shù)呈現(xiàn)差異化的變化趨勢，其中前者減少(P<0.01)，為(2.67±0.36)%，后者無明顯變化(P>0.05)，為(12.87±0.06)%，見圖3A～3B。金花茶葉提取物含藥血清了抑制ox-LDL誘導的HUVEC細胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin蛋白過表達，見圖3C～3D。

3.4 金花茶葉提取物抑制動脈粥樣硬化小鼠的粥樣斑塊形成 正常組未見粥樣斑塊形成，內(nèi)膜表面光滑，各層次結(jié)構(gòu)完整，細胞與組織結(jié)構(gòu)正常，主動脈管腔無縮窄；模型組可見較大的向管腔內(nèi)明顯突出的粥樣硬化斑塊形成，主動脈管腔有不同程度縮窄，內(nèi)膜表面欠光滑，粥樣斑塊內(nèi)可見典型泡沫細胞，有明顯炎細胞浸潤，粥樣斑塊與內(nèi)膜下肌層分界不清，部分肌纖維斷裂；辛伐他汀組主動脈弓內(nèi)膜鏡下所見接近正常組，僅有輕微炎細胞浸潤，未見粥樣斑塊形成；金花茶葉提取物組可見較小的向管腔內(nèi)輕微突出的粥樣斑塊形成，主動脈管腔內(nèi)膜表面尚光滑，各層次結(jié)構(gòu)基本完整，粥樣斑塊內(nèi)泡沫細胞較少，炎細胞輕度浸潤，粥樣斑塊與內(nèi)膜下肌層分界不清但未見肌纖維斷裂，見圖4A。金花茶葉提取物抑制動脈粥樣硬化小鼠的動脈內(nèi)膜ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin蛋白過表達，見圖4B～4C。

4 討論

以中醫(yī)學的脾胃學說解析動脈粥樣硬化的慢性低度血管內(nèi)皮炎癥，應(yīng)為元氣虛衰基礎(chǔ)上發(fā)生的“內(nèi)熱”[12]，但動脈粥樣硬化患者的內(nèi)熱異于尋常所見的陽火。苦寒之品傷脾胃陽氣，瀉下之品亦可加重元氣虧虛，動脈粥樣硬化的陰火內(nèi)熱之證不適用苦寒瀉火的治則，而金花茶葉清熱解毒，可用于解除陰火內(nèi)熱，以其性平，可避免苦寒耗損脾胃陽氣的弊端，適用于動脈粥樣硬化早期防治的中醫(yī)藥干預(yù)。

研究表明，動脈粥樣硬化局部的內(nèi)皮源性一氧化氮(nitic oxide, NO)、前列腺素、血小板源性生長因子、ox-LDL、血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素的生理平衡被破壞，內(nèi)皮細胞異常高表達P-selectin、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等粘附分子，促進單核細胞在局部內(nèi)皮的粘附，遷移至內(nèi)皮下并進而分化為成熟的巨噬細胞，加重局部炎癥損傷，增加LDL的局部沉積及氧化修飾，構(gòu)成ox-LDL與炎癥反應(yīng)的自加強循環(huán)[13]。因此，動脈粥樣硬化是一種與糖脂代謝異常、脂質(zhì)氧化修飾密切相關(guān)的慢性低度血管內(nèi)皮炎癥[14-15]。金花茶葉兼具改善糖脂代謝異常、減輕血管內(nèi)皮炎癥、抑制脂質(zhì)氧化修飾等多種藥理活性，可有效遏制動脈粥樣硬化進程的啟動與進展，在早期防治領(lǐng)域具有潛在積極意義[16]。

本研究以ox-LDL刺激HUVEC細胞成功誘導過表達ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin，類似改變也出現(xiàn)在高脂飲食飼喂的ApoE-/-雄性小鼠的主動脈弓內(nèi)膜組織，提示ox-LDL確為血管內(nèi)皮過表達粘附與趨化分子的重要危險因素[17]。有研究證實，金花茶葉/金花茶葉提取物有降低LDL作用，并且具有較高的安全劑量范圍，然而其作用強度顯然不及他汀類藥物，也沒有直接比較兩者調(diào)節(jié)ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、P-selectin在血管內(nèi)皮表達的研究報道[18]。體外實驗的藥效考察體系僅能檢測內(nèi)皮細胞與含藥血清的直接相互作用，缺乏與之相關(guān)的其他細胞、組織的調(diào)控作用的參與，導致金花茶葉提取物的體內(nèi)藥效明顯優(yōu)于體外藥效，該現(xiàn)象也是許多天然藥物體內(nèi)外藥效差異的常見原因[19]。然而，模式動物在金花茶葉提取物干預(yù)的情況下仍然出現(xiàn)了輕度的動脈粥樣斑塊病變，表明單獨使用金花茶葉或其提取物可能不足以充分阻止動脈粥樣硬化粥樣斑塊形成，但其顯著的安全性使其極為適合用于廣泛人群的動脈粥樣硬化日常預(yù)防。對于不能耐受他汀類藥物的人群，金花茶葉或其提取物則具有更為顯著的應(yīng)用價值。

獲取人體早期動脈粥樣硬化的病理標本是非常困難的，因而對其各階段的研究需不斷深化[20-21]。動脈粥樣硬化研究使用的動物與人類存在諸多差異，本研究使用的高脂飼料飼喂ApoE-/-雄性小鼠動脈粥樣硬化模型亦難以避免，故今后仍應(yīng)進行臨床研究[22]。