沈慶國， 屈玲霞*， 于祥玉， 孫 艷， 趙雪君， 韓學(xué)順， 滕延飛 ，關(guān)永霞*

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006)

干姜系姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖，主產(chǎn)于四川、貴州等地[1]，其味辛，性熱，歸脾、胃、腎、心、肺經(jīng)，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的效[2]，為中醫(yī)臨床常用的溫里藥，主要成分為揮發(fā)油。

在中藥制劑制備過程中，很多工藝要求揮發(fā)油直接噴灑在顆粒上，導(dǎo)致該成分易氧化揮散，并具有刺激性氣味，從而影響制劑穩(wěn)定性、患者依從性、臨床療效[3-4]。將干姜揮發(fā)油與β-環(huán)糊精制成包合物后，可明顯提高前者穩(wěn)定性，使其生物利用度得到改善，并且相關(guān)工藝優(yōu)化均采用正交試驗[5-8]，但它采用線性數(shù)學(xué)模型進行擬合，無法精確找到最佳點。Box-Behnken響應(yīng)面法可充分考慮各因素之間的交互作用，提高實驗準確性和預(yù)測指導(dǎo)性[9]，故本實驗采用該方法對干姜揮發(fā)油膠體磨包合工藝進行優(yōu)化，以期為該成分后續(xù)開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 JJ-1型增力電動攪拌器(江蘇杰瑞爾電器有限公司)；RK-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司)；JM-50M型膠體磨(溫州市膠體磨廠)；GZX-9240 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)設(shè)備廠)；TCS-30電子天平[梅特勒-托利多(常州)測量技術(shù)有限公司]；ALPHA型紅外掃描儀(德國布魯克公司)；芳香油提取罐(溫州市金榜輕工機械有限公司)。

1.2 試劑與藥物 干姜片(臨沂柯屹藥業(yè)有限公司，批號201110)，經(jīng)魯南制藥集團中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室范建偉高級工程師鑒定為正品。β-環(huán)糊精 (孟川市華興生物化工有限公司，批號20200209)。無水乙醇(南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號201208762k)；水為蒸餾水(實驗室自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油制備 采用水蒸氣蒸餾法，稱取干姜飲片130.0 kg，投入芳香油提取罐中，加入8倍量水，開啟加熱，待提取罐內(nèi)沸騰后調(diào)節(jié)蒸汽閥，提取揮發(fā)油5 h至油量不再增加后停止加熱，讀取揮發(fā)油量(360 mL)，開啟收集器活塞收集，加入等體積無水乙醇制成溶液，置于冷庫中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 包合物制備

2.2.1 飽和溶液法 精密稱取48.0 g β-環(huán)糊精，加入盛有1 375 mL蒸餾水的燒杯中，置于40 ℃水浴鍋中攪拌溶解，溶解后保持40 ℃恒溫。精密量取“2.1”項下?lián)]發(fā)油乙醇溶液12 mL，置于分液漏斗中，調(diào)節(jié)活塞，逐滴加入，邊加邊攪拌，待油全部滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌2 h，放入冷庫中冷沉24 h以上，取出，真空抽濾，無水乙醇洗滌包合物3次，每次約30 mL，在40 ℃下烘干，即得。

2.2.2 超聲法 精密稱取48.0 g β-環(huán)糊精，加入盛有1 375 mL蒸餾水的燒杯中，置于40 ℃水浴鍋中攪拌溶解。精密量取“2.1”項下?lián)]發(fā)油乙醇溶液12 mL，置于分液漏斗中，調(diào)節(jié)活塞，逐滴加入，邊加邊攪拌，待油全部滴加結(jié)束后在40 ℃下超聲包合2 h，放入冷庫中冷沉24 h以上，取出，真空抽濾，無水乙醇洗滌包合物3次，每次約30 mL，在40 ℃下烘干，即得。

2.2.3 膠體磨法 精密稱取48.0 g β-環(huán)糊精，加入240 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，制成?環(huán)糊精混懸液，導(dǎo)入膠體磨中，待形成研磨循環(huán)后緩慢滴加“2.1”項下乙醇溶液12 mL，研磨20 min，放入冷庫中冷沉24 h以上，取出，真空抽濾，無水乙醇洗滌3次，每次約30 mL，在40 ℃下烘干，即得。

2.3 評價指標(biāo)測定

2.3.1 空白回收率 按照2020年版《中國藥典》四部項下?lián)]發(fā)油含量測定法(通則2204)甲法[10]，精密量取2.0 mL“2.1”項下?lián)]發(fā)油乙醇溶液，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入500 mL蒸餾水、沸石若干，連接配套的發(fā)油測定器，置于電熱套中，開啟開關(guān)加熱煮沸，保持沸騰5 h，待油量不再增加時停止加熱，讀取收油量，平行3次，計算收率，取平均值。結(jié)果，揮發(fā)油空白回收率為80.33%。

2.3.2 包封率、收率 精密稱取“2.2”項下3種方法所得包合物總質(zhì)量的1/6，量取500 mL蒸餾水加入圓底燒瓶中，再加入沸石若干，連接配套的揮發(fā)油測定器，置于電熱套開啟開關(guān)加熱煮沸，保持微沸狀態(tài)，待提取至測定器中油量不再增加后停止加熱，讀取揮發(fā)油量，換算為揮發(fā)油總體積，平行3次，取平均值，計算包封率、包合物收率，公式分別為包封率=[包合物中實際含油量/(揮發(fā)油投入量×空白回收率)]×100%、收率=[包合物質(zhì)量/(β-環(huán)糊精投入量+揮發(fā)油投入量)]×100%。結(jié)果，飽和水溶液法、超聲法、膠體磨法所得揮發(fā)油的包封率分別為50.00%、37.50%、65.00%，收率分別為42.23%、28.15%、76.01%，可知膠體磨法上述指標(biāo)最高，故選擇該方法包合揮發(fā)油。

2.4 單因素試驗

2.4.1 β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例 固定水與β-環(huán)糊精比例10∶1，研磨時間20 min，分別考察β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例4∶1、6∶1、8∶1、10∶1對包合工藝的影響，結(jié)果見表1。由此可知，β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例為4∶1～8∶1時包封率、收率均升高，為10∶1時兩者略微降低，故選擇6∶1～10∶1進行后續(xù)優(yōu)化。

表1 β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例對包合工藝的影響

2.4.2 水與β-環(huán)糊精比例 固定β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例6∶1，研磨時間20 min，分別考察水與β-環(huán)糊精比例5∶1、10∶1、15∶1、20∶1對包合工藝的影響，結(jié)果見表2。由此可知，水與β-環(huán)糊精比例為5∶1～15∶1時包封率、收率均升高，為20∶1時兩者有所降低，故選擇10∶1～20∶1進行后續(xù)優(yōu)化。

表2 水與β-環(huán)糊精比例對包合工藝的影響

2.4.3 研磨時間 固定β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例為6∶1，水與β-環(huán)糊精比例為10∶1，分別考察研磨時間10、20、30、40 min對包合工藝的影響，結(jié)果見表3。由此可知，研磨時間為10～30 min時包封率、收率均升高，為40 min時兩者略微降低，故選擇20～40 min進行后續(xù)優(yōu)化。

表3 研磨時間對包合工藝的影響

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例(A)、水與β-環(huán)糊精比例(B)、研磨時間(C)為影響因素，包封率(R1)、收率(R2)及綜合評分(R綜)為評價指標(biāo)，設(shè)計17個試驗點。由于包封率越高，包合物包合效果越好，故將其權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.7；收率在制備工藝中也有不可忽視的意義，當(dāng)β-環(huán)糊精與揮發(fā)油投入量一定時，收率越高，包合物包合效果越好，故將其權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.3[11]，R綜=(揮發(fā)油包封率/最大值×0.7+包合物收率/最大值×0.3)×100[12]，結(jié)果見表4。

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表4數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得方程為R綜=-217.54+42.73A+6.31B+5.21C-0.17AB-0.16AC-0.04BC-2.05A2-0.10B2-0.05C2，方差分析見表5。由此可知，因素A、B、A2、C2均有極顯著影響(P<0.01)，C、B2、AC有顯著影響(P<0.05)，AB、BC無顯著影響(P>0.05)；失擬項P>0.05，R2=0.974 9，表明方程擬合度良好，誤差小，可用于分析預(yù)測；模型P<0.01，具有高度顯著性；各因素影響程度依次為A>B>C。

表4 試驗設(shè)計與結(jié)果

表5 方差分析

響應(yīng)面分析見圖1。由此可知，當(dāng)水與β-環(huán)糊精比例一定時，隨著β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例增加R綜逐漸升高，超過8∶1時開始降低；當(dāng)β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例一定時，隨著水與β-環(huán)糊精比例增加R綜逐漸升高，超過17∶1時變化不明顯；當(dāng)研磨時間一定時，隨著β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例增加R綜逐漸升高，超過8∶1時略微降低；當(dāng)β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例一定時，隨著研磨時間延長R綜逐漸升高，超過30 min時開始降低；當(dāng)研磨時間一定時，隨著水與β-環(huán)糊精比例增加R綜逐漸升高，超過17∶1時變化不明顯；當(dāng)水與β-環(huán)糊精比例一定時，隨著研磨時間延長R綜逐漸升高，超過30 min時開始降低；因素A曲面較陡峭，表明對響應(yīng)值影響顯著，其次是B、C；β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例、研磨時間交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，得到最優(yōu)膠體磨包合工藝為β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例8.52∶1，水與β-環(huán)糊精比例17.59∶1，研磨時間30.38 min，結(jié)合實際情況，將其修正為β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例8∶1，水與β-環(huán)糊精比例17∶1，研磨時間30 min。按上述優(yōu)化工藝進行3批驗證試驗，測得平均包封率、收率分別為90.12%、95.48%，與預(yù)測值接近(相對誤差分別為0.94%、0.86%)，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.6 包合物鑒別 采用衰減全反射法(ATR)，將揮發(fā)油、β-環(huán)糊精、包合物在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行紅外掃描，結(jié)果見圖2。由此可知，揮發(fā)油在1 376.12、1 464.06 cm-1處出現(xiàn)尖峰，而包合物中未發(fā)現(xiàn)這2個峰，表明形成了新物質(zhì)；β-環(huán)糊精在3 302.97 cm-1處有寬峰，而包合物中該峰移至3 313.85 cm-1，并且峰形變窄，表明揮發(fā)油與β-環(huán)糊精之間發(fā)生相互作用，包合物制備成功。

3 討論與結(jié)論

Box-Behnken響應(yīng)面法是響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法中的一種，適合于用非線性模型擬合[12-14]，與正交試驗比較，它能在中心點進行重復(fù)性實驗，從而提高試驗精確度，更好體現(xiàn)各因素與效應(yīng)值之間的關(guān)系[15]。本實驗比較了膠體磨法、飽和水溶液法、超聲法包合干姜揮發(fā)油的效果，發(fā)現(xiàn)膠體磨研磨包合法無需加熱，包合時間短，包合率高，既節(jié)省了時間，又降低了能源消耗，提高了揮發(fā)油利用率。

本實驗先采用單因素試驗確定了β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例、水與β-環(huán)糊精比例、研磨時間范圍，再通過Box-Behnken響應(yīng)面法研究三者對評價指標(biāo)的交互作用。結(jié)果，β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例對包合效果的影響程度最大，當(dāng)它在一定范圍內(nèi)時揮發(fā)油包封率和包合物收率逐漸升高，但超過范圍后開始下降，這是因為單位體積的揮發(fā)油分子數(shù)量是一定的，β-環(huán)糊精數(shù)量過少時揮發(fā)油未能完全被包合，導(dǎo)致包封率較低，而其數(shù)量過多時除了包合作用外，還會吸附部分揮發(fā)油，并且該成分易散失，乙醇洗滌也會除去，導(dǎo)致其包封率降低；水與β-環(huán)糊精比例的影響程度次之，當(dāng)它在一定范圍內(nèi)時揮發(fā)油包封率和包合物收率逐漸升高，但超過范圍后開始下降，這是因為用水量過少時研磨后包合物黏稠，流動性較差。

綜上所述，最優(yōu)干姜揮發(fā)油膠體磨包合工藝為β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例8∶1，水與β-環(huán)糊精比例17∶1、研磨時間30 min，再通過紅外光譜法鑒別，驗證該工藝穩(wěn)定可行，并且可節(jié)約時間，降低成本，適合大規(guī)模生產(chǎn)。