曾 立， 向 榮， 張運(yùn)良， 傅春燕， 李庚喜， 李成艦

(1.邵陽學(xué)院，湘西南中藥開發(fā)利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽 422000；2.邵陽學(xué)院圖書館，湖南 邵陽 422000)

隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國糖尿病患者數(shù)已達(dá)1.14億，糖尿病逐漸成為亟待解決的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題[1-2]。糖尿病顯著特征之一是空腹血糖值高于6.1 mmol/L或餐后2 h血糖值高于7.8 mmol/L，同時(shí)伴隨飲水增多、排尿增多、進(jìn)食增多且體重消瘦的“三高一低”特征[3-5]?，F(xiàn)有的雙胍類、格列奈類等六大類降血糖藥物雖已在臨床實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了較好的降糖效果，但依然出現(xiàn)了諸如增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、胃腸道毒性等不良副反應(yīng)[6]。因此，開發(fā)天然低毒性且具有良好抵御血糖升高的中藥對(duì)于防治糖尿病具有重要意義。已有研究表明，羅漢果苷可降低空腹血糖水平，同時(shí)改善血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，其降糖機(jī)制可能與恢復(fù)血脂水平有關(guān)[7]。黃芪甲苷提高了超氧化物歧化酶(SOD)的活性，同時(shí)抑制脂質(zhì)氧化增加谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，從而發(fā)揮降血糖作用[8]。人參皂苷可能通過上調(diào)肝臟GSY等蛋白表達(dá)促進(jìn)糖原合成，維持機(jī)體葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)[9]。

黃精是常用的藥食同源中藥，具有多種生物活性物質(zhì)，而黃精多糖是其主要活性成分之一?，F(xiàn)有研究探討了黃精多糖提取物的降血糖效果[10-11]，但缺乏其對(duì)糖尿病動(dòng)物模型肝組織糖代謝的影響。本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型，探究黃精多糖的降血糖效果及機(jī)制，為黃精多糖的深加工利用以及藥食同源中藥的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，共70只，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2020-0002，所有小鼠均按照邵陽學(xué)院學(xué)術(shù)委員會(huì)嚙齒類動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行處理。

1.2 試劑與藥物 黃精多糖(純度86.4%，批號(hào)J001982)購于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司。鹽酸二甲雙胍片、STZ(批號(hào)AAW1402、S0130)購于美國Sigma公司；TC、TG、SOD、GSH-Px、MDA和肝糖原(HG)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；E.Z.N.A Total RNA Kit試劑盒(批號(hào)R6688-01)購于美國Omega公司；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒、SYBR Green試劑盒(批號(hào)KR118、FP209)購于天根生化科技(北京)有限公司；β-actin、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2抗體(GLUT2)、糖原合成酶激酶3β抗體(GSK-3β)；磷酸化糖原合成酶激酶3β 多抗體(p-GSK-3β)、磷脂酰肌醇1,2,3,4,5,-五磷酸抗體(PIP5K)、蛋白激酶B抗體(Akt)、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔抗體(批號(hào)66009-1-Ig、66846-1-Ig、22104-1-AP、14850-1-AP、55028-1-AP、16754-1-AP、22371-1-AP、SA00001-1、SA00001-2)均購于美國Proteintech公司。

1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀、熒光定量RCP儀和高速勻漿機(jī)(美國Thermo公司)；5810型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Eppndorf公司)；電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海醫(yī)用分析儀器廠)；UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；QuantStudio6型RCP儀(美國Lifetech公司)；電泳槽(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，禁食16 h后測量空腹血糖值和體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量連續(xù)5 d腹腔注射50 mg/kg STZ溶液，每天1次，最后1次注射STZ后，禁食16 h并再次測定血糖值。同時(shí)，記錄造模期間小鼠的血糖值、飲水量、進(jìn)食量和體質(zhì)量。

1.5 分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為6組，即正常組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、二甲雙胍組(250 mg/kg)及黃精多糖高、中、低劑量組(400、200、100 mg/kg)，除正常組外，其余各組均按“1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行造模，各組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，給藥容量為10 mL/kg，連續(xù)28 d，每7 d測定1次各組小鼠體質(zhì)量和血糖值。第29 天，所有小鼠麻醉處死后摘眼球取血，并收集肝臟組織。

1.6 血清脂質(zhì)水平、肝組織HG、MDA水平及SOD、GSH-Px活性檢測 全血于4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取血清；肝組織勻漿后離心取上清，按試劑盒說明書檢測血清TC、TG、INS水平，肝組織中HG、MDA水平及SOD、GSH-Px活性。

1.7 RT-qPCR法檢測Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY、GSK-3βmRNA表達(dá) 按照Omega試劑盒說明書提取肝臟組織總RNA，按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒說明書將提取所得RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(反應(yīng)條件為42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min)，分裝后于-20 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以cDNA為模板，使用委托北京擎科科技有限公司合成的引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，觀察并分析熔解曲線。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.8 Western blot法檢測Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY、GSK-3β蛋白表達(dá) 提取小鼠肝組織總蛋白，參考朱琪等[12]方法進(jìn)行Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠模型的建立 觀察發(fā)現(xiàn)，模型組飼養(yǎng)箱內(nèi)墊料潮濕，是排尿增多的表現(xiàn)。如圖1所示，與正常組比較，模型組小鼠空腹血糖值升高(P<0.01)，出現(xiàn)進(jìn)食、飲水量增多(P<0.01)，但體質(zhì)量卻減輕(P<0.05)的生理反應(yīng)，表明造模成功。

2.2 黃精多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響 由表2可知，與正常組比較，模型組小鼠血糖水平升高(P<0.01)；與模型組比較，黃精多糖各劑量組第7～28 天血糖水平均降低(P<0.05，P<0.01)，其中黃精多糖高劑量組效果較優(yōu)。

表2 黃精多糖對(duì)小鼠血糖的影響

2.3 黃精多糖對(duì)糖尿病小鼠血清TC、TG、INS及肝組織HG水平的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TC、TG水平均升高(P<0.01)，血清INS和肝組織HG水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，黃精多糖各劑量組小鼠血清TC、TG水平均降低(P<0.05，P<0.01)，血清INS和肝組織HG水平均升高(P<0.05，P<0.01)，其中黃精多糖高劑量組效果較優(yōu)。

2.4 黃精多糖對(duì)糖尿病小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，黃精多糖各劑量組小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05，P<0.01)，MDA水平降低(P<0.05，P<0.01)，說明黃精多糖可能通過緩解氧化應(yīng)激以及因氧化應(yīng)激造成的糖代謝異常，調(diào)節(jié)葡萄糖的氧化分解，達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的作用。

2.5 黃精多糖對(duì)糖尿病小鼠肝組織中參與糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 由圖4可知，與正常組比較，模型組小鼠肝組織Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表達(dá)均降低(P<0.01)，GSK-3βmRNA表達(dá)升高(P<0.01)，說明糖尿病小鼠胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，葡萄糖利用率和轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低，葡萄糖合成糖原的能力減弱；與模型組比較，黃精多糖中、高劑量組均能上調(diào)Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，下調(diào)GSK-3βmRNA表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)，說明黃精多糖可能通過上調(diào)PI3K提高胰島素與IRS1結(jié)合能力并激活A(yù)kt，改善機(jī)體胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，且對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力和糖原合成能力均有改善作用。

2.6 黃精多糖對(duì)糖尿病小鼠肝組織中參與糖代謝關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 如圖5所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織中Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)，GSK-3β蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，黃精多糖各劑量組均能上調(diào)Akt、PI3K、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSY蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，下調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，說明黃精多糖提高胰島素與胰島素受體結(jié)合能力的同時(shí)，促進(jìn)糖原合成和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，改善機(jī)體血糖水平。

3 討論

糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已被證實(shí)的病因包括有胰島素分泌不足以及胰島素缺陷作用等，從而誘發(fā)肝臟胰島素抵抗、肝糖原合成降低[13-15]?，F(xiàn)代西藥包括促胰島素分泌劑類、胰島素增敏劑、磺脲類藥物、雙胍類等均被應(yīng)用于治療糖尿病。臨床實(shí)驗(yàn)已證明這些藥具有顯著的降血糖效果，但存在增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、肝腎功能減退、過敏反應(yīng)、胃腸道毒性等一系列不良反應(yīng)或并發(fā)癥[6]，如何有效防治糖尿病并且降低糖尿病并發(fā)癥,從而減輕患者的痛苦，已成為全世界關(guān)注重點(diǎn)[16]。部分中藥具有降血糖的作用，在降低患者血糖水平的同時(shí)，還可防治糖尿病的并發(fā)癥，在現(xiàn)有的中藥資源基礎(chǔ)上，開發(fā)更高效、更安全、更廉價(jià)的防治糖尿病的中藥活性成分成為熱點(diǎn)[17-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量黃精多糖均能起到降血糖的效果。高TC、TG水平是糖尿病患者特點(diǎn)之一，同時(shí)也能提示心血管疾病的發(fā)生[20]。各劑量黃精多糖均能改善糖尿病模型小鼠血清TC、TG水平，同時(shí)，還能改善血糖，血清中INS，肝臟中SOD、GSH-Px活性和MDA、HG水平，說明黃精多糖可在一定程度上通過改善糖脂代謝和緩解氧化應(yīng)激等途徑調(diào)節(jié)糖脂代謝、降低血糖。肝臟是葡萄糖代謝和調(diào)節(jié)血糖濃度的主要器官之一，通過磷酸戊糖途徑、糖異生途徑等維持機(jī)體內(nèi)血糖濃度穩(wěn)定[21]。胰島素在維持血糖平衡的過程中具有關(guān)鍵性作用，其中Akt/PI3K信號(hào)通路被認(rèn)為是胰島素發(fā)揮調(diào)控血糖作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，許多研究表明，通過干預(yù)PI3K-Akt等通路可達(dá)到降血糖作用[22-23]。本研究結(jié)果顯示，黃精多糖能上調(diào)PI3K、Akt、IRS1、PDK1、GLUT2、PIP5K、GSYmRNA表達(dá)，說明黃精多糖能通過激活I(lǐng)RS1-PI3K-PDK1-Akt信號(hào)通路，提高胰島素分泌并促進(jìn)胰島素與胰島素受體相結(jié)合，提高機(jī)體消耗葡萄糖的能力[24-25]。而文獻(xiàn)研究表明，肝臟內(nèi)Akt和GSK-3β磷酸化后可激活GSY，促進(jìn)糖原合成[26-28]。本研究證明，黃精多糖通過激活PI3K-Akt-GSK-3β-GSY信號(hào)通路促進(jìn)肝臟內(nèi)消耗葡萄糖合成糖原。此外，活化的Akt也能作用于PIP5K和GLUT2，調(diào)控機(jī)體對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收[29-30]。黃精多糖通過激活PI3K-Akt-PIP5K-GLUT2促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高葡萄糖的利用和轉(zhuǎn)化，增加外周組織對(duì)葡萄糖的利用。

綜上所述，黃精多糖能通過降低肝臟中SOD、GSH-Px活性和MDA水平緩解機(jī)體氧化應(yīng)激造成的糖代謝紊亂，能通過激活肝臟中IRS1-PI3K-PDK1-Akt、PI3K-Akt-GSK-3β-GYS、PI3K-Akt-PIP5K-GLUT2信號(hào)通路改善機(jī)體血糖水平，具有預(yù)防糖尿病的作用。