鄧 明， 鄧 芳， 陳志堅(jiān)， 周福生

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東 廣州 510405)

胃癌的發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因，減弱細(xì)胞遷移和侵襲對腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有抑制作用，能夠改善患者預(yù)后[2]。近年來，中草藥或其活性成分具有作用靶點(diǎn)多、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，其抗腫瘤作用也備受關(guān)注。連翹苷是中藥連翹的主要活性成分之一，具有抗氧化[3]、抗炎[4]、抗衰老[5]等功效。研究顯示，連翹苷可通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路降低腎癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[6]。但目前，連翹苷對胃癌細(xì)胞機(jī)制研究還未知。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的RNA，可作為腫瘤治療和診斷的靶點(diǎn)[7-9]。外泌體復(fù)合物7(EXOC7)是一種lncRNA，其在胃癌患者的血清和癌組織中表達(dá)升高，且其高表達(dá)與胃癌臨床分期、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，可能成為胃癌早期診斷及病情判斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)[10]。因此，本研究主要探討連翹苷可能通過調(diào)控EXOC7對胃癌細(xì)胞AGS增殖、遷移和侵襲的影響，以期為其研究與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

胃癌細(xì)胞AGS購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。連翹苷(純度≥98%，批號20180619)，購自南京廣潤生物制品有限公司。胎牛血清(FBS，批號20181225)，購自浙江天杭生物科技有限公司；TRIzol試劑(批號55362985)、LipofectamineTM2000試劑盒(批號1464348)，購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號20180915)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8，批號20181123)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號20181028)，購自北京索萊寶科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號AK4856)、PCR試劑盒(批號AK15028)，購自日本TaKaRa公司；PCR引物、si-EXOC7、si-NC、pcDNA-EXOC7、pcDNA，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗人Ki67(批號45585995)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2，批號15265585)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9，批號25465855)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(批號36542115)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 AGS細(xì)胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。AGS細(xì)胞接種于6孔板，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作，分別轉(zhuǎn)染si-EXOC7、si-NC、pcDNA-EXOC7、pcDNA。

2.2 細(xì)胞分組 參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道，將未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為對照組，5、10、20 μmol/L連翹苷組。對照組細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；5、10、20 μmol/L連翹苷組細(xì)胞分別用含5、10、20 μmol/L連翹苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染si-EXOC7、si-NC正常培養(yǎng)24 h，記為si-EXOC7組、si-NC組。轉(zhuǎn)染pcDNA-EXOC7、pcDNA用含20 μmol/L連翹苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為20 μmol/L連翹苷+pcDNA-EXOC7組、20 μmol/L連翹苷+pcDNA組。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞細(xì)胞接種于96孔板，按“2.2”項(xiàng)下分組處理，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測光密度(OD)值。以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活力。

2.4 Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲 取100 μL細(xì)胞懸液均勻鋪于Transwell小室上室，下室加入500 μL培養(yǎng)基。按“2.2”項(xiàng)下分組處理，培養(yǎng)24 h后多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，在顯微鏡200倍視野下觀察并拍照，計(jì)數(shù)并評價(jià)細(xì)胞遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)以Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell上室，自然晾干，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

2.5 Western blot法檢測細(xì)胞中Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) RIPA試劑提取各組細(xì)胞中總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，10% SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂奶中封閉1 h，加Ki67(1∶500)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 500)一抗，4 ℃孵育過夜，加辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG，37 ℃孵育1 h，通過化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行避光顯影，曝光拍照。Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)。

2.6 RT-qPCR檢測細(xì)胞中EXOC7 mRNA表達(dá) 采用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為EXOC7正向引物5′-GATACTTGACTCATYAGAC-3′，反向引物5′-ACTTCTAC TCTCATGATC-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物5′-GATCGTGGC CATCAATGACC-3′，反向引物5′-ACCTGCATCACCCCACTTAA-3′。采用2-ΔΔCT法計(jì)算EXOC7 mRNA相對表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 連翹苷對AGS細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，各濃度連翹苷組AGS細(xì)胞增殖活力和Ki67蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見圖1、表1。

表1 連翹苷對AGS細(xì)胞增殖活力和Ki67蛋白表達(dá)的影響

3.2 連翹苷對AGS細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與對照組比較，各濃度連翹苷組AGS細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)以及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見圖2、表2。

表2 連翹苷對AGS細(xì)胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

3.3 連翹苷對AGS細(xì)胞中EXOC7 mRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，各濃度連翹苷組AGS細(xì)胞中EXOC7 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表3。

表3 連翹苷對AGS細(xì)胞中EXOC7 mRNA表達(dá)的影響

3.4 抑制EXOC7表達(dá)對AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-EXOC7組AGS細(xì)胞中EXOC7 mRNA表達(dá)降低，增殖活力、遷移和侵襲數(shù)以及Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖3、表4～5。

表4 抑制EXOC7表達(dá)對AGS細(xì)胞增殖活力和Ki67蛋白表達(dá)的影響

3.5 過表達(dá)EXOC7對AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-EXOC7的細(xì)胞中EXOC7 mRNA表達(dá)分別為(1.01±0.05)、(1.87±0.13)，2組比較差異顯著(P<0.05)，表明pcDNA-EXOC7轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞中EXOC7 mRNA表達(dá)升高。與20 μmol/L連翹苷+pcDNA組比較，20 μmol/L連翹苷+pcDNA-EXOC7組AGS細(xì)胞增殖活力、遷移和侵襲數(shù)及Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖4、表6～7。

表5 抑制EXOC7表達(dá)對AGS細(xì)胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

表6 過表達(dá)EXOC7對AGS細(xì)胞增殖活力及Ki67蛋白表達(dá)的影響

表7 過表達(dá)EXOC7對AGS細(xì)胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

4 討論

連翹是我國傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等功效。連翹在我國的地理分布范圍廣，可廣泛種植，具有較好的開發(fā)價(jià)值。連翹苷作為連翹的主要活性成分之一，其藥理活性有待深入探究。研究顯示，連翹苷可通過降低VEGF、升高ET-1抑制肺癌細(xì)胞發(fā)展[11]。本研究采用不同濃度連翹苷干預(yù)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞AGS，探究連翹苷對AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及分子機(jī)制。

細(xì)胞增殖紊亂可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，抑制腫瘤細(xì)胞增殖可延緩腫瘤發(fā)展進(jìn)程[12]。Ki67蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期，可以反映細(xì)胞增殖[13]。本研究顯示，不同濃度連翹苷作用胃癌細(xì)胞AGS后，細(xì)胞增殖活力和Ki67蛋白表達(dá)降低，表明連翹苷可抑制AGS細(xì)胞增殖。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲可影響腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，MMP-2、MMP-9可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解以及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[14-15]。連翹苷可以降低AGS細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)，降低MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，表明連翹苷可以抑制AGS細(xì)胞遷移和侵襲。

lncRNA在真核生物體內(nèi)廣泛存在，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。作為一種lncRNA，EXOC7在宮頸鱗狀細(xì)胞癌[17]和肝細(xì)胞癌[18]中表達(dá)升高，可作為腫瘤的分子標(biāo)志物。本研究通過轉(zhuǎn)染EXOC7干擾RNA降低AGS細(xì)胞中EXOC7表達(dá)后，細(xì)胞增殖活力、遷移和侵襲數(shù)降低，Ki67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低，表明降低EXOC7可以抑制AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步研究顯示，過表達(dá)EXOC7逆轉(zhuǎn)了連翹苷對AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，提示連翹苷可能通過降低EXOC7表達(dá)發(fā)揮抗胃癌作用。

綜上所述，連翹苷可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制與降低EXOC7表達(dá)有關(guān)。