白慶云， 田錦鴻， 曹春蓉， 許斌衡， 胡 甜， 王春寶

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000)

疼痛是多種疾病的伴隨癥狀，是一直困擾人類健康的嚴(yán)重問(wèn)題[1]。如何有效緩解疼痛，減輕其對(duì)人們生理和心理引起的損害，是長(zhǎng)久以來(lái)備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)[2]。由于疼痛的發(fā)生機(jī)制頗為復(fù)雜，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，使用單個(gè)藥物往往難以達(dá)到理想的鎮(zhèn)痛效果，所以聯(lián)合用藥越來(lái)越多地被應(yīng)用于疼痛的治療[3]。通過(guò)將機(jī)制不同的2種或2種以上鎮(zhèn)痛藥物聯(lián)合使用，不但鎮(zhèn)痛效果可以相加或者協(xié)同增效，還能使藥物用量減少，毒副作用降低，從而獲得更好的治療效果[4-6]。

對(duì)乙酰氨基酚屬于非甾體類抗炎藥，是常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，用于緩解輕、中度疼痛，但其鎮(zhèn)痛作用不強(qiáng)，且具有明顯的消化系統(tǒng)不良反應(yīng)[7]，過(guò)量使用會(huì)引起嚴(yán)重的肝損傷甚至肝功能衰竭[8]。黃芩苷是黃芩中提取的黃酮類成分，具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)、解痙、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝等作用[9]。關(guān)于黃芩苷和對(duì)乙酰氨基酚聯(lián)合使用治療疼痛的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠醋酸扭體疼痛模型，采用扭體次數(shù)、等輻射分析法對(duì)黃芩苷和對(duì)乙酰氨基酚聯(lián)合應(yīng)用的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行分析，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雌性ICR小鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002，體質(zhì)量18～22 g，適應(yīng)環(huán)境3 d，室溫20～24 ℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂飼，自由飲水。

1.2 試劑與藥物 對(duì)乙酰氨基酚(純度≥99.0%，上海麥克林生化科技有限公司，貨號(hào)103-90-2)；黃芩苷(純度≥98%，上海英索生物科技中心，貨號(hào)B20570)。CMC-Na、醋酸(上海麥克林生化科技有限公司，貨號(hào)C804628、E801077)；PGE2試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，貨號(hào)F00512)；LTA4、NF-κB試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司，貨號(hào)CEA497Ge、SEB824 Mu)；TNF-α試劑盒(上海聯(lián)科生物科技有限公司，貨號(hào)EK282HS-48)。

1.3 儀器 M200型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；DHP-9082型恒溫孵育箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；QB-9001型微孔板振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 造模 0.6%醋酸溶液腹腔注射建立疼痛模型，劑量為10 mL/kg，記錄造模后20 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)(小鼠產(chǎn)生腹部?jī)?nèi)凹、軀體扭曲和后肢伸張等行為反應(yīng))，作為疼痛評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算疼痛抑制率，公式為疼痛抑制率=(對(duì)照組扭體次數(shù)-實(shí)驗(yàn)組扭體次數(shù))/對(duì)照組扭體次數(shù)×100%。

2.2 分組與給藥 將造模成功后的小鼠分為對(duì)照組(10只)、黃芩苷組(50只)、對(duì)乙酰氨基酚組(50只)、聯(lián)合用藥組(40只)。對(duì)照組小鼠灌胃給予生理鹽水和0.1% CMC-Na溶液；黃芩苷組小鼠分別灌胃給予15、22.5、33.8、50.6、75.9 mg/kg黃芩苷；對(duì)乙酰氨基酚組小鼠分別灌胃給予40、60、90、135、202.5 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚；聯(lián)合用藥組小鼠按黃芩和苷對(duì)乙酰氨基酚ED50劑量的50%、25%、12.5%、6.25%分別灌胃給藥，灌胃容量為10 mL/kg。給藥后30 min，按“2.1”項(xiàng)下方法造模，記錄扭體次數(shù)。

2.3 ELISA法檢測(cè)小鼠血清PGE2、LTA4、TNF-α、NF-κB和腦組織PGE2、LTA4水平 40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、黃芩苷組(39.67 mg/kg)、對(duì)乙酰氨基酚組(90.81 mg/kg)、聯(lián)合用藥組(19.84 mg/kg黃芩苷+45.41 mg/kg對(duì)乙酰氨基酚)，給藥后30 min，按“2.1”項(xiàng)下方法造模，10 min后取血和腦組織。血液冰上靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清備用；腦組織加入5倍量0.1 mol/L預(yù)冷PBS，用勻漿機(jī)研磨，將勻漿液12 000 r/min離心10 min，取上清備用。按ELISA試劑盒說(shuō)明書加入各反應(yīng)液，反應(yīng)完成后，于酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)值，計(jì)算小鼠血清PGE2、LTA4、TNF-α、NF-κB和腦組織PGE2、LTA4水平。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，對(duì)乙酰氨基酚各劑量組小鼠扭體次數(shù)減少(P<0.01)，且隨著劑量的增加，扭體次數(shù)減少，疼痛抑制率升高，見(jiàn)表1。對(duì)乙酰氨基酚的ED50為90.81 mg/kg，95%可信限為80.84～145.35 mg/kg。

表1 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響

3.2 黃芩苷對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，黃芩苷各劑量組小鼠扭體次數(shù)減少(P<0.01)，且隨著劑量的增加，扭體次數(shù)減少，疼痛抑制率升高，見(jiàn)表2。黃芩苷ED50為39.67 mg/kg，95%可信限為30.02～52.30 mg/kg。

表2 黃芩苷對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響

3.3 黃芩苷聯(lián)合對(duì)乙酰氨基酚對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，聯(lián)合用藥各劑量組小鼠扭體次數(shù)減少(P<0.01)，在1/2～1/16 ED50劑量范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，扭體次數(shù)減少，疼痛抑制率升高,見(jiàn)表3。兩藥聯(lián)用的ED50為黃芩苷10.65 mg/kg、對(duì)乙酰氨基酚29.18 mg/kg，95%可信限為9.90～12.40、27.01～33.85 mg/kg。

表3 黃芩苷聯(lián)合對(duì)乙酰氨基酚對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響

3.4 黃芩苷與對(duì)乙酰氨基酚的相互作用 等輻射分析法是一種準(zhǔn)確定量分析藥物之間相互作用的方法[10]，在等輻射圖中，將2種藥物單獨(dú)使用時(shí)的強(qiáng)度(用ED50表示)分別標(biāo)繪在X軸、Y軸上，兩點(diǎn)相連形成相加線，如果藥物聯(lián)用后強(qiáng)度落在此相加線左側(cè)，則表示兩藥為協(xié)同作用；如果落在該線上，則代表兩藥為相加作用；如果落于右側(cè)，則兩藥為拮抗作用。由圖1可知，坐標(biāo)軸上A、C兩點(diǎn)分別為黃芩苷和對(duì)乙酰氨基酚單用時(shí)的ED50，A、C兩點(diǎn)相連即為相加線，D點(diǎn)為兩者理論上相加的ED50，B點(diǎn)為兩者聯(lián)用的實(shí)測(cè)ED50。B、D兩點(diǎn)的ED50比較差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；由于B點(diǎn)落在相加線左側(cè)，因此可以判定黃芩苷和乙酰氨基酚在鎮(zhèn)痛效果上呈現(xiàn)協(xié)同作用。

3.5 黃芩苷聯(lián)合對(duì)乙酰氨基酚對(duì)小鼠腦組織和血清PGE2、LTA4水平的影響 與對(duì)照組比較，各用藥組小鼠腦組織和血清中PGE2水平降低(P<0.05)，其中聯(lián)合用藥組作用更顯著(P<0.05)；黃芩苷組和聯(lián)合用藥組小鼠腦組織和血清中LTA4水平降低(P<0.05)，對(duì)乙酰氨基酚組無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

3.6 黃芩苷聯(lián)合對(duì)乙酰氨基酚對(duì)小鼠血清TNF-α、NF-κB水平的影響 與對(duì)照組比較，各用藥組小鼠血清TNF-α、NF-κB水平降低(P<0.05)，其中聯(lián)合用藥組作用更顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 討論

對(duì)乙酰氨基酚屬于非成癮性鎮(zhèn)痛藥，在臨床上應(yīng)用較為廣泛，常用于治療感冒發(fā)燒、肌肉酸痛，關(guān)節(jié)疼痛，痛經(jīng)，術(shù)后疼痛、癌癥疼痛等[11-12]。對(duì)乙酰氨基酚在40～202.5 mg/kg范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，扭體次數(shù)減少，抑制率升高，說(shuō)明對(duì)乙酰氨基酚具有鎮(zhèn)痛作用。黃芩苷作為黃芩的主要活性成分，已被研究證明其可以減輕實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)和疼痛[13]，對(duì)神經(jīng)痛[14]、偏頭痛[15]和牙齒術(shù)后疼痛[16]也有鎮(zhèn)痛效果。黃芩苷在15～79.5 mg/kg范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，扭體次數(shù)減少，抑制率升高，證明黃芩苷具有鎮(zhèn)痛作用。

對(duì)乙酰氨基酚是多種復(fù)方藥物的組成成分，在使用時(shí)極有可能因劑量疊加而過(guò)量[17]，導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)的發(fā)生和肝腎損害[18]。尋找具有不同作用機(jī)制的鎮(zhèn)痛藥物與之聯(lián)用可以增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛療效，降低用量，從而減少或者避免不良反應(yīng)發(fā)生[19-20]。本研究顯示，對(duì)乙酰氨基酚和黃芩苷聯(lián)用，在一定劑量范圍內(nèi)，隨著聯(lián)用劑量的增加，小鼠扭體次數(shù)減少，抑制率升高。兩藥聯(lián)用的實(shí)測(cè)ED50小于兩藥單用的理論ED50(P<0.05)，通過(guò)等輻射分析可以判斷，兩藥聯(lián)用是協(xié)同增效的作用關(guān)系。

對(duì)乙酰氨基酚鎮(zhèn)痛的主要機(jī)制是減少PGE2的產(chǎn)生，PGE2是花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶途徑(COX)生成的代謝產(chǎn)物，是一種重要的致炎致痛物質(zhì)[21]。對(duì)乙酰氨基酚可同時(shí)抑制中樞和外周的COX2，減少PGE2的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷的抗炎鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與抑制COX2酶活性，減少PGE2的產(chǎn)生有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，單用對(duì)乙酰氨基酚或黃芩苷均能降低小鼠腦組織和血清PGE2水平，而聯(lián)合用藥組降低PGE2水平作用更佳，說(shuō)明兩者聯(lián)用協(xié)同鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一是抑制中樞和外周的PGE2產(chǎn)生。LTA是花生四烯酸經(jīng)脂氧酶途徑代謝的產(chǎn)物，LTB4是由LTA4水解酶生成的，兩者都是重要的致炎致痛物質(zhì)。研究表明，黃芩苷能調(diào)節(jié)花生四烯酸的代謝，從而減少其下游代謝產(chǎn)物L(fēng)TA和LTB的水平，減輕過(guò)敏性鼻炎的炎癥反應(yīng)[24]。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷能降低小鼠腦組織和血清LTA4水平，而對(duì)乙酰氨基酚對(duì)小鼠腦組織和血清LTA4水平無(wú)明顯影響，聯(lián)合用藥組小鼠腦組織和血清LTA4水平也降低。由此可知，在中樞和外周，黃芩苷既能抑制花生四烯酸環(huán)氧酶代謝途徑，又能抑制脂氧酶代謝途徑，從而降低PGE2和LTA4水平，而對(duì)乙酰氨基酚只降低環(huán)氧酶途徑的代謝產(chǎn)物PGE2水平，兩者聯(lián)用可降低LTA4水平，并使PGE2水平進(jìn)一步降低。

NF-κB是誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子家族，可被TNF、白介素等激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)與炎癥、細(xì)胞存活、增殖和分化相關(guān)基因的快速轉(zhuǎn)錄[25]。研究表明，黃芩苷可以抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠NF-κB信號(hào)通路[26]；對(duì)乙酰氨基酚可以降低IL-1β誘導(dǎo)的人類星形膠質(zhì)細(xì)胞系中的NF-κB核易位[27]。本研究結(jié)果顯示，單用黃芩苷或?qū)σ阴０被泳山档脱錘F-κB、TNF-α水平，兩者聯(lián)用后NF-κB和TNF-α水平更低，說(shuō)明黃芩苷和對(duì)乙酰氨基酚聯(lián)用協(xié)同鎮(zhèn)痛的機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，黃芩苷聯(lián)合對(duì)乙酰氨基酚對(duì)急性炎性疼痛具有協(xié)同鎮(zhèn)痛作用，且聯(lián)用后兩者用量均減少，可有效減少對(duì)乙酰氨基酚的不良反應(yīng)，其協(xié)同鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與減少花生四烯酸的代謝產(chǎn)物和抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，但其更全面的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。