常春梅，黃玉琴，竇媛，楊睿，段冰，杜華英，朱麗琴,2*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045；2.江西省果蔬保鮮與無損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

柑橘是世界第一大類水果，2019年，我國(guó)柑橘種植面積達(dá)2617.3 khm2，柑橘產(chǎn)量達(dá)4587.5萬噸[1]。我國(guó)是柑橘生產(chǎn)大國(guó)，擁有極豐富的地方良種資源、野生資源、野生近緣資源及天然雜種資源[2]。柑橘果實(shí)富含對(duì)人體有益的有機(jī)酸、膳食纖維、維生素、蛋白質(zhì)、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，深受消費(fèi)者的喜愛。目前對(duì)于柑橘的消費(fèi)方式主要有鮮食和加工柑橘汁、罐頭兩種方式，這兩種加工方式都會(huì)產(chǎn)生大量的果皮?，F(xiàn)階段，很多柑橘加工企業(yè)仍以簡(jiǎn)單衛(wèi)生填埋為主要的處理皮渣方式[4]。柑橘皮渣中含有黃酮[5-6]、精油[7-8]、果膠[9-11]、膳食纖維[12-13]等多種生物活性物質(zhì)，如果不對(duì)其進(jìn)行加工利用，勢(shì)必造成對(duì)原料的浪費(fèi)，不利于柑橘深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。另外，將柑橘皮渣直接丟棄于環(huán)境中會(huì)造成污染，不利于環(huán)境的綠色可持續(xù)發(fā)展。因此，利用柑橘皮渣不僅可以減輕環(huán)境負(fù)擔(dān)，有利于環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，還可以從中提取生物活性物質(zhì)，有利于醫(yī)療、食品、化妝品等行業(yè)的發(fā)展。陳皮(Citrireticulataepericarpium，CRP)為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮[14]，陳皮中含有140余種化合物，具有廣泛的藥理學(xué)效應(yīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，作為一種藥食兩用品種，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和日常生活。其中，揮發(fā)油和黃酮類化合物通常被認(rèn)為是主要的生物活性物質(zhì)和特征成分[15]。陳皮的出現(xiàn)對(duì)于減少柑橘皮對(duì)環(huán)境的污染、增加柑橘產(chǎn)業(yè)附加值、促進(jìn)柑橘產(chǎn)業(yè)的深加工發(fā)展起到了重要作用。

精油是一種復(fù)雜的混合物，通常具有強(qiáng)烈的感官特性和揮發(fā)性，是許多植物都可以產(chǎn)生的次生代謝物，也被稱為揮發(fā)油[16]。植物精油的來源廣泛，可以來源于根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等各個(gè)植物器官，普遍具有抗氧化、消炎、抑菌、抗病毒等功效，具有較高的研究?jī)r(jià)值[17]。近些年來，健康、安全、天然的產(chǎn)物越來越受到人們的青睞，科研人員也積極尋求更安全健康的天然產(chǎn)物、更科學(xué)有效的方式來為人們的生產(chǎn)生活服務(wù)?，F(xiàn)階段從植物中提取精油的方法包括壓榨法、有機(jī)溶劑萃取法[18]、水蒸氣蒸餾法[19-20]、酶解法[21-22]、超聲法[23]、微波法[24]、超臨界CO2萃取法[25]等。上述方法各有其局限性，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要選擇合適的提取方式。壓榨法是一種非熱處理的物理方法，可以較大程度地保留植物組織中的熱敏成分，但其無法較完全地將精油提取出來，造成原料利用不充分，精油產(chǎn)率不高，并且所提取的精油中含有的雜質(zhì)較多，且不容易分離，品質(zhì)較差。有機(jī)溶劑萃取法是通過相似相溶原理從植物組織中將精油提取出來，其提取原理容易造成有機(jī)溶劑的殘留，危害人們的健康。超臨界CO2萃取法提取率高，但其需要真空的提取環(huán)境及昂貴的生產(chǎn)設(shè)備，生產(chǎn)成本較高，因此現(xiàn)階段大多處于試驗(yàn)階段，不適合工廠大型加工，并未大規(guī)模推廣?；谝陨峡紤]，故本文采用超聲破碎復(fù)合纖維素酶酶解優(yōu)化陳皮精油的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮絲：新鄉(xiāng)市鳳泉區(qū)千尋花茶店；纖維素酶、無水Na2SO4、95%乙醇、過硫酸鉀(均為分析純)、ABTS+·：上海麥克林生化科技有限公司；DPPH·：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

SB-3200DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；揮發(fā)油測(cè)定器、1000 mL圓底燒瓶、2 kW電爐 滬興電熱電器廠；冷凝管、電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；WFJ 2100可見分光光度計(jì) 尤尼科(上海)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

陳皮絲→烘干→稱量→加酶、加蒸餾水→酶解→超聲→蒸餾→收集→無水Na2SO4除水→稱量→計(jì)算、記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以50.00 g陳皮絲為試驗(yàn)原料，固定蒸餾水的量為300 mL，于不同纖維素酶添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、不同酶解溫度(35，40，45，50，55 ℃)、不同酶解時(shí)間(30，60，90，120，150 min)、不同超聲功率(50%、60%、70%、80%、90%)、不同超聲時(shí)間(10，20，30，40，50 min)的條件下，采用揮發(fā)油測(cè)定器提取3 h，至上層油含量不再發(fā)生變化，收集，加入適量無水硫酸鈉，靜置干燥，將得到的陳皮精油放入棕色瓶中，將棕色瓶放入4 ℃冰箱中備用。以陳皮精油的提取率作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定最佳條件，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 精油提取率

陳皮精油提取率(%)=所得精油質(zhì)量/物料質(zhì)量×100%。

(1)

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先通過單因素試驗(yàn)結(jié)果確定各單因素的最優(yōu)水平，參照L18(37)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化陳皮精油提取條件，進(jìn)行五因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of factors and levels of orthogonal experiment

1.4 抗氧化能力測(cè)定

1.4.1 DPPH·清除率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[26]的方法并加以改進(jìn)。操作方法：用95%的乙醇將陳皮精油配制成濃度為320 mg/mL的母液，將一定體積的陳皮精油母液與1 mL濃度為2×10-4mol/L的DPPH·溶液混合，并用95%的乙醇將反應(yīng)體系補(bǔ)充至2 mL,混勻，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，記為A1；以95%乙醇溶液為空白對(duì)照，測(cè)定1 mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液與1 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光值，記為A0。自由基清除率按公式(2)計(jì)算：

DPPH·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%。

(2)

1.4.2 ABTS+·清除率測(cè)定

采用文獻(xiàn)[27]的方法并略作改進(jìn)。將7 mmol/L溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀混合，置于暗處12～16 h，用95%乙醇將ABTS+·溶液稀釋至在波長(zhǎng)734 nm處的吸光值為0.70±0.02。將提取的陳皮精油樣品用95%乙醇配制成質(zhì)量濃度為80 mg/mL的母液，取一定體積母液與1 mL ABTS+·溶液混合，并用95%乙醇補(bǔ)充反應(yīng)體系至2 mL，搖勻后靜置10 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)吸光值，記為A1；以95%乙醇溶液為空白對(duì)照，測(cè)定1 mL ABTS+·溶液與1 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光值，記為A0。自由基清除率按公式(3)計(jì)算:

ABTS+·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%。

(3)

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用新復(fù)極差法(Duncan's)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異)，采用Origin軟件進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)陳皮精油提取率的影響

固定酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為90 min，超聲功率為70%，超聲時(shí)間為30 min，研究纖維素酶添加量對(duì)陳皮精油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)陳皮精油提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition amount on the yield of CRP essential oil

由圖1可知，纖維素酶添加量較少時(shí)，陳皮酶解不完全，隨著纖維素酶添加量的增加，陳皮酶解程度增大，越來越多腺體內(nèi)的精油被釋放出來，陳皮精油提取率上升。當(dāng)纖維素酶添加量超過4%時(shí)，陳皮酶解完全，再增加纖維素酶添加量，纖維素酶會(huì)吸附部分果皮溶出物，造成精油提取率下降。

2.1.2 酶解溫度對(duì)陳皮精油提取率的影響

固定纖維素酶添加量為4%，酶解時(shí)間為90 min，超聲功率為70%，超聲時(shí)間為30 min，研究酶解溫度對(duì)陳皮精油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解溫度對(duì)陳皮精油提取率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of CRP essential oil

由圖2可知，在不同溫度下對(duì)陳皮絲進(jìn)行酶解，前期酶解溫度的上升會(huì)促進(jìn)精油的釋放，此時(shí)精油的揮發(fā)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于酶解溫度的升高對(duì)陳皮精油產(chǎn)率的影響，因此隨著酶解溫度升高，陳皮精油的提取率逐漸升高。在45 ℃條件下水解一定時(shí)間，陳皮精油的提取率達(dá)到最大值。溫度進(jìn)一步上升會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生一定影響，造成陳皮酶解不完全，精油的提取率有所下降。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)陳皮精油提取率的影響

固定纖維素酶添加量為4%，酶解溫度為45 ℃，超聲功率為70%，超聲時(shí)間為30 min，研究酶解時(shí)間對(duì)陳皮精油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)陳皮精油提取率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of CRP essential oil

由圖3可知，在最適酶解溫度條件下對(duì)陳皮絲酶解不同時(shí)間，在30～120 min內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素酶酶解陳皮的程度逐漸增大，因此陳皮精油的提取率逐漸升高，在45 ℃條件下水解120 min時(shí)，陳皮精油的產(chǎn)率達(dá)到最大值。但再增加酶解時(shí)間，增加的精油產(chǎn)量不足以補(bǔ)充時(shí)間延長(zhǎng)造成的精油揮發(fā)損失，因此精油提取率下降。

2.1.4 超聲功率對(duì)陳皮精油提取率的影響

固定纖維素酶添加量為4%，酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為120 min，超聲時(shí)間為30 min，研究超聲功率對(duì)陳皮精油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對(duì)陳皮精油提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲波功率為50%～80%時(shí)，超聲波功率的逐步增大會(huì)破壞陳皮的組織，使更多的陳皮精油釋放出來，精油提取率逐漸升高，并于超聲功率達(dá)到80%時(shí)達(dá)到最大值。但功率再增大會(huì)造成超聲機(jī)內(nèi)溫度升高，使精油提取率下降。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)陳皮精油提取率的影響

固定纖維素酶添加量為4%，酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為120 min，超聲功率為80%，研究超聲時(shí)間對(duì)陳皮精油提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)陳皮精油產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of CRP essential oil

由圖5可知，超聲時(shí)間在10～40 min內(nèi)，超聲時(shí)間的延長(zhǎng)可以更徹底地破碎細(xì)胞壁，使精油更大程度地釋放，陳皮精油的提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升。但隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，超聲機(jī)內(nèi)溫度上升，會(huì)加快精油釋放到空氣中，造成精油產(chǎn)率下降。因此，超聲時(shí)間超過40 min時(shí)提取率有所下降。

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，參照L18(37)正交表，進(jìn)行五因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響陳皮精油提取率的各因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2，正交試驗(yàn)方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment results

經(jīng)正交結(jié)果分析，5個(gè)因素對(duì)陳皮精油產(chǎn)率影響的主次順序?yàn)槔w維素酶添加量>超聲功率>酶解時(shí)間>酶解溫度>超聲時(shí)間，且產(chǎn)率最高的組合為A2B2C2D2E2，即纖維素酶添加量為4%，酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為120 min，超聲功率為80%，超聲時(shí)間為40 min。因其未在正交表中，后期進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，產(chǎn)率達(dá)0.69%。正交表中最高組合A3B2C3D2E1的產(chǎn)率為0.6415%，驗(yàn)證試驗(yàn)的精油產(chǎn)率高于正交試驗(yàn)的最高組合。不利用超聲和酶解方式輔助提取的情況下，精油的產(chǎn)率為0.34%，僅為超聲波和酶法輔助提取的1/2，表明超聲波輔助酶法提取陳皮精油的方法可行。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

續(xù) 表

2.3 陳皮精油抗氧化能力分析

2.3.1 陳皮精油對(duì)DPPH·清除率的影響

陳皮精油對(duì)DPPH·清除率的影響見圖6。

圖6 陳皮精油對(duì)DPPH·清除率的影響

由圖6可知，陳皮精油濃度較低時(shí)，隨著濃度的增大，對(duì)DPPH·的清除率呈明顯上升趨勢(shì)。當(dāng)陳皮精油濃度為40 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到70%，之后繼續(xù)增加精油濃度，DPPH·清除率趨于平緩，最高可以達(dá)到82%左右。說明陳皮精油對(duì)DPPH·具有良好的清除效果。

2.3.2 陳皮精油對(duì)ABTS+·清除率的影響

陳皮精油對(duì)ABTS+·清除率的影響見圖7。

圖7 陳皮精油對(duì)ABTS+·清除率的影響Fig.7 Effect of CRP essential oil on the scavenging rate of ABTS+·

由圖7可知，陳皮精油濃度較低時(shí)，隨著濃度的增大，對(duì)ABTS+·的清除率呈明顯上升趨勢(shì)。當(dāng)陳皮精油濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到74%，之后增加精油濃度對(duì)ABTS+·清除率的影響不大，其對(duì)ABTS+·的清除率基本保持在80%左右。說明陳皮精油對(duì)ABTS+·具有良好的清除效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲破碎復(fù)合纖維素酶酶解法提取陳皮中的精油，優(yōu)化超聲輔助酶法提取陳皮精油的提取條件。正交試驗(yàn)結(jié)果確定纖維素酶添加量4%、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間120 min、超聲功率80%(640 W)、超聲時(shí)間40 min為陳皮精油的最佳提取條件。方差分析結(jié)果表明，纖維素酶添加量對(duì)陳皮精油提取率影響極顯著，超聲功率對(duì)陳皮精油提取率影響顯著。經(jīng)正交優(yōu)化，超聲輔助酶法提取陳皮精油的產(chǎn)率為0.69%。經(jīng)此方法提取的陳皮精油具有良好的抗氧化效果。因此，超聲輔助酶法提取陳皮精油降低了生產(chǎn)成本且提取過程低碳環(huán)保，適合大規(guī)模生產(chǎn)，有一定的應(yīng)用價(jià)值。