黃 川，吳美怡，謝戰(zhàn)洪，趙瑞強(qiáng)，溫 燕

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530021)

肝癌是一種惡性程度高、復(fù)發(fā)率高的惡性腫瘤，化學(xué)治療是治療肝癌必不可少的手段之一，但在治療過(guò)程出現(xiàn)的腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象使得化學(xué)治療藥物的應(yīng)用嚴(yán)重受阻[1]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一組廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)且可被多種信號(hào)激活的絲/蘇氨酸蛋白激酶。研究認(rèn)為，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腫瘤的化學(xué)治療耐藥過(guò)程，其作用機(jī)制可能是調(diào)控耐藥相關(guān)基因的表達(dá)[2]。MAPK有多個(gè)亞家族，目前已確定在細(xì)胞功能上發(fā)揮重要作用的有細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38)。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是一種茶葉中活性最高的兒茶素。研究證明，EGCG不僅可以在體外逆轉(zhuǎn)耐阿霉素(doxorubicin,DOX)人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX的耐藥性，而且還可以與抗腫瘤藥物聯(lián)合抑制BEL-7404/DOX細(xì)胞移植瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[3]。但由于EGCG的分子側(cè)鏈含有大量酚羥基，易氧化變性，導(dǎo)致其性質(zhì)不夠穩(wěn)定，脂溶性差，生物利用度低，體內(nèi)代謝快，維持時(shí)間短，藥理活性不高，從而限制了其應(yīng)用。本課題組前期對(duì)EGCG進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，篩選出了毒性低、穩(wěn)定性高、脂溶性好的乙基化衍生物Y6。研究發(fā)現(xiàn),及15 μmol·L-1Y6分別聯(lián)合10 μmol·L-1DOX對(duì)耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX具有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用，并且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性[4]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步以耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX為研究對(duì)象，觀察Y6干預(yù)后其MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，旨在探討Y6對(duì)耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX的MAPK信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX由廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室提供。

1.2 主要試劑與儀器DOX購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字 H44024360)，維拉帕米(verapamil,VER)購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字 H31021343)，EGCG購(gòu)自杭州禾田生物技術(shù)有限公司，Y6由本課題組前期自主合成，IgG抗體、β-actin抗體、ERK1/2抗體、p38抗體、JNK抗體、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2,p-ERK1/2)抗體、磷酸化p38(phosphorylated p38,p-p38)抗體、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，放射免疫沉淀(radioi-mmunoprecipitation,RIPA)裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)蛋白酶抑制劑購(gòu)自北京恒鑫生物科技有限公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,BS97MyCycler轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，DMR倒置顯微鏡照相系統(tǒng)購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)將BEL-7404/DOX細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1.0×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM中,于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，期間培養(yǎng)液中加入終質(zhì)量濃度為2 mg·L-1的DOX以維持BEL-7404/DOX細(xì)胞的耐藥性。細(xì)胞用于正式實(shí)驗(yàn)前7 d給予不含DOX的培養(yǎng)液培養(yǎng)，之后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞分組及藥物處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-7404/DOX細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，均分至6個(gè)25T透氣培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、DOX組、DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組，待細(xì)胞融合至80%左右，吸棄舊培養(yǎng)液，各實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)藥物進(jìn)行處理：空白對(duì)照組不加入任何藥物；DOX組加入終濃度為10 μmol·L-1的DOX；DOX+VER組加入終濃度為10 μmol·L-1的DOX和10 μmol·L-1的VER；DOX+EGCG組加入終濃度為10 μmol·L-1的DOX和10 μmol·L-1的EGCG；DOX+低劑量Y6組加入終濃度為10 μmol·L-1的DOX和10 μmol·L-1的Y6；DOX+高劑量Y6組加入終濃度為10 μmol·L-1的DOX和15 μmol·L-1的Y6；各組細(xì)胞加藥完畢后，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.5 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38及p38蛋白表達(dá)取“1.4”項(xiàng)干預(yù) 48 h 后的各組細(xì)胞，各加入300 μL RIPA裂解液、3 μL PMSF及6 μL磷酸酶抑制劑混合物A，4 ℃放置15～30 min，收集細(xì)胞裂解混合液，4 ℃ 12 000×g離心10 min，取上清液。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在制作的電泳膠板加樣孔中加入含 25 μg蛋白樣品，恒流 60 mA進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h，將分離膠的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(150 mA，1.5 h)，用50 g·L-1脫脂牛奶常溫?fù)u床封閉1 h，用含體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(Tris-buffered saline with 0.05% tween-20,TBST)洗膜后剪下目的蛋白膜和內(nèi)參蛋白膜，加入p-ERK1/2(11 000)、p-p38(11 000)、p-JNK(11 000)、ERK1/2(11 000)、p38(11 000)、JNK(11 000)和β-actin(1500)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入IgG(11 000)二抗，常溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜。ECL法顯影后進(jìn)行膠片掃描，用Image J 軟件量化條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值代表蛋白相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算p-ERK1/2與ERK1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比值(p-ERK1/2/ERK1/2)、p-JNK與JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量的比值(p-JNK/JNK)、p-p38與p38蛋白相對(duì)表達(dá)量的比值(p-p38/p38)。

2 結(jié)果

2.1 6組耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX中p-ERK1/2/ERK1/2比較結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。DOX組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-ERK1/2/ERK1/2與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-ERK1/2/ERK1/2均顯著高于空白對(duì)照組和DOX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-ERK1/2/ERK1/2比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 6組耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX中p-ERK1/2/ERK1/2比較

1：空白對(duì)照組；2：DOX組；3：DOX+VER組；4：DOX+EGCG組；5：DOX+低劑量Y6組；6：DOX+高劑量Y6組。

2.2 6組耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX中p-JNK/JNK比較結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。與空白對(duì)照組比較，DOX組、DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中 p-JNK/JNK均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DOX組比較，DOX+VER組、DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK與DOX組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與DOX+VER組比較，DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DOX+低劑量Y6組比較，DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 6組耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX中p-JNK/JNK比較

1：空白對(duì)照組；2：DOX組；3：DOX+VER組；4：DOX+EGCG組；5：DOX+低劑量Y6組；6：DOX+高劑量Y6組。

2.3 6組耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX中p-p38/p38比較結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。與空白對(duì)照組比較，DOX組、DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-p38/p38均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DOX組比較，DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-p38/p38均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DOX+VER組比較，DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-p38/p38均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組、DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中的p-p38/p38比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 6組耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX中p-p38/p38比較

1：空白對(duì)照組；2：DOX組；3：DOX+VER組；4：DOX+EGCG組；5：DOX+低劑量Y6組；6：DOX+高劑量Y6組。

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種起源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其中肝細(xì)胞癌約占所有原發(fā)性肝癌的90%。目前，大部分肝癌患者確診時(shí)已為晚期，不適合手術(shù)切除腫瘤，化學(xué)治療是主要的治療方法。然而，肝癌細(xì)胞獲得耐藥性仍是肝癌化學(xué)治療的臨床障礙，癌細(xì)胞獲得性耐藥是一個(gè)多因素的過(guò)程，其所涉及的各種細(xì)胞生理活動(dòng)都與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的多向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)以及各種激酶的激活關(guān)系密切[5-6]。因此，尋找能夠逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞耐藥的藥物且深入了解逆轉(zhuǎn)劑對(duì)耐藥細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及激酶的影響，對(duì)于克服化學(xué)治療耐藥尤為重要。Y6是EGCG乙基化衍生物，研究表明，Y6能夠有效逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性，是一種潛在的逆轉(zhuǎn)劑[7-8]。

MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，主要包括ERK1/2、JNK和p38通路。MAPK信號(hào)通路不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和細(xì)胞間的相互作用,且在腫瘤的發(fā)生以及逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[9-11]。HSIEH等[12]在鼻咽癌多耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，用雷公藤紅素誘導(dǎo)耐順鉑鼻咽癌細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平增加，提示雷公藤紅素可能通過(guò)激活MAPK通路誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞周期阻滯和凋亡；應(yīng)用p38抑制劑SB203580和ERK1/2抑制劑U0126后caspase-3和caspase-8的激活顯著減弱，進(jìn)一步證實(shí)鼻咽癌耐藥細(xì)胞凋亡是與MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。CHAI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在耐DOX人乳腺癌細(xì)胞中p38和ERK信號(hào)通路被顯著激活，同時(shí)P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表達(dá)量顯著高于親本細(xì)胞株；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)柱重樓總皂苷能夠通過(guò)抑制耐DOX人乳腺癌細(xì)胞中ERK通路下調(diào)P-gp的表達(dá)，從而增加DOX的細(xì)胞毒性。以上研究證實(shí)，MAPK信號(hào)通路參與逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性。

為探討Y6在逆轉(zhuǎn)耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX耐藥過(guò)程中對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響，本研究采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),并評(píng)估ERK1/2、JNK、p38蛋白的磷酸化程度及活性的變化，結(jié)果顯示，單用DOX處理的耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX中p-ERK1/2/ERK1/2與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-ERK1/2/ERK1/2均顯著高于空白對(duì)照組和DOX組，DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-ERK1/2/ERK1/2各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Y6通過(guò)上調(diào)ERKl/2蛋白的磷酸化水平激活了ERK1/2通路，激活效果與等劑量EGCG和VER相當(dāng)。另外，與空白對(duì)照組比較，DOX組、DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK均顯著增高，DOX+VER組、DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK均顯著高于DOX組，而DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK與DOX組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK顯著低于DOX+VER組，且DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-JNK/JNK顯著高于DOX+低劑量Y6組，提示Y6可呈濃度依賴性上調(diào)JNK蛋白的磷酸化水平,激活JNK通路,激活效果與等劑量EGCG相當(dāng)。此外，本研究結(jié)果顯示，DOX組、DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-p38/p38均顯著高于空白對(duì)照組，而DOX+VER組、DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組和DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-p38/p38均顯著高于DOX組，而且DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-p38/p38值均顯著低于DOX+VER組，同時(shí)，DOX+EGCG組、DOX+低劑量Y6組、DOX+高劑量Y6組耐DOX人肝癌細(xì)胞中p-p38/p38比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Y6通過(guò)上調(diào)p38蛋白的磷酸化水平激活了p38通路，激活效果與等劑量EGCG相當(dāng)。本研究結(jié)果與HSIEH等[12]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明化學(xué)治療藥物聯(lián)合逆轉(zhuǎn)劑作用于耐藥細(xì)胞后ERK1/2、JNK和p38磷酸化水平均增高,MAPK信號(hào)通路被激活。

綜上所述，Y6通過(guò)上調(diào)ERKl/2、JNK及p38蛋白的磷酸化水平激活3條平行的MAPK信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX耐藥。本課題組前期報(bào)道，Y6作為天然耐藥逆轉(zhuǎn)劑能夠有效增加耐DOX人肝癌細(xì)胞BEL-7404/DOX對(duì)DOX的敏感性，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能與降低缺氧誘導(dǎo)因子1α和P-gp表達(dá)有關(guān)[4]。由此進(jìn)一步推測(cè)，Y6增加DOX的細(xì)胞毒作用可能與激活MAPK信號(hào)通路調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子1α和P-gp的表達(dá)有關(guān)，MAPK與二者之間的相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。