郝露露, 柯明思, 朱奕秀, 許燕敏, 張穎,3, 鄭春芳

1. 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 浙江 溫州 325035;

2. 嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 廣東 湛江 524048;

3. 海南省林業(yè)科學(xué)研究(海南省紅樹林研究院), 海南 海口 571129

RNA 解旋酶是一類利用ATP 結(jié)合或修飾RNA和RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的高度保守的酶(Tanner et al,2001; Linder et al, 2011), 參與復(fù)制、修復(fù)、重組和轉(zhuǎn)錄等眾多生命代謝活動(Anantharaman et al,2002)。DEDA-box 家族是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的最大的RNA解旋酶家族(Fairman-Williams et al, 2010), 在植物的生長發(fā)育(Lorkovi? et al, 1997; Jacobsen et al, 1999;Stonebloom et al, 2009)、抗病(Li et al, 2008)和抗逆(Gollan et al, 2015; Nawaz et al, 2018a)等生命過程中都具有非常重要的作用。作為最大的解旋酶家族,多項(xiàng)研究證明DEAD-box 家族基因參與植物的非生物脅迫響應(yīng)過程(Nishimura et al, 2010; Tuteja et al,2013; Nawaz et al, 2018a), 番 茄 (Solanum lycopersicum)中SIDEAD31 通過調(diào)控干旱脅迫和鹽脅迫相關(guān)的抗性基因的表達(dá), 從而提高植物的抗逆性(Zhu et al, 2015); 水稻(Oryza sativa) 中OsDEAD58 能夠通過影響葉綠素的翻譯提高水稻的抗鹽性和抗寒性(Nawaz et al, 2019); 水稻中PDH45 通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶等各種抗氧化酶的活性來提高植物的耐鹽性(Tuteja et al, 2013); 擬南芥(Arabidopsis thaliana)中MH1 通過增強(qiáng)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的清除能力和滲透調(diào)節(jié)能力, 從而提高自身的抗旱性和耐鹽性(Luo et al, 2009); 擬南芥中RH7 影響rRNA 的加工調(diào)控低溫脅迫下植物正常的生長發(fā)育(Liu et al, 2016)。由于DEAD-box RNA解旋酶具有多重作用(陳丹 等, 2016; 蔡敬 等,2017), 目前已成為研究植物抗逆性的良好基因家族(Vashisht et al, 2006; Nidumukkala et al, 2019)。

紅欖李(Lumnitzera littorea)為使君子科, 欖李屬紅樹植物, 在中國僅分布在海南省(張穎 等,2018)。該物種極不耐低溫, 分布地狹窄, 野生種數(shù)量9 棵, 均生長于海南三亞鐵爐港紅樹林保護(hù)區(qū)(鐘才榮 等, 2011)。由于數(shù)量少、繁殖力低, 目前已經(jīng)被列為國家一級重點(diǎn)保護(hù)植物(張穎 等, 2021)。在紅欖李的生長過程中, 低溫不僅是限制其緯度分布的環(huán)境因子, 而且是人工育種和生態(tài)修復(fù)的一大難題。培育適應(yīng)低溫環(huán)境的紅欖李種苗對紅欖李生態(tài)修復(fù)具有重要意義。

本研究基于低溫脅迫下紅欖李幼苗差異表達(dá)的DEAD-box 解旋酶家族基因的分析, 篩選出 4 個DEAD-box 解旋酶基因:LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43和LlDEAD65, 通過生物信息學(xué)分析及熒光定量PCR 檢測技術(shù)分析揭示這4 個基因的生物學(xué)特性及在低溫脅迫下的分子響應(yīng)機(jī)制, 為紅欖李的人工輔助育種及培育耐冷植物材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和材料處理

紅欖李樣品采集自三亞鐵爐港紅樹林自然保護(hù)區(qū)。2021 年6 月取自然生長條件下紅欖李不同的組織(根、莖、葉、花、果)于液氮中速凍, 然后保存在–80℃的超低溫冰箱中備用。

選取長勢良好, 株高30±2cm 的一年生紅欖李幼苗作為實(shí)驗(yàn)材料, 選取生長狀態(tài)相同的紅欖李幼苗分別在溫度34/30℃、25/23℃、15/12℃和8/5 ℃,相對濕度為50%/70%、光照強(qiáng)度為80%, 12h/12h(日/夜)的植物冷光源氣候培養(yǎng)箱(LRG-450-LED, LV BO, 中國)中培養(yǎng)48h 后, 立即用液氮速凍幼苗的根、莖、葉, 混樣后保存在–80℃的超低溫冰箱中。每個處理設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)理化特性的分析所用軟件及網(wǎng)址見表1。以DEAD-box 為關(guān)鍵詞, 在NCBI (national center for biotechnology information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 數(shù)據(jù)庫搜索并下載同源氨基酸序列,運(yùn)用ClustalW 進(jìn)行同源序列的比對, 利用MEGA X 軟件最大似然法(maximum likelihood method) 構(gòu)建分子進(jìn)化樹(Kumar et al, 2018)。

1.3 基因特異性表達(dá)分析

植物組織材料用植物RNA 提取試劑盒(艾德萊,中國, RN53)根據(jù)說明書進(jìn)行RNA 的提取。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性, 用超微量分光光度計(jì)(丹諾爾, 中國, DS-11)檢測RNA 的濃度, 檢測合格的RNA 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

用 HiScript QRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(諾唯贊, 中國, R123-01)合成cDNA 的第一條鏈。根據(jù)核酸序列, 設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR 檢測實(shí)驗(yàn)的特異性引物, 引物序列見表2。

表2 qPCR 引物序列Tab. 2 Primer sequence of qPCR

用SYBR? Select Master Mix (2X)(4472908)試劑盒在StepOnePlusTM實(shí)時熒光定量PCR 儀(ABI,美國, QS1) 進(jìn)行測定。反應(yīng)體系如表3, 每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。利用 2-ΔΔCT算法計(jì)算相對表達(dá)量(Livak et al, 2001), 用SPSS 進(jìn)行顯著性分析, 用Origin 2018 軟件作圖。

表3 qPCR 反應(yīng)體系Tab. 3 qPCR reaction system

2 結(jié)果分析

2.1 紅欖李DEAD-box 蛋白的理化性質(zhì)分析

等電點(diǎn)預(yù)測分析表明LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43 和LlDEAD65 都是酸性蛋白; 穩(wěn)定指數(shù)和親水性總平均值預(yù)測分析表明LlDEAD43 是穩(wěn)定的疏水蛋白, 而 LlDEAD12、LlDEAD32 和LlDEAD65 是不穩(wěn)定的疏水蛋白(表4)。

表4 紅欖李DEAD-box 蛋白理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位分析Tab. 4 Physicochemical property and subcellular localization

2.2 紅欖李DEAD-box 蛋白的親水性和疏水性預(yù)測分析

利用ProtScale 分析4 個蛋白質(zhì)的親水性(圖1),y軸以0 為界限, 0 以上, 值越大表示該氨基酸的疏水性越強(qiáng); 0 以下, 值越小表示親水性越強(qiáng)。分析結(jié)果表明, LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43 和LlDEAD65 親水性最高的位點(diǎn)分別是87、91、192和192 位置上的氨基酸; 疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)分別為271、14 和15、62、55 位置上的氨基酸, 并且這4個蛋白質(zhì)的親水性總平均值都大于0, 表明這4 個蛋白質(zhì)都屬于疏水性蛋白, 此結(jié)果與等電點(diǎn)預(yù)測分析結(jié)果相同。

圖1 紅欖李DEAD-box 蛋白質(zhì)的親水性分析a. LlDEAD12; b. LlDEAD32; c. LlDEA43; d. LlDEAD65Fig. 1 Hydrophilic analysis of proteins. (a) LlDEAD12; (b) LlDEAD32; (c) LlDEA43; (d) LlDEAD65

2.3 紅欖李DEAD-box 蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測表明: 4 個蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成,其中LlDEAD12 和LlDEAD32 的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成, 占到全部組成結(jié)構(gòu)的42.82%; LlDEAD43 和LlDEAD65 的二級結(jié)構(gòu)組成結(jié)構(gòu)最多的是無規(guī)則卷曲, 分別占 44.28%和40.69%(圖2、表5)。

表5 DEAD-box 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)類型及占比Tab. 5 Secondary structure types and percentages of DEAD-box proteins

圖2 DEAD-box 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測a. LlDEAD12; b. LlDEAD32; c. LlDEA43; d. LlDEAD65。圖中藍(lán)色的方塊和線條代表α-螺旋; 綠色的方塊和線條代表β-折疊; 黃色的方塊和線條代表無規(guī)則卷曲; 紅色的方塊和線條代表延伸鏈Fig. 2 Predicted secondary structure of DEAD-box protein. (a) LlDEAD12; (b) LlDEAD32; (c) LlDEA43; (d) LlDEAD65.Blue squares and lines in the figure represent α-helices; green squares and lines represent β-sheets; yellow squares and lines represent random coils; red squares and lines represent extended chains

LlDEAD12 的三級結(jié)構(gòu)以Pdcd4-eIF4A 的晶體結(jié)構(gòu)為模板構(gòu)建模型, 序列相似度為 80.49%, 預(yù)測結(jié)果質(zhì)量較高; LlDEAD32 以4A-III 過渡態(tài)EJC的晶體結(jié)構(gòu)為模板構(gòu)建模型, 序列相似度為78.22%, 預(yù)測結(jié)果較好; LlDEAD43 以ATP 依賴性DEAD-box RNA 解旋酶CshA 為模板, 序列相似度為36.06%, 預(yù)測質(zhì)量較差; LlDEAD65 以ATP 依賴性DEAD-box RNA 解旋酶DHH1 為模型, 序列相似度為70.62%, 預(yù)測質(zhì)量較好。這4 個蛋白的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測主要包括α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲這4 種結(jié)構(gòu)(圖3), 預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果一致。

圖3 DEAD-box 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 3D structure prediction of DEAD-box protein

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測

跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測表明 LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43 和LlDEAD65 均不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽, 說明這4 個蛋白均屬于非分泌蛋白(圖4); 并且這4個蛋白N-端位于細(xì)胞質(zhì)中側(cè)膜的總概率分別為0.00281、0.00528、0.00074、0.00413(圖5)。

圖4 DEAD-box 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測藍(lán)色線條表示該氨基酸序列在膜內(nèi)的可能性為0, 在膜外的可能性為100%Fig. 4 Predicted transmembrane structure of DEAD-box protein. The blue line in the figure indicates that the probability of the amino acid sequence in the membrane is 0, and the probability of being outside the membrane is 100%.

圖5 DEAD-box 蛋白的信號肽預(yù)測Fig. 5 Signal peptide prediction of DEAD-box protein

2.5 糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

根據(jù)糖基化位點(diǎn)的預(yù)測分析(圖6), LlDEAD12在355 號位上有一個糖基化位點(diǎn), LlDEAD32 在296位上有一個糖基化位點(diǎn), LlDEAD43 在229、358 和413號位上分別有一個糖基化位點(diǎn), LlDEAD65 在166和358 號位上各有一個糖基化位點(diǎn)。

圖6 DEAD-box 蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig. 6 Predicted glycosylation and phosphorylation sites of DEAD-box proteins

LlDEAD12一共有11個絲氨酸磷酸化位點(diǎn), 16個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn); LlDEAD32 一共有18 個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、17 個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、2 個酪氨酸磷酸化位點(diǎn);LlDEAD43 一共有36 個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、18 個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn); LlDEAD65 一共有17 個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、13 個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、7 個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

2.6 蛋白多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化

比較分析紅欖李 LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43 和LlDEAD65 與其他植物的DEAD-box家族蛋白的親緣關(guān)系, 表明與LlDEAD12 進(jìn)化關(guān)系最近的植物是馬尾松的eIF4A2, 和LlDEAD32 進(jìn)化關(guān)系最近的是巨桉的eIF4A3, LlDEAD43 進(jìn)化關(guān)系最近的是石榴的RH47(圖7)。

圖7 DEAD-box 蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系分析此分子進(jìn)化樹是利用MEGA X 進(jìn)行構(gòu)建的。分支上的數(shù)值表示可信度為1000 次重復(fù)節(jié)點(diǎn)的BootstrapFig. 7 Evolutionary relationship analysis. This molecular phylogenetic tree was constructed using MEGA X. The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1000 replication

2.7 特異性表達(dá)分析

在各組織的特異性表達(dá)中,LlDEAD12和LlDEAD32在葉中高表達(dá),LlDEAD43和LlDEAD65在莖和花中高表達(dá), 在花中的表達(dá)量略高于莖中,且這4 個基因在根中都不表達(dá)(圖8)。在紅欖李響應(yīng)低溫脅迫的過程中, 這4 個基因的表達(dá)量都顯著低于常溫條件下的表達(dá)量, 且隨處理溫度的降低, 表達(dá)量降低(圖9)。

圖8 DEAD-box 基因在不同組織的相對表達(dá)水平不同字母表示具有顯著性差異(P＜0.05)Fig. 8 Relative expression levels of DEAD-box genes in different tissues. a, b, c indicate significant differences in P＜0.05

圖9 DEAD-box 基因在不同溫度下的相對表達(dá)水平第1 處理溫度為8/5 ℃; 第2 組處理溫度為15/12 ℃; 第3 組處理溫度為25/23 ℃; 第4 組處理溫度為34/30℃。不同字母表示具有顯著性差異(P＜0.05)Fig. 9 Relative expression levels of DEAD-box genes at different temperatures. Group 1 treated at 8/5°C; Group 2 treated at 15/12°C; Group 3 treated at 25/23°C; Group 4 treated at 34/30°C. a, b, c indicate significant difference in P＜0.05

3 討論

DEAD-box 基因在細(xì)胞中的位置與其發(fā)揮的生理功能密不可分(鐵原毓 等, 2021)。在前人的研究中, PMH1(AtRH9)和PMH2 作為一種線粒體蛋白,在低溫脅迫下能夠通過形成RNA 的高分子蛋白復(fù)合體來維持線粒體功能的穩(wěn)定(Cordin et al, 2006;Matthes et al, 2007; K?hler et al, 2010)。通過亞細(xì)胞定位紅欖李LlDEAD43 和LlDEAD65 位于線粒體中,推測其功能可能與PMH1 和PMH2 相近, 維持低溫脅迫后植物體中線粒體行使正常的功能。已有研究表明, 位于細(xì)胞核邊緣的AtRH38 與核孔復(fù)合體的成員相互作用, 參與mRNA 從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸, 在低溫脅迫中起積極作用(Gong et al, 2005;Linder et al, 2011; Braud et al, 2012); 位于細(xì)胞核的ZmDRH1 通過與RNA 結(jié)合蛋白MA16 相互作用, 在核糖核蛋白的組成與核糖體RNA 的代謝過程中發(fā)揮作用(Li et al, 2001; Seki et al, 2001)。紅欖李LlDEAD32 的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核上, 推測其可能參與核糖體的生物發(fā)生。定位于葉綠體的DEAD-box 基因AtRH39 與葉綠體調(diào)控的光合蛋白的翻譯相關(guān), AtRH39 的突變體會表現(xiàn)出葉片失綠(Nishimura et al, 2010); 同樣位于葉綠體的RH3 和RH22 參與葉綠體中核糖體的組裝, 在質(zhì)體分化成含有葉綠素的葉綠體中具有重要作用, 是植物幼苗進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)(Chi et al, 2012; Asakura et al,2012; Nawaz et al, 2018b)。紅欖李LlDEAD12 位于細(xì)胞質(zhì), 可能參與 mRNA 的加工和蛋白的合成(Linder et al, 2011)。為了驗(yàn)證亞細(xì)胞定位預(yù)測的正確性以及功能預(yù)測的可靠性, 后續(xù)會通過亞細(xì)胞定位分析的方法加以確定。

DEAD-box 蛋白在植物的生長發(fā)育過程中通過磷酸化修飾來發(fā)揮自身的作用(Webster et al, 1991;op den Camp, 1998; Vashisht et al, 2005; Linder,2006); 在植物受到逆境脅迫形成應(yīng)激顆粒的過程中也涉及到eIF2α 的磷酸化修飾(Anderson et al, 2006;Mazroui et al, 2006), 表明DEAD-box 蛋白自身功能的實(shí)現(xiàn)受到其他調(diào)控因子的調(diào)控。在對修飾位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果中, 這4 個蛋白含有多個糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn), 表明這4 個RNA 解旋酶也是通過多種修飾作用后發(fā)揮作用。 通過功能域的預(yù)測,LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43、LlDEAD65不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽, 表明這4 個蛋白是在各自存在的細(xì)胞器中發(fā)揮作用的非分泌蛋白。

通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析, LlDEAD12 與馬尾松的eIF4A2 具有較近的親緣關(guān)系, LlDEAD32 與巨桉的eIF4A3 具有較近親緣關(guān)系, LlDEAD43 與石榴的RH47 具有較近親緣關(guān)系。這些具有較近親緣關(guān)系的物種的原產(chǎn)地均為熱帶、亞熱帶地區(qū)(Oberschelp et al, 2020; Ren et al, 2020; Ge et al, 2021; Chen et al,2021), 而紅欖李是典型的分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)的植物, 表明地理位置相近的物種的基因序列具有較高的相似性, 環(huán)境是影響基因進(jìn)化的另一重要因素(Zhang et al, 2016)。

對紅欖李的4 個基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 分析, 發(fā)現(xiàn)各個基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。LlDEAD12和LlDEAD32在葉中高表達(dá), 其功能可能與TCD33 的功能相似, 參與低溫脅迫下植物葉綠體的發(fā)育和葉綠體核糖體的組裝(孔榮榮, 2019)。LlDEAD43和LlDEAD65在莖和花中高表達(dá), 在花中的表達(dá)量略高于莖, 其功能可能與花發(fā)育相關(guān)(Western et al, 2002)。不同溫度處理下的實(shí)時熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn), 各個基因的表達(dá)量具有很大區(qū)別,低溫脅迫的程度越嚴(yán)重, 基因的表達(dá)量越低。與25 ℃/23 ℃的培養(yǎng)條件相比, 紅欖李受到15/12℃的低溫脅迫時LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43、LlDEAD65的表達(dá)量分別降低了7.59、8.73、7.94、5.74 倍, 受到更嚴(yán)重的低溫脅迫(8 ℃ /5 ℃)時分別降低了34.93、31.41、60.17、28.35 倍。這與前人在擬南芥、番茄等物種中對DEAD-box 基因的研究相反(Seki et al, 2001; Cordin et al, 2006; Matthes et al,2007; Kim et al, 2008), 但與擬南芥中發(fā)現(xiàn)的At5g08610 及At1g59990 兩個基因在冷脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào)的研究結(jié)果相同(Kreps et al,2002), 造成這種結(jié)果的原因可能是物種間的差異性產(chǎn)生的。

通過上述研究證明,LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43和LlDEAD65在紅欖李中參與了對莖、葉、花、果等組織器官的調(diào)控以及對低溫脅迫的響應(yīng), 為紅欖李的抗寒研究提供了方向。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中, 有必要通過轉(zhuǎn)基因的方法對這些基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證, 進(jìn)一步揭示其在低溫脅迫響應(yīng)過程中的分子機(jī)制。