王昆艷，官會(huì)林, 2，趙林艷，李雙麗，魏富剛，楊紹周，宋洪川，孫世中，徐武美

(1. 云南師范大學(xué)高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測研究站，昆明 650500；2. 云南師范大學(xué) 云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；3. 文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司，云南 文山 663000)

【研究意義】三七(Panaxnotoginseng)是中國著名中藥材，又名田七，為傘形目五加科人參屬植物，分布范圍狹窄，主要分布在北緯23°～24°，東經(jīng)104°～107°，在云南、廣西等地存在一定范圍的人工種植區(qū)[1]。三七主要以根部為藥用部分，具有散瘀止血，消腫定痛之功效，對(duì)心腦血管系統(tǒng)疾病防治、增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤等有很好的療效[2]。近年來，三七的市場需求量呈持續(xù)上升趨勢。連作障礙在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在，主要表現(xiàn)在同一作物或近緣種連作后，即使在正常管理的情況下，也會(huì)出現(xiàn)作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣等現(xiàn)象，其在生態(tài)學(xué)研究中稱之為“負(fù)密度制約”[3]。三七存在著嚴(yán)重的連作障礙問題，其連作后常出現(xiàn)病蟲害危害嚴(yán)重，甚至絕收的情況，嚴(yán)重影響其可持續(xù)生產(chǎn)。【前人研究進(jìn)展】導(dǎo)致三七連作障礙的主要因素有土壤理化環(huán)境惡化[4]、化感自毒作用[5]、根際微生物群落變化以及致病菌侵害[6]等；由于三七連作障礙的成因復(fù)雜，目前還無法完全消除，但是可以通過一些農(nóng)藝措施對(duì)連作地土壤進(jìn)行改良，使其連作障礙問題得以緩解[7]。生物炭(Biochar)是生物質(zhì)材料如木屑、農(nóng)作物秸稈、動(dòng)物糞便等在缺氧條件下，一定溫度環(huán)境中(<700 ℃)熱解得到的富碳材料[8]，被認(rèn)為是亞馬遜盆地幾千年來仍維持一定土壤肥力的主要成分[9]。由于制作生物炭的原材料來源廣泛、工藝簡單、用途眾多，已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用[10]。有研究表明，生物炭可有效改良土壤理化性質(zhì)[11]、調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)[12]、減少土傳病害并提高作物產(chǎn)量等[13]；根據(jù)Ladygina和Rineau的研究[14]，生物炭促進(jìn)作物抵抗病害的主要機(jī)制包括①為植物提供養(yǎng)分，促進(jìn)植物生長與抵抗病害；②改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，通過種間互作關(guān)系，起到抑制致病菌生長的作用；③吸附致病菌分泌的有害物質(zhì)，如胞外酶、有機(jī)酸等；④生物炭中可能包含有抑制致病菌生長的可溶性成分；⑤生物炭可能誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)，影響作物根際分泌，提高作物對(duì)致病微生物的抵抗能力等。因此，生物炭作為一種新型土壤改良材料，在改良耕地土壤質(zhì)量的同時(shí)，有望對(duì)連作障礙問題起到緩解與修復(fù)作用。【本研究切入點(diǎn)】當(dāng)前，已有研究利用生物炭對(duì)蘋果[13]、黃瓜[15]等作物連作土壤進(jìn)行改良修復(fù)，并取得了明顯效果，然而針對(duì)名貴藥材三七的研究，還鮮見報(bào)道。本研究以5年三七連作地為對(duì)象，通過設(shè)置田間對(duì)照試驗(yàn)，研究施加生物炭對(duì)三七連作土壤的改良修復(fù)效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究施用生物炭對(duì)三七連作土壤理化性質(zhì)、酶活性、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與幼苗存活率的影響，研究結(jié)果可為三七可持續(xù)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)設(shè)置

田間試驗(yàn)在文山三七科技示范園內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)區(qū)土壤類型為酸性紅壤，三七連作5年，試驗(yàn)前統(tǒng)一進(jìn)行翻耕整地。試驗(yàn)小區(qū)面積為1.5 m × 2 m=3 m2，稻殼炭施用量為1 kg/m2(DB)，以不施炭為對(duì)照(CK)，共17組同地對(duì)照試驗(yàn)。將稻殼炭與0～15 cm耕作層充分混勻、澆水，2周后移栽三七籽條。于2017年1月22日移栽三七籽條，行間距為15 cm×20 cm，每個(gè)小區(qū)種植112株(8株/行×14行)，用森林紅壤覆蓋約1 cm，再用松毛覆蓋土壤表面，移栽出苗后各小區(qū)進(jìn)行統(tǒng)一管理。本研究使用的生物炭由云南某肥料公司提供，以稻米殼為原料，炭化溫度為450 ℃，炭化時(shí)間為2 h，呈細(xì)粉末狀，pH為9.50，銨態(tài)氮含量為8.46 mg/kg，硝態(tài)氮含量為4.18 mg/kg，有效磷含量為348.72 mg/kg。

1.2 三七存活率調(diào)查與土樣采集

存活率調(diào)查：各試驗(yàn)小區(qū)三七籽條于3月初開始出苗，5—8月為土傳病害高峰期。因此，本研究于發(fā)病高峰末期的8月16日調(diào)查各小區(qū)三七存活率，并用五點(diǎn)法采集各小區(qū)0～15 cm耕作層土樣，自然風(fēng)干后用研缽研磨過篩，用于土壤理化性質(zhì)與酶活性分析。同時(shí)，采集鮮樣保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于細(xì)菌群落分析。本研究分別在對(duì)照組與試驗(yàn)組各采取4個(gè)土壤微生物樣品進(jìn)行高通量測序。

三七存活率(%)=(現(xiàn)存苗數(shù)/移栽苗數(shù))×100

1.3 土壤理化性質(zhì)與酶活性分析

土壤酶活性分析：土壤蛋白酶活性用茚三酮比色法進(jìn)行測定，多酚氧化酶活性用紫色沒食子素比色法進(jìn)行測定，蔗糖酶活性用3, 5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行測定，脲酶活性用靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行測定，磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法進(jìn)行測定[17-18]。

1.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

用DNA提取試劑盒(NucleoSpin Kit, Macherey-Nagel GmbH, Germany)提取三七連作土壤總DNA，細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)擴(kuò)增引物序列為338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)與806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。利用AMPure XP試劑盒(Beckman Coulter Life Sciences, USA) 對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行純化，并用QuantiFluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)(Promega, USA)進(jìn)行定量；用Illumina HiSeq 2500 PE250對(duì)純化后的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行高通量測序[19]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析施加稻殼炭對(duì)土壤理化性質(zhì)、酶活性與三七幼苗存活率的影響。利用Pearson相關(guān)分析探索不同土壤因子之間的關(guān)聯(lián)性；對(duì)于不服從正態(tài)分布的變量，在進(jìn)行相關(guān)分析時(shí)先進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。利用百邁客生物云平臺(tái)(http://www.biocloud.net/)計(jì)算不同土樣細(xì)菌OTU的相對(duì)多度信息與多樣性指數(shù)，用基于Bray-Curtis距離指數(shù)的非度量多維尺度分析(NMDS)、UPGMA (Unweighted pair-group method with arithmetic mean)聚類分析與相似性分析(Analysis of similarities)來探索不同土壤樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，用冗余分析(RDA)探索微生物群落變化與土壤理化因子間的關(guān)聯(lián)性。以上分析均用軟件SPSS 16.0和R軟件包“vegan”進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用稻殼炭對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析表明，施用稻殼炭顯著提高了三七連作土壤pH (t=6.80，P<0.01)、銨態(tài)氮(t=2.20，P<0.05)、有效磷(t=6.20，P<0.01)與有機(jī)質(zhì)含量(t=4.24，P<0.01)，對(duì)硝態(tài)氮含量的影響不顯著(t=-0.48，P=0.63) (圖1)。與對(duì)照相比較，施用1 kg/m2的稻殼炭使土壤pH均值提高了1.23，有效磷、銨態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量均值分別提高了29.31 mg/kg、2.35 mg/kg和0.98% (圖1)。

圖中所示為平均值±95%置信區(qū)間；CK為對(duì)照，DB為1 kg/m2稻殼炭處理，下同Error bar indicate mean ± 95% confidence interval;CK indicates the control group, DB indicates the treatment with 1 kg/m2 rice husk biochar, the same as below圖1 施用稻殼炭對(duì)三七連作地土壤理化性質(zhì)的影響Fig.1 Effects of rice husk biochar application on soil physicochemical properties under continuous cropping of P. notoginseng

2.2 施用稻殼炭對(duì)土壤酶活性的影響

施用稻殼炭對(duì)三七連作土壤脲酶(t=2.53，P<0.05)與多酚氧化酶(t=7.26，P<0.01)活性具有顯著影響。與對(duì)照相比較，施用1 kg/m2稻殼炭使土壤中的脲酶與多酚氧化酶活性分別提高了0.09和2.24 mg/g，而酸性磷酸酶、中性磷酸酶、蛋白酶與蔗糖酶活性均略有增加，但不顯著(圖2)。

圖2 施用稻殼炭對(duì)三七連作土壤酶活性的影響Fig.2 Effects of rice husk biochar application on soil enzyme activities under continuous cropping of P. notoginseng

2.3 施用稻殼炭對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

8個(gè)土壤樣品進(jìn)行高通量測序共獲得446 272條16S rRNA基因V3～V4區(qū)序列，以97%的相似性進(jìn)行劃分，得到1785個(gè)OTU，隸屬于32門、69綱、146目、259科、526屬與577種。在門分類水平上，三七連作土壤細(xì)菌的優(yōu)勢菌群為Bacteroidetes，Proteobacteria和Firmicutes，在試驗(yàn)組中占比分別為29.97%，28.26%與19.97%，而在對(duì)照組中的占比分別為31.61%，25.26%與20.16%(圖3-a)。此外，試驗(yàn)組Nitrospirae的相對(duì)多度(0.062%)顯著低于對(duì)照組(0.28%，P<0.01)。施用稻殼炭后，土壤中特有的OTU為65個(gè)，而對(duì)照組土壤中特有的OTU為88個(gè)(圖3-b)。與對(duì)照相比，施炭導(dǎo)致土壤細(xì)菌OTU豐富度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(PD，Phylogenetic diversity)均顯著降低(表1)。

表1 施用稻殼炭對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

a：門水平各細(xì)菌類群的相對(duì)多度，b：試驗(yàn)組(DB)與對(duì)照組(CK)共有與特有的細(xì)菌OTU數(shù)量a: Relative abundance of bacteria at the phylum level; b: The number of common and unique bacterial OTUs under CK and DB treatments圖3 施用生物炭對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響Fig.3 Effects of biochar application on the composition of soil bacterial community

NMDS分析與聚類分析結(jié)果表明，試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)菌群落具有明顯的聚集特征(圖4-a，圖4-b)；ANOSIM分析結(jié)果表明，組間細(xì)菌群落距離顯著高于組內(nèi)，表明施炭處理導(dǎo)致了土壤細(xì)菌群落分化(圖4-c)。冗余分析(RDA)表明，土壤pH、銨態(tài)氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)含量與細(xì)菌群落組成具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性(圖4-d)，表明施用稻殼炭后土壤環(huán)境的變化是導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。

a：NMDS分析結(jié)果，b：聚類分析結(jié)果，c：相似性分析結(jié)果，d：冗余分析結(jié)果a: The result of NMDS analysis, b: The result of clustering analysis, c: The result of the analysis of similarities, d: The result of redundancy analysis圖4 施用稻殼炭對(duì)三七連作土壤微生物群落分化的影響Fig.4 Effects of rice husk biochar application on the differentiation of soil bacterial community under continuous cropping of P. notoginseng

2.4 施用稻殼炭對(duì)連作三七幼苗存活率的影響

施用稻殼炭對(duì)連作三七幼苗存活率具有顯著影響(t=19.89，P<0.01)，對(duì)照組三七零星出苗后全部死亡，而施用稻殼炭后，三七幼苗存活率平均達(dá)到62.46%(圖5)，說明施用生物炭可有效提高連作地三七幼苗的存活率。

圖5 施用稻殼炭對(duì)連作三七幼苗存活率的影響Fig.5 Effects of rice husk biochar application on the survival rate of P. notoginseng seedlings under continuous cropping

3 討 論

3.1 施用稻殼炭與三七連作土壤理化性質(zhì)

本研究表明，施用稻殼炭顯著提高了三七連作土壤pH以及有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮與有效磷含量。由于生物炭灰分中含有大量鉀、鈉、鈣、鎂等礦質(zhì)元素的氧化物或碳酸鹽，其溶于水后一般呈堿性。大量研究證實(shí)，生物炭對(duì)酸性土壤具有較好的改良作用，如Yuan等[20]在酸性土壤中施加不同pH的生物炭，發(fā)現(xiàn)土壤pH的增加量與施加生物炭的pH呈顯著正相關(guān)。李貞霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，施用辣椒秸稈炭能顯著提高酸性土壤pH，當(dāng)施用量分別為0.5%、1.5%和2.5%時(shí)，土壤pH分別提高7.56%、30.73%和36.83%。本研究結(jié)果與其一致，表明施用生物炭可有效改善三七連作土壤酸化問題。

有機(jī)質(zhì)是土壤肥力的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在改良土壤結(jié)構(gòu)、促進(jìn)微生物生長代謝等方面具有重要作用。由于生物炭的原料來源主要是生物質(zhì)材料，包括農(nóng)作物秸稈、林業(yè)廢棄物、禽畜糞便等[25]。因此，施用生物炭可提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，同時(shí)改善土壤物理結(jié)構(gòu)與養(yǎng)分可利用性[26]。黃連喜等[27]研究發(fā)現(xiàn)，施用花生殼炭顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量與蔬菜產(chǎn)量。本研究表明，施用稻殼炭顯著提高了三七連作土壤有機(jī)質(zhì)含量，有助于改善由于連作導(dǎo)致的土壤板結(jié)等問題，提升土壤肥力。

3.2 施用稻殼炭與三七連作土壤酶活性

土壤酶主要來源于植物、土壤動(dòng)物與微生物的新陳代謝活動(dòng)和殘?bào)w分解，參與各種有機(jī)物質(zhì)的分解、合成與轉(zhuǎn)化，對(duì)于促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)，維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能具有重要意義[28]。李貞霞等[21]研究表明，土壤脲酶、蔗糖酶活性與辣椒秸稈炭添加量呈正相關(guān)，而酸性磷酸酶、蛋白酶、過氧化氫酶活性與其添加量之間相關(guān)性不顯著。此外，呂波等[29]揭示生物炭對(duì)黃棕壤和紅壤具有良好的改良效果，其顯著提高了土壤磷酸酶與脲酶活性，而對(duì)蔗糖酶活性的影響不顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，施用稻殼炭顯著提高了三七連作土壤脲酶與多酚氧化酶活性，然而，施用生物炭后土壤磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶等活性的提高不顯著，說明施用生物炭對(duì)這些酶活性的影響較小。

3.3 施用稻殼炭與三七連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

基于高通量測序的細(xì)菌群落分析表明，施加稻殼炭對(duì)三七連作土壤細(xì)菌群落組成具有顯著影響。生物炭具有較大的比表面積和孔隙結(jié)構(gòu)，且富含C、N、P、K等多種營養(yǎng)元素，有利于細(xì)菌的生長和繁殖。然而，也有研究表明，施用生物炭可促進(jìn)細(xì)菌種間競爭，對(duì)一些菌群的生長具有抑制作用，導(dǎo)致土壤總的細(xì)菌類群減少[30]。土壤環(huán)境對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化具有直接影響，如Zhao等[31]研究發(fā)現(xiàn)，施用煙桿炭對(duì)白及連作土壤理化因子具有直接影響，促進(jìn)了土壤細(xì)菌群落的演替變化，緩解了白及連作障礙，與本研究結(jié)果基本一致。這說明施用生物炭可有效調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，從而可能對(duì)三七連作障礙問題起到緩解作用。

3.4 施用稻殼炭與三七連作障礙

生物炭作為新型土壤改良材料，近年來已開展了大量研究，其在緩解作物連作障礙等方面，也逐漸引起了研究人員的關(guān)注。王玫等[13]研究生物炭配施有機(jī)肥對(duì)蘋果連作障礙的影響，發(fā)現(xiàn)其顯著促進(jìn)了蘋果幼苗的生長，并對(duì)致病菌尖孢鐮刀菌產(chǎn)生抑制作用。武春成等[15]研究發(fā)現(xiàn)，施用適量生物炭提高了土壤pH和養(yǎng)分含量，改善了微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了黃瓜的生長和產(chǎn)量的提高。本研究表明，施用稻殼炭有效改善了三七連作土壤理化環(huán)境，調(diào)節(jié)了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高了三七幼苗存活率，對(duì)其連作障礙問題起到了一定的緩解作用，然而其內(nèi)在機(jī)理，如化感物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化等，還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

施用稻殼炭顯著提高了三七連作土壤pH與有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、有效磷含量，以及脲酶、多酚氧化酶活性，而對(duì)硝態(tài)氮含量與磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶活性的影響不顯著。高通量測序分析表明，施用生物炭對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著的調(diào)節(jié)作用。對(duì)照組三七零星出苗后全部死亡，而試驗(yàn)組三七幼苗存活率平均達(dá)到了62.46%。本研究為三七種植土壤改良與連作障礙消減提供了試驗(yàn)依據(jù)。