王福厚，李風(fēng)云，朱志芳，葛生虎

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733006；2.臨西縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邢臺(tái) 054900；3.邢臺(tái)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邢臺(tái) 054000；4.河北銘諸生物科技有限公司，河北 邢臺(tái) 054000）

豬乙腦病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）為黃病毒科、黃病毒屬重要成員，屬于單股正鏈RNA病毒。JEV可感染多種動(dòng)物，其中包括豬、蚊子、犬、兔和馬等，對(duì)我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展造成巨大的威脅[1]。此外，JEV可感染人，該病原的流行嚴(yán)重威脅東南亞和西太平洋等地區(qū)居民健康，每年近300萬人生活在JEV流行地區(qū)，且具有高度感染風(fēng)險(xiǎn)[2]。大部分人感染JEV不會(huì)表現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，但少部分人會(huì)出現(xiàn)急性腦炎，且病死率較高（20%～30%）。JEV感染豬群后可導(dǎo)致母豬出現(xiàn)繁殖障礙、公豬睪丸炎和仔豬神經(jīng)障礙等，且JEV可在豬場(chǎng)形成“豬-蚊-人”傳播模式，因此在豬場(chǎng)開展滅蚊滅鼠工作對(duì)JEV的防控極為重要。

近年來，隨著豬乙腦弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用，同時(shí)豬場(chǎng)生物安全水平提高減少了蚊蟲滋生幾率，國內(nèi)豬場(chǎng)發(fā)生JEV暴發(fā)或流行很少見。值得注意的是，蚊子在JEV的傳播過程中發(fā)揮重要作用，但蚊蟲一般在夏季和秋季滋生，而部分豬場(chǎng)忽視JEV的流行和危害，在夏季和秋季未對(duì)豬群免疫接種JEV疫苗，這無疑對(duì)豬群和豬場(chǎng)工作人員健康會(huì)造成巨大的威脅。為此，筆者分享一起2022年10月初接診的一例由JEV感染引起母豬繁殖障礙的診斷與防控案例，旨在提高豬場(chǎng)工作人員對(duì)該病的防控意識(shí)，促進(jìn)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

1 豬場(chǎng)發(fā)病情況

山東省莘縣某小型豬場(chǎng)飼養(yǎng)繁殖母豬100余頭。豬場(chǎng)負(fù)責(zé)人王某表示，母豬群于2022年6—7月配種，至10月初已有40余頭母豬產(chǎn)仔，其中20頭繁殖母豬死胎率較高（圖1左），個(gè)別母豬產(chǎn)木乃伊胎。母豬無明顯臨床癥狀，但其所產(chǎn)胎盤發(fā)紅，剖檢死胎可見腦水腫且積液多，甚至液化；腎臟出血、脾臟和肝臟腫大等，且淋巴結(jié)出血（圖1右）。

圖1 繁殖母豬流產(chǎn)死胎（左）與死胎剖檢（右）

咨詢豬場(chǎng)負(fù)責(zé)人得知，該場(chǎng)發(fā)病前已對(duì)豬群普免豬偽狂犬病弱毒疫苗、豬瘟疫苗（亞單位疫苗）、豬口蹄疫疫苗、豬細(xì)小病毒疫苗等。且少數(shù)母豬出現(xiàn)繁殖障礙后對(duì)所有豬群緊急免疫豬藍(lán)耳病弱毒疫苗和抗生素治療，但效果不佳。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果

為確診發(fā)病原因，豬場(chǎng)負(fù)責(zé)人將2頭流產(chǎn)胎兒低溫送至河北銘諸生物科技有限公司進(jìn)行病原診斷。無菌采集流產(chǎn)胎兒腦組織、腎臟、淋巴結(jié)、肺臟、肝臟和臍帶血等樣品。超凈工作臺(tái)下用滅菌刀和眼科剪取少量淋巴結(jié)、腦組織、肺臟和臍帶血等置于滅菌研缽內(nèi)。加入少量無菌生理鹽水，研磨后用無菌紗布過濾，取上清液用于后續(xù)細(xì)菌分離鑒定和病毒的分子鑒定。

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

在無菌環(huán)境下，用火焰灼燒過的接種環(huán)蘸取少量上清液在鮮血固體瓊脂培養(yǎng)基表面劃線，其后將平板倒置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16～24 h，觀察平板表面是否長(zhǎng)出疑似菌落。結(jié)果未在平板上發(fā)現(xiàn)疑似菌落，說明該場(chǎng)母豬出現(xiàn)繁殖障礙不是細(xì)菌性病原感染引起。

2.2 病毒性病原診斷結(jié)果

采用商業(yè)化DNA/RNA提取試劑盒提取上清液基因組（DNA與RNA混合物），其后采用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將基因組中RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。操作流程均參考試劑盒說明書，將獲得的cDNA基因組保存于-20 ℃，待檢。

以cDNA或DNA基因組為模板，使用商業(yè)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒分別檢測(cè)基因組中是否存在豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）和豬乙腦病毒（JEV）核酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3份樣品中均未檢測(cè)到PCV2、CSFV、PRRSV、PRV和PPV核酸，這3份樣品JEV核酸檢測(cè)對(duì)應(yīng)Ct值分別為30.233、24.684和26.707。根據(jù)試劑盒提供說明書，樣品Ct值≤35則可判定為陽性，因此可判定3份樣品均為JEV核酸陽性。

綜合病豬發(fā)病情況和實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，筆者判定該場(chǎng)母豬出現(xiàn)繁殖障礙類疾病是由JEV感染引起。

2.3 JEV陽性樣品E基因序列擴(kuò)增與分析

當(dāng)前，全世界JEV流行株可分為5種基因型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型），國內(nèi)存在Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型3種基因型JEV毒株，其中Ⅰ型為主要流行株[3]。為確定該豬場(chǎng)流行JEV毒株基因型，應(yīng)豬場(chǎng)負(fù)責(zé)人要求，筆者采用RT-PCR法擴(kuò)增1份Ct值為24.684的JEV陽性樣品E基因序列。引物序列為：JEV-E-F：5'-TTAACTGTCTGGGAATGGG-3'；JEV-E-R：5'-GGCATGCACATTGTCGCTAA-3'，RT-PCR產(chǎn)物大小約1 500 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。RT-PCR體系（25.0 μL）包括2×PCR預(yù)混液12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2.0 μL及無RNA酶水9.5 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共設(shè)置35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后取陽性產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增獲得JEV E基因序列RT-PCR產(chǎn)物大小約1 500 bp，與陽性對(duì)照一致，陰性對(duì)照未擴(kuò)充出目的片段，說明我們成功擴(kuò)增出JEV E基因片段。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明：本試驗(yàn)擴(kuò)增獲得序列大小為1 497 bp，可編碼499個(gè)氨基酸。與GenBank收錄的不同基因型JEV毒株進(jìn)行同源性比較，該分離株E基因與GⅠ-b亞型毒株核苷酸序列相似性最高（為99.9%），與其它基因型毒株對(duì)應(yīng)序列同源性較低，均低于95.3%；且與目前廣泛使用的JEV疫苗株（GⅢ型）E基因序列同源性僅87.9%，提示該場(chǎng)暴發(fā)的JEV流行株屬于GⅠ-b亞型（圖3）。

圖2 JEV陽性樣品E基因序列RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳

圖3 JEV陽性樣品（SD-LX-1）E基因核苷酸序列與參考毒株同源性比對(duì)結(jié)果

3 討論

流行性乙型腦炎又稱為日本腦炎，是由日本乙型腦炎病毒（JEV）感染引起的一種人畜共患性疾病。JEV屬于重要的蟲媒病毒，能夠感染豬、人和蚊蟲等多種動(dòng)物和昆蟲。JEV可在豬場(chǎng)中以“豬-蚊-人”為閉環(huán)形式流行，給豬群和豬場(chǎng)工作人員健康造成巨大的威脅。2013年，山東省部分地區(qū)曾暴發(fā)乙型腦炎疫情，且當(dāng)前有研究表明JEV仍廣泛流行于山東省部分地區(qū)[4]。蚊蟲對(duì)JEV的流行極為重要，因此JEV在豬場(chǎng)暴發(fā)時(shí)期多為夏季和秋季，故豬場(chǎng)在夏季和秋季對(duì)豬群免疫接種JEV疫苗對(duì)該病的防控十分重要。

然而，相較于其它病毒性疾病（如腸道病毒引起腹瀉和PRRSV、PCV2等病原感染引起繁殖障礙）而言，JEV感染所致母豬繁殖障礙相關(guān)案例很少，這導(dǎo)致養(yǎng)殖企業(yè)（戶）經(jīng)常忽視對(duì)JEV的防控。若JEV流行區(qū)域的豬場(chǎng)在夏季和秋季未對(duì)豬群免疫接種JEV疫苗，豬群受JEV感染威脅則很大，繼而會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2022年10月初，山東莘縣某小型豬場(chǎng)發(fā)生疫情，結(jié)合臨床癥狀觀察和實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果最終判定該豬場(chǎng)母豬發(fā)生繁殖障礙疾病是由JEV感染引起。結(jié)合該場(chǎng)對(duì)豬群免疫程序信息，我們判定該場(chǎng)暴發(fā)JEV可能是未及時(shí)對(duì)豬群免疫JEV疫苗所致。進(jìn)一步擴(kuò)增并分析該豬場(chǎng)JEV陽性樣品E基因序列，發(fā)現(xiàn)該毒株與GⅠ-b型JEV參考株同源性最高，說明該豬場(chǎng)流行JEV GⅠ-b型毒株。

目前暫無針對(duì)乙型腦炎有效的治療藥物，因此在臨床上主要依靠疫苗免疫對(duì)該病進(jìn)行防控。為此，筆者建議該場(chǎng)采取以下措施：1）淘汰出現(xiàn)睪丸炎等癥狀的公豬；淘汰母豬全窩弱仔或木乃伊胎；2）提高豬場(chǎng)生物安全水平，采用物理和化學(xué)方法進(jìn)行滅蚊；及時(shí)清理污水和積水等，或在污水（積水）中撒殺滅蚊蟲藥物；3）對(duì)所有豬群緊急免疫接種JEV弱毒疫苗（SA14-14-2），免疫后期應(yīng)檢測(cè)豬群抗體水平，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整免疫程序；同時(shí)定期采集疑似出現(xiàn)繁殖障礙母豬或流產(chǎn)胎兒組織樣品，送至專業(yè)的診斷實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)淘汰感染JEV豬群，以期凈化該病；4）給予豬群營(yíng)養(yǎng)豐富的全價(jià)飼料，在飼糧中添加黃芪多糖等可提高豬群免疫力的中草藥。