王福厚，李風(fēng)云，葛生虎

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733006；2.臨西縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邢臺(tái) 054900；3.河北銘諸生物科技有限公司，河北 邢臺(tái) 054000）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）為已知最小DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬重要成員。PCV2在全世界廣泛分布，該病原感染可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)綜合征、豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病及母豬繁殖障礙等，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[1]。此外，PCV2感染可引起病豬出現(xiàn)免疫抑制，導(dǎo)致其容易繼發(fā)感染其它病原，從而造成更加嚴(yán)重的臨床癥狀和病死率[2]。

PCV2基因組大小為1 766～1 768 nt，其主要包含2個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），其中ORF2基因可編碼Cap蛋白，參與病毒入侵宿主細(xì)胞和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體等[3]。此外，ORF2是PCV2基因組中變異程度最高的基因，根據(jù)PCV2 ORF2基因序列特征，國(guó)內(nèi)外流行的PCV2毒株可分為8個(gè)基因亞型（PCV2a-PCV2h）[4]。嚴(yán)世杰等調(diào)查發(fā)現(xiàn)2015—2019年河北秦皇島及周邊地區(qū)PCV2流行毒株主要為PCV2b和PCV2d，其中也有少量PCV2e流行[1]；趙云環(huán)等調(diào)查發(fā)現(xiàn)河北部分地區(qū)存在3種不同PCV2基因亞型（PCV2a、PCV2b和PCV2d）[5]。為初步了解河北省邢臺(tái)市及周邊地區(qū)PCV2流行情況，研究于2021年10月至2022年6月共采集疑似感染PCV2病料樣品205份，調(diào)查PCV2分子流行病學(xué)特點(diǎn)；同時(shí)擴(kuò)增并分析部分PCV2陽(yáng)性樣品ORF2基因序列，旨在為該地區(qū)PCV2的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年10月至2022年6月從河北省邢臺(tái)市及周邊地區(qū)的79個(gè)豬場(chǎng)采集疑似感染PCV2病豬臨床樣品（組織或血清樣品等）共205份。

對(duì)于組織樣品的采集：豬場(chǎng)工作人員解剖病豬后，無(wú)菌采集淋巴結(jié)、肺臟、扁桃體和腎臟等組織樣品置于潔凈封口袋內(nèi)，標(biāo)記相關(guān)信息后低溫送至河北銘諸生物科技有限公司。對(duì)于血清樣品的采集：豬場(chǎng)工作人員通過(guò)頸靜脈或前腔靜脈采集豬只靜脈血3～5 mL/頭；待血清析出后，取血清樣品置于1.5 mL離心管中，標(biāo)記相關(guān)信息后低溫送至河北銘諸生物科技有限公司。

1.2 樣品處理及PCV2核酸檢測(cè)

用無(wú)菌手術(shù)刀切取少量組織樣品，切碎后加入滅菌PBS溶液后充分研磨，反復(fù)凍融后低溫高速離心。取200 μL上清液（或血清）用于DNA基因組提取，提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒（于武漢科前生物股份有限公司購(gòu)買）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后用40 μL無(wú)核酸水洗脫DNA基因組，保存于-20℃，待檢。

采用商業(yè)化熒光定量PCR試劑盒（湖南冠牧生物科技有限公司產(chǎn)品）檢測(cè)待檢組織樣品中是否存在PCV2核酸，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒提供說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每次檢測(cè)試驗(yàn)中均設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各2個(gè)，其中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照核酸分別為無(wú)核酸水和已知PCV2核酸。反應(yīng)結(jié)束后，若樣品對(duì)應(yīng)CT值低于35，則判定為陽(yáng)性；若CT值高于40，則判定為陰性；若CT值為35～40，則為可疑。

1.3 PCV2 ORF2基因序列擴(kuò)增與分析

取10份PCV2核酸陽(yáng)性且CT值低于25的樣品用于ORF2基因序列擴(kuò)增。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增PCV2 ORF2基因序列引物，PCR擴(kuò)增體系（25.0 μL）包括2×PCR預(yù)混液12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA基因組模板2.0 μL及無(wú)核酸水9.0 μL；反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 45 s，共設(shè)置35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃7 min。反應(yīng)結(jié)束后取少量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，其后將陽(yáng)性樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載不同基因型PCV2毒株（PCV2a-PCV2f）ORF2基因序列，采用DNASTAR軟件分析本文獲得序列與參考毒株ORF2核苷酸和氨基酸序列同源性；采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，初步分析本文獲得PCV2毒株基因亞型。

2 調(diào)查結(jié)果

2.1 河北省部分地區(qū)PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

本研究于2021年10月至2022年6月從河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)79個(gè)豬場(chǎng)采集疑似感染PCV2病料共205份，采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)樣品中PCV2分子流行病學(xué)特征。結(jié)果如表1所示，共41個(gè)豬場(chǎng)中含有PCV2核酸陽(yáng)性豬，場(chǎng)陽(yáng)性率為51.90%（41/79）；67份樣品為PCV2核酸陽(yáng)性，平均檢出率為32.68%；進(jìn)一步按區(qū)域劃分，可見(jiàn)不同地區(qū)PCV2場(chǎng)陽(yáng)性率為22.22%～63.64%，樣品陽(yáng)性率為20.83%～43.33%，其中石家莊來(lái)源樣品PCV2檢出率相較其它地區(qū)更低。

表1 河北省部分地區(qū)PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.2 不同類型豬場(chǎng)及臨床癥狀樣品PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

將送檢樣品按照豬場(chǎng)類型（小型豬場(chǎng)、中型豬場(chǎng)和集約化豬場(chǎng)）進(jìn)行區(qū)分，如表2所示，可見(jiàn)小型豬場(chǎng)PCV2場(chǎng)陽(yáng)性率較中型豬場(chǎng)和集約化豬場(chǎng)高，分別為100.0%（8/8）、58.33%（14/24）和40.43%（19/47）；小型豬場(chǎng)、中型豬場(chǎng)和集約化豬場(chǎng)來(lái)源樣品PCV2檢出率分別為61.90%（13/21）、42.67%（32/75）和20.18%（22/109）。PCV2感染可引起仔豬出現(xiàn)皮炎腎病綜合征、繁殖母豬流產(chǎn)、死胎等臨床癥狀，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)表現(xiàn)皮炎腎病綜合征仔豬、繁殖障礙母豬和其它癥狀豬群組織樣品PCV2檢出率分別為45.45%（30/66）、51.85%（14/27）和20.54%（23/112）。

表2 不同類型豬場(chǎng)及臨床癥狀樣品PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.3 PCV2 ORF2基因序列分析結(jié)果

采用PCR法擴(kuò)增10份PCV2陽(yáng)性樣品ORF2基因序列并測(cè)序與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10份PCV2陽(yáng)性樣品ORF2基因核苷酸序列長(zhǎng)度均為705 nt，其編碼Cap蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度為235 aa；序列分析結(jié)果表明，10份樣品ORF2基因核苷酸和對(duì)應(yīng)氨基酸序列同源性分別為96.4%～100.0%和98.7%～100.0%，其中6份樣品與已知PCV2d毒株ORF2基因序列同源性最高；4份樣品與已知PCV2b毒株ORF2基因序列同源性最高。進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，6份樣品與PCV2d參考株聚為同一分支，4份樣品則與PCV2b參考株同屬一個(gè)分支。

3 討論

PCV2在我國(guó)流行情況十分嚴(yán)重，同時(shí)由PCV2感染引起的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了巨大的威脅。此外，PCV2感染可引起生豬出現(xiàn)免疫抑制，如淋巴系統(tǒng)損失和免疫缺陷等，導(dǎo)致病豬更容易感染其它病原，從而造成多種病原混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致疾病診斷與防控更加困難。PCV2具有多種基因型，且不同地區(qū)流行PCV2基因型種類和比例具有很大差異，如2019—2020年北京市部分地區(qū)流行PCV2毒株包括PCV2a、PCV2b和PCV2d，所占比例分別為33.33%（3/9）、55.56%（5/9）和11.11%（1/9）[7]；安徽地區(qū)流行PCV2毒株則主要為PCV2b和PCV2d，所占比例分別為36.36%（8/22）和63.64%（14/22）[8]。因此，了解PCV2流行情況和基因型特征對(duì)該病的防控十分重要。

為防控非洲豬瘟的流行，諸多豬場(chǎng)已提高生物安全水平，這同時(shí)也抑制了其它傳染病的流行。盡管如此，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)河北省部分地區(qū)PCV2豬場(chǎng)陽(yáng)性率和樣品陽(yáng)性率分別為51.90%和32.68%，其中衡水市PCV2場(chǎng)陽(yáng)性率和樣品陽(yáng)性率分別高達(dá)58.82%和43.33%，雖然本研究所調(diào)查豬場(chǎng)和樣品數(shù)量偏少，但其結(jié)果仍可提示目前PCV2廣泛流行于被調(diào)查地區(qū)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)小型豬場(chǎng)無(wú)論是PCV2場(chǎng)陽(yáng)性率還是樣品陽(yáng)性率均高于中型豬場(chǎng)和集約化豬場(chǎng)，這可能是由于中型豬場(chǎng)和集約化豬場(chǎng)更加重視科學(xué)免疫、定期抗體和抗原監(jiān)測(cè)、提高豬場(chǎng)生物安全管理水平等，而大部分小型豬場(chǎng)可能會(huì)忽視這些，使得小型豬場(chǎng)豬群感染病原幾率更高，特別是這些容易出現(xiàn)隱性感染的病原，如PCV2和豬繁殖與呼吸綜合征病毒[9]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)未表現(xiàn)PCV2相關(guān)疾病癥狀豬群病原檢出率也較高，為20.54%（23/112），說(shuō)明PCV2在豬群的隱性感染情況十分嚴(yán)重，同時(shí)也提示豬場(chǎng)對(duì)PCV2的抗原監(jiān)測(cè)十分重要。

為確定河北省部分地區(qū)流行PCV2毒株的基因型，我們對(duì)10份PCV2陽(yáng)性樣品ORF2基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的10份PCV2陽(yáng)性樣品中僅檢出有PCV2b和PCV2d，其所占比例分別為40%和60%，提示PCV2b和PCV2d是河北省部分地區(qū)流行主要基因型。但其它學(xué)者研究中發(fā)現(xiàn)河北省還存在PCV2a和PCV2e基因型流行[1，5]，這可能與本文獲得序列樣品太少等有關(guān)，因此后續(xù)研究中將持續(xù)關(guān)注PCV2分子流行病學(xué)和基因型分布特征，為該病的防治提供依據(jù)。