周 帥 陳鑫偉 鄭東方 韓 彬

不同方法制備羊肚菌母種的效果比較

周 帥 陳鑫偉 鄭東方 韓 彬

（商丘市農(nóng)林科學(xué)院，河南 商丘 476000）

為明確不同制備方法對羊肚菌母種質(zhì)量的影響，以羊肚菌干子實(shí)體與鮮子實(shí)體為材料進(jìn)行組織分離制備母種，比較其各項(xiàng)活力指標(biāo)，結(jié)果為：干子實(shí)體組織分離的菌種萌發(fā)率、長滿試管和產(chǎn)核的平均時(shí)間均優(yōu)于鮮子實(shí)體組織分離；對比不同轉(zhuǎn)管方式母種的菌絲生長和產(chǎn)菌核情況的結(jié)果顯示：采用放置一年母種和當(dāng)年分離母種混合轉(zhuǎn)接，可顯著提高二級母種的活性，增加成活率，菌絲滿管和產(chǎn)菌核時(shí)間提前。綜合得出較佳的羊肚菌母種制備方法是：采用干子實(shí)體組織分離獲得母種，再用放置一年的母種與當(dāng)年分離母種混合轉(zhuǎn)接制備二級母種。

羊肚菌；子實(shí)體；組織分離；母種優(yōu)化制備

羊肚菌（spp.）菌蓋表面凹凸似網(wǎng)狀，像花生外殼又似羊肚，故得名羊肚菌，是世界珍稀食用菌之一。其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，含有8種維生素和18種氨基酸[1]，有益腸胃、助消化、化痰理氣、補(bǔ)腎壯陽、健腦提神、增強(qiáng)人體免疫力等功效。野生采集產(chǎn)量稀少，歷史上曾奉為“皇家貢品”。

四川省林業(yè)科學(xué)院于2003年發(fā)明的羊肚菌外營養(yǎng)袋技術(shù)，極大地提高了羊肚菌人工栽培的可重復(fù)性及產(chǎn)量[2]。此后，我國羊肚菌人工栽培迅速發(fā)展，產(chǎn)量和品質(zhì)不斷提高。但受限于種性原因等，羊肚菌栽培技術(shù)仍不完善，產(chǎn)量易受氣候、菌種、管理等多種因素影響而不穩(wěn)定。因而，亟待對羊肚菌開展反季栽培及工廠化周年栽培研究攻關(guān)，降低其種植風(fēng)險(xiǎn)，提高種植穩(wěn)定性和效益。

羊肚菌屬子囊菌，菌種退化速度快，需要經(jīng)常制種[3]。菌種質(zhì)量直接影響羊肚菌的產(chǎn)量和品質(zhì)，關(guān)系到菇農(nóng)的切身利益。為提高羊肚菌母種制備質(zhì)量，開展不同方法制備羊肚菌母種的效果比較試驗(yàn)，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試羊肚菌品種為六妹羊肚菌，鮮子實(shí)體從田間選取菌肉肥厚、大小適中、顏色正常、無病蟲害、長至6～8分成熟的優(yōu)質(zhì)菇。干子實(shí)體選擇在陽光下曬干或自然風(fēng)干，或?yàn)闀窀?、風(fēng)干后保藏的無發(fā)潮、無霉變的子實(shí)體。不可選用烘干的子實(shí)體。干羊肚菌組織分離成功的關(guān)鍵在于選擇干凈無污染、無霉變、潔白或微黃的子實(shí)體，以及從鮮品到干品的處理過程無機(jī)械壓傷和化學(xué)污染等[4]。

PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，硫酸鎂2 g，瓊脂20 g，蛋白胨0.5 g，牛肉膏0.5 g，水1000 mL，pH自然。

1.2 不同子實(shí)體組織分離比較試驗(yàn)

（1）培養(yǎng)基試管制作。馬鈴薯去皮、切塊，置于1000 mL水中文火煎煮約30 min，煮好后用紗布過濾取汁。將瓊脂、葡萄糖、硫酸鎂、蛋白胨、牛肉膏加入濾汁中，加熱至全部溶化，用量杯測量是否達(dá)到 1000 mL，如不足，則用開水補(bǔ)足。然后把混合液用長管漏斗分裝入試管中，加至試管1/3高度后，用消毒棉花塞緊試管口。培養(yǎng)基不可沾到試管口，以免污染棉塞滋生雜菌。裝好的試管120～125 ℃、0.1 MPa高壓滅菌30 min。待壓力鍋壓力降至0后，取出試管趁熱斜放，傾斜度以培養(yǎng)基離試管口約1/3試管長度為佳。冷卻凝固后，取少量試管于25～30℃恒溫箱中放置5天，經(jīng)觀察確認(rèn)無雜菌后，才能大量用于分離制種或轉(zhuǎn)接生產(chǎn)母種。

（2）組織分離方法。組織分離須在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行，用略干的酒精棉球?qū)⒆幽夜?、菌蓋擦拭干凈，擦拭過程及時(shí)更換酒精棉球。在超凈工作臺中，用75%的酒精消毒雙手，先用酒精對鑷子、剪刀等接種用具消毒，再用酒精棉擦試，然后放到酒精燈火焰上燒一下。剪開羊肚菌，剪取與菌蓋交接處的菌柄部分，切取2～5 mm大小組織塊，用鑷子夾住放入試管，塞好棉塞后置于20～24 ℃恒溫箱避光培養(yǎng)。

干、鮮子實(shí)體組織分離處理各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10支試管。觀察記錄兩種分離方法的菌絲長勢、色澤、密度、形態(tài)及生長速度，判別菌絲體活性強(qiáng)弱。

1.3 母種優(yōu)化制備

試驗(yàn)設(shè)當(dāng)年分離母種（組織分離后，于20～24 ℃恒溫箱避光培養(yǎng)15天左右的母種）、放置一年母種，以及當(dāng)年分離母種與放置一年母種混合后母種等3個(gè)轉(zhuǎn)管處理。其中，混合后接種的培養(yǎng)方法為將兩種母種各取一部分放在一起，轉(zhuǎn)接到同一試管內(nèi)。每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10支試管。觀察記錄各處理菌絲長勢、色澤、密度、形態(tài)及生長速度，判別菌絲體活性強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織分離母種的菌絲生長和產(chǎn)菌核情況

萌發(fā)率是指接種的羊肚菌組織能完好萌發(fā)的概率[4]。本試驗(yàn)干子實(shí)體組織分離的3個(gè)重復(fù)分別萌發(fā)9支、8支和10支試管，平均萌發(fā)率為90%；鮮子實(shí)體組織分離的3個(gè)重復(fù)分別萌發(fā)9支、8支和8支，平均萌發(fā)率為83.3%。干子實(shí)體分離的菌絲萌發(fā)較慢，平均需要2.67天，但生長速度較快，滿管時(shí)間平均為6.67天，顯著快于鮮子實(shí)體分離的7.32天，且表現(xiàn)生長濃密、長勢旺盛，菌絲呈白色、氈絨狀。鮮子實(shí)體分離的菌絲萌發(fā)較快，平均為2.32天，但生長速度較慢，滿管時(shí)間平均需7.32天，表現(xiàn)生長較密，菌絲呈白色、絨絮狀，長勢略遜于干子實(shí)體分離法。

從產(chǎn)菌核情況看，以干子實(shí)體分離法的數(shù)量較多，菌核呈點(diǎn)狀，前期為白色、后期變黃褐色，密集分布在接種塊周圍；產(chǎn)菌核時(shí)間快，平均9.26天，顯著快于鮮子實(shí)體分離的平均10.12天。鮮子實(shí)體分離法產(chǎn)菌核數(shù)量較少，為片狀，前期為白色、后期變黃色，密集分布在試管邊緣。

2.2 不同轉(zhuǎn)管母種的菌絲生長和產(chǎn)菌核情況

由表1可知，當(dāng)年分離母種轉(zhuǎn)管處理的平均萌發(fā)率為86.7%；放置一年母種轉(zhuǎn)管處理的平均萌發(fā)率為83.3%；混合母種轉(zhuǎn)管處理的平均萌發(fā)率達(dá)93.3%，顯著高于前兩種轉(zhuǎn)管方法。

表1 不同方法制備的母種轉(zhuǎn)管后菌絲生長情況

轉(zhuǎn)管方法長勢顏色密度形態(tài)萌發(fā)時(shí)間/d滿管時(shí)間/d平均萌發(fā)率/% 當(dāng)年分離+++白較密氈絨狀2.54±0.3 b7.19±0.5 b86.7 b 放置一年++黃白疏密絨蕠狀2.56±0.3 b7.56±0.5 b83.3 b 混合后+++++白濃密氈絨狀1.96±0.3 a6.17±0.5 a93.3 a

注：“+”越多表示菌絲長勢越好；數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)平均值。同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示差異顯著（＜0.05）；表2同。

當(dāng)年分離母種轉(zhuǎn)管處理與放置一年母種轉(zhuǎn)管處理之間的菌絲平均萌發(fā)時(shí)間和平均滿管時(shí)間的差異均不顯著，而混合后轉(zhuǎn)管處理的菌絲萌發(fā)和滿管時(shí)間明顯增快，差異達(dá)顯著水平。

由表2可知，混合母種轉(zhuǎn)管處理的產(chǎn)菌核數(shù)量多，產(chǎn)核時(shí)間快，平均為8.46天，較當(dāng)年分離母種轉(zhuǎn)管處理快近1天，較放置一年母種轉(zhuǎn)管處理快近2天，菌種活性更強(qiáng)，差異達(dá)顯著水平。

3 結(jié)論與討論

選擇適宜的干子實(shí)體為分離材料制備羊肚菌母種，較鮮子實(shí)體組織分離法的萌發(fā)率高，且菌絲生長濃密，長勢旺盛，平均滿管時(shí)間和平均產(chǎn)核時(shí)間分別為6.67天和9.26天，短于鮮子實(shí)體分離法的7.32天和10.12天?？傮w來說，干子實(shí)體組織分離法生產(chǎn)出的羊肚菌母種各項(xiàng)指標(biāo)均略優(yōu)于鮮子實(shí)體分離法。

表2 不同方法制備的母種轉(zhuǎn)管培養(yǎng)中菌核的形成情況

母種轉(zhuǎn)管方法分布數(shù)量形態(tài)后期顏色產(chǎn)核時(shí)間/d 當(dāng)年分離接種塊周圍密集分布***點(diǎn)狀黃 9.38±0.5 b 放置一年試管邊緣密集分布**片狀黃褐10.40±0.5 b 混合后試管內(nèi)均勻密集分布****簇生微黃 8.46±0.5 a

注：“*”越多表示菌核數(shù)量越多；數(shù)據(jù)為 3 個(gè)重復(fù)平均值；菌核前期均呈白色。

采用當(dāng)年分離母種與放置一年母種混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)管，不僅萌發(fā)率高于兩種母種單獨(dú)轉(zhuǎn)管，二級母種的萌發(fā)時(shí)間和菌絲滿管時(shí)間顯著加快，而且產(chǎn)菌核數(shù)量多、時(shí)間短，平均產(chǎn)核時(shí)間分別較當(dāng)年分離母種轉(zhuǎn)管處理和放置一年母種轉(zhuǎn)管處理快近1天和近2天，其菌種活性更強(qiáng)。

由于羊肚菌種植受氣候條件、菌種、菌絲生長階段和出菇階段管理措施等各種因素影響較大，是一項(xiàng)高投資、高技術(shù)、高風(fēng)險(xiǎn)的“三高”產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)量極不穩(wěn)定，重復(fù)性差。因此，研究提高羊肚菌種植各環(huán)節(jié)的技術(shù)水平對整個(gè)行業(yè)的發(fā)展都具有重要意義。本試驗(yàn)通過對比分析，得出結(jié)論：采用干子實(shí)體組織分離法制備羊肚菌母種，并將放置一年母種同當(dāng)年分離母種混合轉(zhuǎn)接，可以顯著提高二級母種活性和成活率，使菌種提前長滿試管及產(chǎn)生菌核，是羊肚菌母種生產(chǎn)中的較為理想的方法。

[1] 裘源春. 羊肚菌高效栽培技術(shù)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)技術(shù)出版社, 2018.

[2] 譚方河. 闡釋我國羊肚菌外營養(yǎng)袋栽培技術(shù)的發(fā)展歷程[J]. 食藥用菌, 2019, 27(4): 257-263.

[3] 劉偉, 張亞, 蔡英麗. 我國羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀及趨勢[J]. 食藥用菌, 2017, 25(2): 77-83.

[4] 黎智文, 代俊杰, 李曉. 羊肚菌干子實(shí)體組織分離與孢子分離獲得菌種的比較試驗(yàn)[J]. 食藥用菌, 2018, 26(2): 94-95.

Comparative study on tissue isolation from dried and fresh fruiting bodies of

Zhou Shuai Chen Xinwei Zheng Dongfang Han Bin

（Shangqiu Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Shangqiu, Henan 476000, China）

In order to clarify the influence of different preparation methods on the quality ofmother culture, the dried fruiting body and fresh fruiting body ofwere used as materials for tissue separation to prepare mother culture, and the vitality indexes of the strains were compared. The results were as follows: from the perspective of the germination rate, the average time of mycelium filling test tube and sclerotia production, mother culture isolated from dry fruiting body tissue were better than that of isolated from fresh fruiting body tissue. The results of comparing the mycelial growth and sclerotium production of mother culture with different tube transfer methods showed that the mixed transfer of mother culture stored for one year and isolated currently could significantly improve the activity of secondary mother culture, increase the survival rate, and advance the time of mycelial full tube and sclerotium production.

; fruiting body; tissue isolation; optimized preparation of mother culture

S646

B

2095-0934（2022）02-148-03

周帥（1979—），男，河南商丘人，本科，助理研究員，主要從事食用菌研究及高產(chǎn)新品示范工作。E-mail：372388688@qq.com。