汪 瀅，張敏新，林 兵 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院, .臨床藥學(xué)科；. 藥劑科, 福建 福州350025）

雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.的干燥根，是一種公認的同時具有較強藥效和較強毒性的中藥材，廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[1]。但其毒性較大，不良反應(yīng)高發(fā)且嚴重，常使患者不能耐受[2]。雷公藤的主要有效成分為二萜類、三萜類和生物堿類，研究表明各種成分均具有不同程度的抗炎、抗腫瘤和免疫抑制等活性[3-4]，其中生物堿的毒性要小于二萜和三萜類成分，臨床應(yīng)用具有療效好，不良反應(yīng)較小的特點[5]。雷公藤次堿是雷公藤生物堿中含量較高的一種倍半萜類單體化合物。目前研究顯示其具有良好的殺蟲活性，其他藥理活性和機理研究較少，特別是抗炎和免疫抑制活性方面。

本研究主要通過建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞炎癥模型，探討雷公藤次堿對LPS誘導(dǎo)的炎性因子NO，IL-1β，TNF-α 和IL-6 釋放的影響，用免疫印跡法考察雷公藤次堿對TRAF6、IRAK、NF-κB、IκBα、JNK、ERK、p38 等關(guān)鍵蛋白表達或磷酸化的影響，探討其可能的抗炎作用機制，為促進雷公藤次堿的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 試劑與材料

雷公藤次堿（純度98%，上海純優(yōu)生物科技有限公司）；DMEM 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（Life Technologies GIBCO）；Griess 試劑、細胞計數(shù)盒-8(CCK-8)（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；脂多糖（LPS， Sigma-Aldrich）；IL-1β、TNF-α 和IL-6 檢測試劑盒（達科為生物技術(shù)有限公司）；核質(zhì)提取試劑盒（Dojindo Laboratories）；TRAF6、IRAF、p-IRAF、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-IκBα、IκBα、NF-κB p65、β-actin、HRP 山 羊 抗 兔 抗 體（Cell Signaling Technology）；RAW264.7 細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

2 方法

2.1 RAW264.7 細胞培養(yǎng)及炎癥模型建立

RAW264.7 細胞在含10%的新生小牛血清及100 U/ml 青霉素、鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃，隔天換液，每日觀察細胞的生長狀況。實驗時取對數(shù)生長期RAW264.7 細胞，胰酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基反復(fù)吹打成細胞混懸液，細胞增殖實驗、細胞因子分泌含量測定調(diào)整細胞濃度為1×105cells/ml，以每孔100 μl 細胞懸液接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，細胞蛋白表達測定調(diào)整細胞濃度到2.25×105cells/ml，以每孔2 ml 接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，然后細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在藥物處理前2 h 給予LPS 溶液（使其終濃度為1 μg/ml）誘導(dǎo)RAW264.7 細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)建立模型。設(shè)空白組（不給予LPS 和藥物處理）、模型組（給予LPS 處理）、藥物組（給予LPS 誘導(dǎo)后再給予相應(yīng)濃度的藥物進行處理），每組設(shè)6 個復(fù)孔(n=6)。

2.2 RAW264.7 細胞增殖實驗

設(shè)空白組和藥物組，藥物組分別給予終濃度為200、100、50 和25 μmol/L 的雷公藤次堿藥液進行處理。細胞分別培養(yǎng)24 和48 h，實驗結(jié)束4 h前加入10 μl CCK-8 試劑，結(jié)束后以酶標儀于450 nm處檢測吸光度（A）。

2.3 RAW264.7 細胞分泌NO、IL-1β、TNF-α 和IL-6 含量的測定

設(shè)空白組、模型組和藥物組，藥物組細胞給予LPS 誘導(dǎo)后分別給予終濃度為100、50、25 μmol/L的藥液進行處理。細胞培養(yǎng)24 h 后取出，吸取細胞上清液，Griess 試劑法檢測上清中NO 光密度值，ELISA 試劑盒檢測上清中IL-1β、TNF-α 和IL-6的光密度值。

2.4 RAW264.7 細胞中TRAF6、NF-κB p65、IκBα、IRAK、p-IRAK、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK和ERK 表達分析

設(shè)空白組、模型組和藥物組，藥物組細胞給予LPS 誘導(dǎo)后分別給予終濃度為100、50、25 μmol/L的藥液進行處理。細胞培養(yǎng)24 h 后取出，用4 ℃預(yù)冷的PBS 液洗滌各孔兩次，然后，吸棄PBS 液，每孔中加入200 μl 4 ℃預(yù)冷的RIPA 提取細胞蛋白，在13 000 r/min 下離心20 min，棄去上清，得各樣本。用Bradford 法對蛋白定量；使用細胞核/質(zhì)提取試劑盒制備用于檢測p65/NF-κB 的胞質(zhì)和核提取物。每孔加入20 μg 蛋白上樣，在SDS-PAGE凝膠中電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用BSA 封閉2 h。分別用相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，然后用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶1 000）孵育2 h。最后用 ECL 超敏發(fā)光液顯影，于凝膠成像儀中曝光，使用 LAS 成像軟件對條帶進行定量分析

2.5 統(tǒng)計分析與灰度分析

3 結(jié)果

3.1 雷公藤次堿對RAW264.7 細胞活力的影響

圖1 顯示了不同濃度雷公藤次堿對RAW264.7細胞的細胞毒性作用。給予雷公藤次堿（25～200 μmol/L）孵育24 h 后，200 μmol/L 雷公藤次堿可顯著抑制RAW264.7 細胞活性；孵育48 h 后，50、100 和200 μmol/L 雷公藤次堿均可顯著抑制RAW264.7 細胞的活性。

圖1 雷公藤次堿對RAW264.7 細胞活力的影響

3.2 雷公藤次堿對LPS 刺激RAW264.7 細胞分泌炎癥因子的影響

為了進一步研究雷公藤次堿體外抗炎活性，檢測了雷公藤次堿對LPS 刺激RAW264.7 細胞分泌炎癥因子的影響。結(jié)果顯示（圖2），給予LPS 刺激后的RAW264.7 細胞，NO、IL-1β、TNF-α 和IL-6等促炎因子釋放水平急劇增加（P<0.01），給予不同濃度雷公藤次堿（100、50 和25 μmol/L）處理后，上述因子分泌水平呈劑量依賴性顯著降低（P<0.01）。由此提示，雷公藤次堿的抗炎作用可能與抑制細胞釋放NO、IL-1β、TNF-α 和IL-6 等促炎因子有關(guān)。

圖2 雷公藤次堿對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞分泌炎癥因子的影響

3.3 雷公藤次堿對IRAK 磷酸化和TRAF6 表達的影響

LPS 是引發(fā)炎癥的早期關(guān)鍵因素，可誘發(fā)多種細胞內(nèi)信號事件，LPS-TLR4/MyD88 信號通路可調(diào)節(jié)促炎基因表達，并控制炎癥相關(guān)細胞因子的表達，其中IRAK 及TRAF6 是MyD88 依賴性途徑中的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)的分子。TLR4 受體受LPS 誘導(dǎo)后，可導(dǎo)致IRAK 磷酸化從而脫離MyD88 與TRAF6的結(jié)合體，使得游離的TRAF6 活化后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。為了評估雷公藤次堿對LPS 激活TLR4/MyD88 信號通路的影響，蛋白印跡法考察了雷公藤次堿對IRAK 磷酸化和TRAF6 表達的影響。結(jié)果顯示（圖3），與空白組相比，LPS 刺激的模型組IRAK 磷酸化和TRAF6 表達明顯增加（P<0.01）；與模型組相比，雷公藤次堿各劑量組可顯著抑制IRAK 磷酸化和降低TRAF6 表達（P<0.01）。

圖3 雷公藤次堿對TRAF6 表達和IRAK 磷酸化的表達的影響

3.4 雷公藤次堿對IκBα 磷酸化和NF-κB p65 核轉(zhuǎn)位的影響

NF-κB 是MyD88 信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子[7]。我們考察了雷公藤次堿對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞中NF-κB 活化的潛在影響。如圖4 所示，RAW264.7細胞LPS 刺激后，細胞核內(nèi)NF-κB p65 水平增高而細胞質(zhì)內(nèi)NF-κB p65 水平降低，說明NF-κB p65 活化后由細胞質(zhì)進入到細胞核內(nèi)，而給予雷公藤次堿處理后，細胞質(zhì)內(nèi)NF-κB p65 水平增高而細胞核內(nèi)NF-κB p65 水平降低，說明雷公藤次堿以濃度依賴的方式顯著地阻止了NF-κB p65 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核。 NF-κB p65 易位進入核內(nèi)與TLR4途徑中的IκBα 磷酸化有關(guān)。因此，我們考察了雷公藤次堿對NF-κB 抑制蛋白IκBα 磷酸化的影響。結(jié)果表明，雷公藤次堿以濃度依賴的方式顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的IκBα 磷酸化和降解。

圖4 雷公藤次堿對IκBα 磷酸化和NF-κB 核轉(zhuǎn)位的影響

3.5 雷公藤次堿對p38, ERK 和JNK MAPKs 磷酸化的影響

MAPKs 是信號從細胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細胞核內(nèi)部的重要傳遞者。為了進一步研究雷公藤次堿是否調(diào)節(jié)MAPKs，考察了其對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中ERK、p38 和JNK 等MAPKs 磷酸化的影響。如圖5 所示，LPS 暴露可顯著促進RAW264.7細胞中ERK、JNK 和p38 的磷酸化。給予雷公藤次堿可以顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的ERK、p38 和JNK的磷酸化，但并未影響ERK、p38 和JNK 的表達。上述結(jié)果表明，MAPKs 的磷酸化可能參與了雷公藤次堿對RAW264.7 細胞中LPS 刺激炎癥的抑制作用。

圖5 雷公藤次堿對p38, ERK 和JNK MAPKs 磷酸化的影響

4 討論

雷公藤次堿是雷公藤的代表性生物堿成分之一，但是自從被分離以來，其生物學(xué)活性除了殺蟲外，其他方面了解甚少[8]。本研究顯示，雷公藤次堿對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞炎癥模型顯示出顯著的抗炎活性。雷公藤次堿可減少LPS 刺激引起的NO、IL-1β、TNF-α 及IL-6 等促炎因子的產(chǎn)生，并抑制LPS 誘導(dǎo)的TLR4/MyD88 通路中信號傳導(dǎo)的分子IRAK 磷酸化及TRAF6 表達，從而影響MAPKs 和NF-κB 的激活，如圖6 所示。

圖6 雷公藤次堿抗炎調(diào)控機制

已有證據(jù)顯示，LPS 可引發(fā)多種細胞內(nèi)信號事件，包括導(dǎo)致TLR4，NF-κB 及p38，ERK 和JNK 等絲裂素活化蛋白激酶（MAPKs）途徑激活[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導(dǎo)后RAW264.7 細胞Toll 樣受體4（TLR4）的表達明顯增高，說明LPS 是或可引導(dǎo)TLR4 的配體與TLR4 結(jié)合，二者結(jié)合后可啟動細胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)目的基因的表達。TLRs 亞型中除TLR3 外，均需要髓樣分化因子88（MyD88）來激活下游釋放信號分子的通路，這種途徑成為MyD88 依賴性途徑。靜息狀態(tài)下，MyD88 與IRAK 及TRAF6 形成細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，受到誘導(dǎo)后導(dǎo)致IRAK 磷酸化，IRAK 磷酸化后TRAF6 從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物中解離出來，TRAF6的活化可引起兩條不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，一條為MAPK 家族（包括p38、JNK），另一條為活化MP3K（mitogen activated protein kinase kinase kinase）家族成員NIK（NF-κB inducing kinase），后者的磷酸化激活I(lǐng)κB 激酶，導(dǎo)致IκB 的磷酸化而使NF-κB/IκB復(fù)合物解離，NF-κB 由此活化轉(zhuǎn)位進入細胞核[11]。在本研究中，數(shù)據(jù)顯示雷公藤次堿可以抑制IRAK磷酸化和TRAF6 的表達。

NF-κB 是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、免疫、腫瘤等相關(guān)的細胞因子、趨化因子、黏附分子、炎癥介質(zhì)等的轉(zhuǎn)錄過程。IκB 是其抑制蛋白，正常情況下二者結(jié)合而使NF-κB 處于失活狀態(tài)，IκBα 是IκB 的亞分子，受到LPS 刺激，IκBα 磷酸化增加，從而導(dǎo)致游離NF-κB p65 釋放并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核，與DNA 上的相應(yīng)位點結(jié)合，導(dǎo)致特定靶基因（如TNF-α、IL-1β 和IL-6）的轉(zhuǎn)錄表達[12-13]。在本研究中，數(shù)據(jù)顯示雷公藤次堿可抑制IκBα 磷酸化，并以濃度依賴的方式阻止NF-κB p65 由細胞質(zhì)進入細胞核，從而阻止炎癥相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄表達。

此外，NF-κB 的易位也受ERK、p38 和JNK 等絲裂素活化蛋白激酶途徑調(diào)節(jié)，該途徑可控制炎癥反應(yīng)過程中細胞因子的合成和釋放。絲裂素活化蛋白激酶激活后，細胞質(zhì)或細胞核中的轉(zhuǎn)錄因子又被激活，從而觸發(fā)引起生物學(xué)反應(yīng)的靶基因的表達，包括促炎性介質(zhì)的表達。本研究顯示，LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞中，雷公藤次堿可顯著抑制ERK、JNK 和p38 的磷酸化。