張 歡，汪 麗，張 優(yōu)，謝 沛，李 娜，丁家榮，王 雷 （1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院：a. 腎臟病科, b. 消化內(nèi)科, 上海 00433; . 上海大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院, 上海 00444）

臨床流行病學(xué)顯示，終末期腎臟病患者發(fā)生房顫的風險是一般人群的10 倍[1]?？诜鼓齽┦穷A(yù)防房顫血栓形成的重要治療方法，但現(xiàn)有口服抗凝劑缺乏針對終末期腎臟病患者的臨床研究，其安全性和有效性并不確切[2-3]。阿哌沙班是一種新型口服Xa 因子的抑制劑，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療血栓形成。研究顯示，阿哌沙班可降低腎病合并房顫患者的大出血、血栓栓塞和死亡風險，為此類患者提供新的抗凝藥物選擇[3]。但阿哌沙班缺少在終末期腎臟病患者（血肌酐清除率<15 ml/min）中使用的臨床資料，且目前阿哌沙班腸道吸收部位尚不明確，其吸收的影響因素也不清楚，因而，一定程度上限制了其應(yīng)用。本實驗擬通過探究阿哌沙班在腎衰大鼠腸道內(nèi)的吸收部位、吸收機制以及P 糖蛋白抑制劑對其腸道吸收的影響，以便為阿哌沙班在終末期腎臟病患者中使用提供一定的參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

島津LC-2030 Plus 高效液相色譜儀、AUW120D電子天平（日本島津公司）；UVF 超純水器（上海和泰儀器有限公司）；超聲清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；Hei-Tec 磁力攪拌器（德國海道爾夫）；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 實驗試劑

阿哌沙班原料藥（武漢嘉葉生物科技有限公司）；十二烷基硫酸鈉（南京化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、二水合鹽酸二氫鈉、氯化鎂、氯化鈣、葡萄糖、乙酸銨（上海國藥集團）；甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆患儍羲ê贾萃薰煞萦邢薰荆?/p>

1.3 實驗動物

SD 雄性大鼠，230～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。動物自由飲水、進食，環(huán)境溫度22～25 ℃，相對濕度60%，光照時間8:00—18:00。所有動物實驗均符合實驗動物倫理學(xué)要求。

2 實驗方法和結(jié)果

2.1 實驗溶液配制

2.1.1 Kreb-Ringer's 營養(yǎng)液（K-R 氏液）

精確稱取NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、MgCl2·6H2O 0.02 g、NaH2P040.32 g、NaHCO31.37 g，用超純水溶解后加入0.37 g CaCl2至溶解完全，臨用前加入葡萄糖1.4 g，轉(zhuǎn)移至1 000 ml 容量瓶中定容至刻度，調(diào)節(jié)pH 至7.4。

2.1.2 阿哌沙班儲備液

精確稱取9 mg 阿哌沙班原料藥置于容量瓶中，加入3 % SDS，定容至100ml，作為阿哌沙班儲備液備用。

2.1.3 不同濃度的阿哌沙班腸循環(huán)液

分別取0.5、1.0、4.0ml 阿哌沙班儲備液至100 ml容量瓶中，加入K-R 營養(yǎng)液，超聲溶解后定容至100ml，配置成的阿哌沙班溶液濃度分別為0.45、0.90、3.60 μg/ml。

2.1.4 含P 糖蛋白抑制劑的阿哌沙班供試液

精確稱取0.5g 的鹽酸維拉帕米置于100 ml 容量瓶中，加入超純水溶解配制成濃度為5 mg/ml 的鹽酸維拉帕米儲備溶液。分別取1 ml 鹽酸維拉帕米儲備溶液和1 ml 阿哌沙班儲備溶液置100ml 容量瓶，配制成含鹽酸維拉帕米濃度為50 μg/ml、阿哌沙班濃度為0.9 μg/ml 的供試品溶液。

2.2 高效液相色譜檢測

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Gemini 5u C18110A 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 相為 甲醇，B 相為10 mmol/L 醋酸胺溶液；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl。

2.2.2 專屬性實驗

分別取空白K-R 溶液、阿哌沙班K-R 溶液以及阿哌沙班K-R 回流收集液，2000 r/min 離心5 min后取上清液10 μl，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析[4-5]。結(jié)果見圖1。實驗結(jié)果表明，腸灌流液中阿哌沙班峰形良好，保留時間約為7 min，空白K-R溶液及空白腸灌流液對其無干擾，專屬性良好。

圖1 阿哌沙班的HPLC 色譜圖

2.2.3 阿哌沙班的線性關(guān)系

精密量取阿哌沙班標準儲備液用K-R 溶液配制系列標準溶液，各取1 ml 加入0.5 ml 甲醇，離心后取上清液，按照“2.2.1”項下方法進樣分析。線性回歸分析結(jié)果表明阿哌沙班在0.36-4.5 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 阿哌沙班的回收率試驗

精密量取阿哌沙班標準儲備液用K-R 溶液配制濃度呈0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班供試品溶液，各取1 ml 加入0.5 ml 甲醇，離心后取上清液，按照“2.2.1”項下方法進樣分析，計算阿哌沙班在低、中、高濃度溶液中的回收率。低、中、高濃度溶液中阿哌沙班平均回收率分別為97.39 %、98.91 %、99.92 %，RSD 分別為1.94 %、1.88 %、1.25 %，結(jié)果表明本方法準確度良好。

2.2.5 阿哌沙班的穩(wěn)定性考察

精密量取阿哌沙班標準儲備液用K-R 溶液配制濃度為0.45、0.9、3.6μg/ml 的阿哌沙班供試品溶液，置于37 ℃水浴3 h，考察藥物在K-R 液中的穩(wěn)定性。結(jié)果0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班供試液的 RSD 分別為 0.51 %、1.65 %、0.50%，表明3 h內(nèi)阿哌沙班的穩(wěn)定性良好。

2.3 阿哌沙班大鼠腸吸收特性的研究

2.3.1 大鼠慢性腎功能衰竭模型建立

雄性SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按劑量40 mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥鈉，待麻醉成功后，取仰臥位固定，常規(guī)消毒，沿左腹旁腎臟位置切開皮膚并逐層分離皮下組織進入腹腔，暴露左側(cè)腎臟，切開上、下極的包膜，采用針形電燒灼器分別在左腎上、下極電凝腎臟表面，逐層縫合肌層和皮膚，關(guān)閉腹腔。2 周后，沿右腹旁腎臟位置處切口切開皮膚，逐層分離皮下組織進入腹腔，暴露右側(cè)腎臟，用絲線結(jié)扎右腎腎門，切除右腎。

2.3.2 腎衰大鼠單向腸灌流模型的建立

取慢性腎功能衰竭大鼠，禁食12 h，期間自由飲水，按劑量40 mg/kg 腹腔注射1%戊巴比妥鈉，待麻醉成功后，取仰臥位固定，常規(guī)消毒皮膚。沿腹中線取長約3 cm 縱行手術(shù)切口，分別在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸處各取間距約為10 cm 兩個微小切口，分別在兩切口處置入無菌引流管，并用絲線固定。取預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，直至澄清液體，引流管連接恒流泵，以2.0 ml/min 的起始流速將濃度為0.9 μg/ml 的阿哌沙班溶液泵入腸段，待腸段內(nèi)藥液充滿后將流速降低至0.2 ml/min，此后按15 min/次的頻率收集腸回流液，計算腸回流液的質(zhì)量減少量及15 min 內(nèi)收集到的流出液體的質(zhì)量，并測定收集液中藥物濃度。實驗持續(xù)時間2 h。樣品采集完后處死大鼠，剪下所研究的腸段，將其平鋪，測量其長度以及橫截面半徑。

2.3.3 腸吸收參數(shù)的計算

采用質(zhì)量法對回流液流入和流出體積進行校正。按下式計算吸收速率常數(shù)（Ka）和表觀滲透系數(shù)（Papp）：

式中Vin和Vout分別為灌入和收集的回流液體積（ml），Cin、Cout分別為進口和出口處回流液中藥物的質(zhì)量濃度（μg/ml），v為灌流速度（ml/min），r為被灌流腸段的橫截面半徑（cm），L為被灌流腸段的長度（cm）。

2.3.4 阿哌沙班在慢性腎衰大鼠各腸段吸收情況測定

根據(jù)測定收集液中阿哌沙班濃度，計算不同腸段中阿哌沙班Ka和Papp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空腸對阿哌沙班的吸收速率最快，結(jié)腸段最慢，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。各腸段間的阿哌沙班表觀吸收系數(shù)未見明顯異常。如表1 所示。

表1 不同腸段藥物吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)(n=6)

2.3.5 阿哌沙班濃度對其吸收特性測定

配制濃度分別為0.45、0.9、3.6 μg/ml 的阿哌沙班灌流液，按“2.3.2”項下操作流程選取腎衰大鼠回腸進行灌流，測定灌流液中阿哌沙班的濃度，計算藥物Ka和Papp。結(jié)果顯示，在回腸段，阿哌沙班藥物濃度越高，腸道對其吸收速率和表觀吸收系數(shù)越低（P<0.05），如表2 所示。

表2 回腸不同濃度藥物吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)(n=6)

2.3.6 P-gp 抑制劑對阿哌沙班吸收特性的影響

按“2.1.4”項下方法配制含鹽酸維拉帕米的阿哌沙班灌流液，按“2.3.2”項下操作流程選取大鼠空腸及回腸進行灌流，測定灌流液中阿哌沙班的濃度，計算藥物Ka和Papp，研究P-gp 外排作用對阿哌沙班在空腸和回腸段的吸收特性影響。結(jié)果顯示，加入維拉帕米后，阿哌沙班的Ka和Papp的值均增加，提示阿哌沙班是 P-gp 的底物，P-gp 抑制劑顯著促進阿哌沙班的腸吸收，如表3 所示。

表3 P-gp 抑制劑對阿哌沙班在空腸和回腸段吸收特性的影響(n=6)

3 討論

阿哌沙班是新型口服、高效、高選擇性的Xa因子抑制劑，自2013 年上市以來，隨著應(yīng)用的推廣，阿哌沙班適應(yīng)證由早期的關(guān)節(jié)置換術(shù)后預(yù)防靜脈血栓形成逐漸拓展為廣泛的預(yù)防和治療血栓的形成[6-10]。慢性腎臟病是臨床常見病和多發(fā)病[11]。研究顯示，相對于健康人群，終末期腎臟病患者發(fā)生房顫的風險增加10 倍，嚴重危及終末期腎臟病患者的生命安全[1]。房顫是臨床最常見的心律失常疾病，其極易誘發(fā)血栓形成，抗凝治療是房顫病人預(yù)防血栓形成及栓塞的必要治療手段[12]。但目前臨床上常見的口服抗凝劑均缺乏針對腎臟病患者的臨床研究，其安全性和有效性存疑[3,8,13]。在一項和華法林的對比中發(fā)現(xiàn)，相對于華法林，阿哌沙班可降低終末期腎臟病合并房顫患者的大出血、血栓栓塞和死亡風險[3]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，腎功能損傷對阿哌沙班血漿濃度與抗FXa 活性的關(guān)系無明顯影響[14]。這也給這部分患者帶來了新抗凝劑的選擇。然而，對于其腸道主要吸收部位及吸收機制了解欠缺也在一定程度上限制了其臨床的應(yīng)用。

本研究通過比較腎衰大鼠不同腸段藥物濃度的測定來推測阿哌沙班在腸道內(nèi)的吸收部位及吸收機制，并通過給予P 糖蛋白抑制劑來研究其對腸道吸收阿哌沙班的影響。目前研究胃腸道對藥物吸收情況的方法主要分為在體實驗、體外實驗和體內(nèi)實驗三種[15]。其中在體實驗又分為兩種：循環(huán)灌流法和單向灌流法[15-17]。單向灌流法具有通用性好、耗時少及流速低的特點，同時顯著減少了對腸道生理環(huán)境的影響，最終實驗準確性高[16,18]。在本實驗所測定的阿哌沙班因其溶解性低、滲透性差及難以被吸收的限制，導(dǎo)致腸道對酚紅吸收增加，對實驗結(jié)果測算校正影響大，故選用單向腸灌流法進行試驗以及重量法進行校正計算[19]。

有文獻報道[20]，當藥物的Papp小于 0.03×10?4cm/s時表明該藥物吸收較差；Papp大于0.2×10?4cm/s 時表明該藥物吸收完全；而介于兩者之間則為中等吸收。阿哌沙班在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的Papp值均保持約0.2×10?4cm/s，說明阿哌沙班在各腸段均有良好吸收行為。此外，高血壓是慢性腎衰患者最常見的并發(fā)癥，常需使用多種降壓藥物聯(lián)合治療，P-gp 抑制劑維拉帕米作為經(jīng)典的鈣通道拮抗劑廣泛應(yīng)用于臨床降壓治療。既往研究顯示，阿哌沙班和利伐沙班可被細胞色素P450 3A 和P-gp 所消除[21]。為進一步明確P-gp 對阿哌沙班的吸收影響，本研究觀察了P-gp 抑制劑鹽酸維拉帕米對阿哌沙班腸道吸收的影響，結(jié)果表明加入P-gp 抑制劑后，阿哌沙班在空腸和回腸段Ka和Papp值均有不同程度的增加，推測阿哌沙班是P-gp 的底物， P-gp抑制劑的加入有利于增加阿哌沙班的吸收程度，從而提高阿哌沙班口服生物利用度。不同濃度的阿哌沙班溶液在回腸的吸收情況不同，低濃度與高濃度之間存在顯著性差異，且高濃度的Ka及Papp的值最小，表明阿哌沙班的吸收存在自身濃度抑制，其吸收機制應(yīng)為主動轉(zhuǎn)運。

綜上所述，阿哌沙班在各腸段均有吸收；P-gp抑制劑對阿哌沙班在空腸和回腸段的吸收均有明顯的促進作用，表明阿哌沙班為P-gp 底物，推測其吸收機制為主動轉(zhuǎn)運。本文擬通過探究阿哌沙班在腸道內(nèi)的吸收部位、吸收機制以及P 糖蛋白抑制劑對其腸道吸收的影響，為今后阿哌沙班的使用提供一定的參考依據(jù)。