王丹陽，許燕楠，劉平，慕永平

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病二科 上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所教育部肝腎疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

肝硬化是各種肝臟疾病的晚期階段，近年其發(fā)病率和病死率逐漸升高[1]。肝硬化形成的主要因素包括肝炎病毒、酒精、自身免疫等，這些因素均可導(dǎo)致正常肝細(xì)胞壞死和肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而造成肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和肝臟結(jié)構(gòu)破壞[2]。除肝移植外，目前仍缺乏有效的終末期肝硬化治療方法，因此在肝硬化早期階段進(jìn)行有效抗纖維化治療顯得尤為重要[3-5]。近年來，隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，以干細(xì)胞移植為主的肝移植替代治療已成為最具潛力的肝硬化治療手段。干細(xì)胞是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞群，可在特定條件下分化為不同類型的細(xì)胞[6]。目前在肝硬化治療領(lǐng)域研究較多的是胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESCs)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。ESCs是指從未分化的多能干細(xì)胞，具有無限增殖和自我分化潛能；iPSCs在形態(tài)、基因表達(dá)、分化能力等方面均與ESCs相似，也是目前基礎(chǔ)研究較全面的干細(xì)胞之一；MSCs則不僅具有自我更新、分化的潛能，還可降低免疫排斥反應(yīng)，因此被認(rèn)為是治療肝硬化最具前景的干細(xì)胞群[7]?，F(xiàn)就干細(xì)胞移植治療肝硬化的研究進(jìn)展予以綜述。

1 不同來源的干細(xì)胞治療肝硬化的基礎(chǔ)研究

1.1ESCs 1998年，Thomson等[8]首次獲得人類ESCs。ESCs是一類由早期胚胎或原始性腺分離的細(xì)胞，由50～150個(gè)細(xì)胞組成，具有無限增殖、自我更新和多向分化的潛能[9]。誘導(dǎo)后的ESCs形態(tài)特征、基因特異性均與肝細(xì)胞類似，為典型的肝細(xì)胞樣細(xì)胞(hepatocyte-like cells，HLCs)，即高表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物甲胎蛋白、白蛋白、肝細(xì)胞核因子4α、細(xì)胞角蛋白8和細(xì)胞角蛋白19等[10-11]。此外，在培養(yǎng)過程中ESCs可長(zhǎng)期、穩(wěn)定地保留肝細(xì)胞表型，并可分化為成熟肝細(xì)胞[12]，具有肝細(xì)胞功能，如糖原儲(chǔ)存、細(xì)胞色素活性以及低密度脂蛋白攝取等[13]。同時(shí)，來源于人ESCs的HLCs還可促進(jìn)免疫缺陷小鼠的肝再生，表明ESCs治療肝臟疾病的機(jī)制與其向HLCs分化有關(guān)[14]，為ESCs移植治療肝硬化提供了理論依據(jù)。目前，將ESCs分化為HLCs表型的方法已經(jīng)建立，該方法通過激活素A和Wnt3A促進(jìn)內(nèi)胚層分化[15-16]。雖然人類ESCs已達(dá)到臨床使用標(biāo)準(zhǔn)，但ESCs用于肝硬化的治療仍存在許多亟待解決的問題。首先，ESCs的獲取需要破壞囊胚，存在不可避免的倫理問題[17]；其次，ESCs屬于多能干細(xì)胞，移植后存在發(fā)生畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)[18]。

1.2iPSCs Takahashi等[19]將八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子3/4、Sox2(SRY-related HMG-box2)、c-myc和Krüppel樣因子4等基因克隆入病毒載體，然后轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠成纖維細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化并產(chǎn)生一種新細(xì)胞，即iPSCs。由于iPSCs可直接從成體細(xì)胞誘導(dǎo)分化，不需要破壞胚胎，因此可避免ESCs移植相關(guān)的倫理問題和免疫排斥反應(yīng)[20]；同時(shí)，iPSCs與ESCs在多向分化、自我更新潛能等方面也較相似[19,21]，因此逐漸成為干細(xì)胞治療研究的熱點(diǎn)。

iPSCs治療肝硬化的機(jī)制主要包括其可在特定條件下誘導(dǎo)分化為HLCs，且高表達(dá)甲胎蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白受體、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2以及肝細(xì)胞核因子4α等[22-23]；同時(shí)，iPSCs來源的HLCs還具有細(xì)胞色素P450酶活性，可分泌尿素、攝取低密度脂蛋白，并具有儲(chǔ)存糖原的功能[24]。Takayama等[25]研究發(fā)現(xiàn)，iPSCs源性肝母細(xì)胞樣細(xì)胞在層粘連蛋白111涂層培養(yǎng)皿上可長(zhǎng)期自我更新，并具有向HLCs和膽管細(xì)胞樣細(xì)胞分化的潛能。有研究將野生型小鼠的iPSCs轉(zhuǎn)移至延胡索二酰乙酰乙酸水解酶缺陷小鼠的胚胎中以產(chǎn)生嵌合小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iPSCs在嵌合小鼠體內(nèi)發(fā)育成肝細(xì)胞并保護(hù)延胡索二酰乙酰乙酸水解酶缺陷小鼠避免發(fā)生肝衰竭[26-27]，證實(shí)iPSCs可以分化為具有完整肝功能的成熟肝細(xì)胞，擁有與肝細(xì)胞相同的增殖能力[28]。另有研究表明，人iPSCs分泌的囊泡可減少肝星狀細(xì)胞活化，延緩肝纖維化進(jìn)展[29]，為iPSCs治療肝硬化提供了新思路。

目前已經(jīng)可以從iPSCs獲取人類HLCs[30]，但與成人原代肝細(xì)胞相比，來源于iPSCs的HLCs表型更接近于胎兒[31]。雖然3D培養(yǎng)可使iPSCs接近成熟肝細(xì)胞，但仍需要一個(gè)適宜的發(fā)育環(huán)境[32]。Takebe等[33]發(fā)現(xiàn)，將人iPSCs與內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，其在體外會(huì)形成可移植的小肝器官，且具有代謝和合成功能，但這種小肝器官缺乏膽管系統(tǒng)，而膽汁引流不暢不僅會(huì)阻礙肝臟的基本消化功能，還可導(dǎo)致膽汁淤積和肝硬化。因此，Tian等[34]建立一種可有效生成2D和3D膽管上皮組織的方案及控制條件，以促進(jìn)具有完整性、功能性肝組織的形成。

雖然目前關(guān)于iPSCs的研究還處于初級(jí)階段，但其在肝臟疾病治療方面已顯現(xiàn)巨大潛力。然而，其潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)以及在重編程過程中的不確定性均可能降低其定向分化的潛能，這也是未來研究亟須解決的問題。

1.3MSCs MSCs是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。1968年Friedenstein等[35]首次在骨髓中分離出MSCs。MSCs廣泛存在于人體骨髓、臍帶、脂肪、胎盤等組織中，具有易獲取、在體外也可保持增殖能力等優(yōu)勢(shì)，是目前研究最廣泛的干細(xì)胞[36]。MSCs以CD44、CD90、CD73、CD105、CD106、CD49等表面標(biāo)志物陽性和CD45、CD14、CD34、CD11b、CD19、人白細(xì)胞抗原-DR等表面標(biāo)志物缺失為特征[37]。MSCs治療肝硬化的機(jī)制主要包括其可轉(zhuǎn)化為HLCs、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)以及旁分泌等。

1.3.1轉(zhuǎn)化為HLCs 研究表明，無論何種來源的MSCs均可在細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、化合物等的誘導(dǎo)下分化為HLCs，表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物白蛋白、細(xì)胞角蛋白19、甲胎蛋白、肝細(xì)胞核因子4α等[38]。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，由MSCs轉(zhuǎn)化而來的HLCs表現(xiàn)出與肝細(xì)胞相似的功能，從而促進(jìn)肝損傷的修復(fù)；此外，MSCs來源的HLCs還具有與肝細(xì)胞相同的產(chǎn)白蛋白、糖原儲(chǔ)存、尿素分泌、低密度脂蛋白攝取等功能[39]。提示MSCs移植后分化為HLCs可能是其治療肝硬化的關(guān)鍵機(jī)制之一[40]。

1.3.2調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng) MSCs調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的途徑主要包括①調(diào)控巨噬細(xì)胞極化：巨噬細(xì)胞是一種廣泛分布于機(jī)體的免疫細(xì)胞，也是調(diào)節(jié)固有免疫的重要細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞又分為經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。輔助型T細(xì)胞(helper T cells，Th細(xì)胞)1細(xì)胞因子(如γ干擾素)、病原體等均可激活M1型巨噬細(xì)胞，分泌促炎因子[如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β等]，促進(jìn)肝損傷發(fā)展；若肝損傷持續(xù)，則巨噬細(xì)胞被Th2型細(xì)胞因子(如IL-4)誘導(dǎo)活化為M2型巨噬細(xì)胞，并分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等抗炎因子，促進(jìn)肝損傷修復(fù)[41]。巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化在肝損傷的發(fā)生和修復(fù)中均發(fā)揮重要作用。輸注MSCs后，小鼠體內(nèi)CD206+M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間的變化逐漸增加，并分泌基質(zhì)金屬蛋白酶13，促進(jìn)膠原降解；同時(shí)，MSCs還可通過抑制M1型巨噬細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞活化，發(fā)揮協(xié)同抗肝纖維化的作用[42]。表明MSCs可促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化[43]。Watanabe等[44]比較了MSCs單一治療與MSCs聯(lián)合骨髓來源巨噬細(xì)胞治療四氯化碳誘導(dǎo)的肝硬化的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療的療效顯著優(yōu)于MSCs單一治療。②影響T細(xì)胞分化：MSCs可通過抑制Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化，減少γ干擾素和IL-17分泌、促進(jìn)IL-10分泌，從而誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，使CD4+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗炎狀態(tài)，發(fā)揮治療作用[45]。③其他途徑：MSCs還可通過凋亡相關(guān)因子/凋亡相關(guān)因子配體途徑促進(jìn)T細(xì)胞凋亡[46]或通過下調(diào)樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志CD40、CD80、CD83、CD86以及主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)，降低其抗原呈遞能力[47]。以上研究表明，MSCs可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)逆轉(zhuǎn)肝損傷所致的免疫失衡，為MSCs治療肝硬化提供了科學(xué)依據(jù)。

1.3.3旁分泌功能 MSCs的旁分泌功能也是促進(jìn)肝再生、減輕肝損傷的重要機(jī)制之一。MSCs可表達(dá)各種細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子以及外泌體，從而間接或遠(yuǎn)程幫助組織修復(fù)[48]。因此，注射富含細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子以及外泌體的MSCs條件培養(yǎng)基可成為一種新的無致瘤性、無免疫排斥的治療肝硬化的方法[49]。

MSCs可分泌細(xì)胞外囊泡，而細(xì)胞外囊泡主要由微囊泡和外泌體組成。MSCs的治療作用可能與細(xì)胞外囊泡所包含的細(xì)胞因子有關(guān)，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、單核細(xì)胞趨化因子-1、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[50]。外泌體攜帶多種與MSCs相關(guān)的蛋白質(zhì)、脂類、DNA、信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA/miR)等，參與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過程[51-52]。來源于MSCs的外泌體與MSCs的治療作用相近，且具有體積小、便于生產(chǎn)和儲(chǔ)存等優(yōu)勢(shì)，是MSCs旁分泌的重要信使[53]。來源于MSCs的外泌體可抑制T細(xì)胞增殖以及γ干擾素、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α等促炎因子分泌，促進(jìn)抗炎因子IL-10分泌，從而減輕肝臟炎癥反應(yīng)；同時(shí)，還參與調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變，從而發(fā)揮抗纖維化作用[54]。miRNA是外泌體的關(guān)鍵分子，與肝纖維化程度密切相關(guān)，如肝臟中的miR-122水平最高，miR-122修飾的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可有效抑制纖維化小鼠肝臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和α平滑肌肌動(dòng)蛋白上調(diào)，通過負(fù)向調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的增殖和反式激活在肝纖維化的治療中發(fā)揮重要作用[55]。

此外，MSCs還可通過分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子)刺激肝細(xì)胞再生[56]。與單純MSCs相比，經(jīng)過肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子處理的MSCs抑制肝纖維化的療效更好，可提高受損肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型的細(xì)胞存活率[57]。因此，MSCs可能通過肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子途徑實(shí)現(xiàn)促肝再生作用。還有研究表明，使用IL-1β、γ干擾素等細(xì)胞因子對(duì)MSCs預(yù)處理可下調(diào)腫瘤壞死因子-α等促炎因子的表達(dá)，增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、單核細(xì)胞趨化因子1等的分泌，進(jìn)而提高M(jìn)SCs移植后的歸巢、增殖與分化潛能[58-59]。

2 MSCs治療肝硬化的臨床研究

目前MSCs治療肝硬化的機(jī)制已逐漸明確，且MSCs容易獲取、培養(yǎng)和擴(kuò)增，同時(shí)由于MSCs缺乏人類白細(xì)胞抗原Ⅱ和共刺激因子而具有較低的免疫原性[60]，因此臨床應(yīng)用前景廣闊。數(shù)據(jù)顯示，目前已有59項(xiàng)使用MSCs治療肝病的注冊(cè)臨床試驗(yàn)，其中大多集中于肝硬化或纖維化，且多為Ⅰ期、Ⅱ期或Ⅰ/Ⅱ期混合研究，尚無Ⅲ期臨床試驗(yàn)[61]。與門靜脈相比，肝動(dòng)脈是更佳的輸注途徑，且具有更好的歸巢效應(yīng)[62]。

一項(xiàng)Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗(yàn)納入8例肝硬化患者(包括4例乙型肝炎患者、1例丙型肝炎患者、1例酒精性肝炎患者和2例隱源性肝炎患者)，單次經(jīng)外周或門靜脈注射(3～5)×107個(gè)自體BMSCs，并于注射后1、2、4、8和24周評(píng)估患者肝功能和臨床特征，結(jié)果顯示，治療后患者的腹水均減少，且肝功能顯著改善(包括終末期肝病模型評(píng)分、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值和血清肌酐水平)[63]。Suk等[64]觀察自體BMSCs移植治療酒精性肝硬化的療效與安全性，以肝纖維化的改善程度(前后兩次肝活檢比較)為主要終點(diǎn)指標(biāo)，結(jié)果顯示，注射1次與注射2次BMSCs患者的肝組織膠原蛋白水平分別降低25%和37%，但療效與注射次數(shù)無關(guān)，且BMSCs移植可顯著改善Child-Pugh評(píng)分，同時(shí)不同劑量組不良事件的發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lin等[65]給予56例乙型肝炎病毒相關(guān)肝衰竭患者每周注射(1～10)×105個(gè)同種異體BMSCs，連續(xù)注射4周并隨訪24周，結(jié)果顯示，同種異體BMSCs注射可顯著改善患者肝功能，同時(shí)患者血清總膽紅素水平和終末期肝病模型評(píng)分均顯著降低。

另有研究將45例失代償期乙型肝炎肝硬化患者分為兩組，其中30例患者輸注臍帶來源的MSCs，另15例患者輸注0.9%的氯化鈉注射液，隨訪1年后發(fā)現(xiàn)，輸注臍帶來源MSCs患者的腹水量顯著減少，肝功能顯著改善，且無明顯不良反應(yīng)。由此認(rèn)為，輸注臍帶來源MSCs可能為失代償期肝硬化患者提供一種新的治療方法。Sakai等[66]對(duì)4例經(jīng)肝動(dòng)脈注射自體脂肪來源MSCs的肝硬化患者的研究顯示，2例患者血清白蛋白水平顯著改善，且未見嚴(yán)重不良事件發(fā)生。

以上研究表明，臍帶、骨髓或脂肪組織來源的MSCs治療肝硬化的耐受性良好，且安全有效。但也有研究認(rèn)為，自體BMSCs對(duì)失代償期肝硬化患者無效[67]。Moore等[68]系統(tǒng)回顧各種自體干細(xì)胞移植治療肝病的臨床研究發(fā)現(xiàn)，目前尚無明確的自體干細(xì)胞移植使肝硬化患者獲益的證據(jù)，這可能與早期臨床試驗(yàn)多為小規(guī)模的非對(duì)照研究、無法評(píng)價(jià)其真正臨床療效有關(guān)。

3 小 結(jié)

目前干細(xì)胞移植治療肝硬化的研究仍以基礎(chǔ)研究為主，臨床研究主要集中于MSCs。雖然MSCs移植治療肝硬化安全、有效，但未來仍需更大規(guī)模的臨床研究確定最佳的細(xì)胞來源、輸注途徑、劑量以及治療窗口等。由于MSCs在體內(nèi)可通過分化為肝細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等途徑促進(jìn)肝損傷修復(fù)；而預(yù)處理后的MSCs在體內(nèi)外均具有良好的肝細(xì)胞分化、歸巢能力以及高存活率和旁分泌效應(yīng)，因此，未來MSCs移植有望成為延長(zhǎng)肝硬化患者生存率的有效方法。