呂興幫，郝 賀，張 博，張永英，石玉祥，鐘翠紅

（河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000）

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）可感染人和動(dòng)物[1]。腸炎沙門氏菌是食源性疾病暴發(fā)的主要原因，感染后的畜禽可將細(xì)菌傳至其制品，與其他食物交叉感染造成食源性疾病傳播[2]。抗生素是主要的抗菌藥物，但因抗生素廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性正逐漸顯現(xiàn)[1]。在全球替抗的背景下，開發(fā)新型抗菌藥物成為熱點(diǎn)研究方向。

噬菌體是細(xì)菌的天然殺手，數(shù)量豐富、分布廣泛。噬菌體侵入細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行自身繁殖，通過釋放酶類物質(zhì)裂解細(xì)菌，釋放子代噬菌體。因抗生素耐藥特異性與細(xì)菌互作性在多數(shù)細(xì)菌物種中的發(fā)展傳播，噬菌體療法再次受到人們的關(guān)注[3]，并應(yīng)用于動(dòng)物和人類的食源性、環(huán)境病原體的生物控制。對(duì)噬菌體生物學(xué)和遺傳學(xué)的深入研究，有助于探索噬菌體的進(jìn)化規(guī)律并更好地解釋其與宿主細(xì)菌相互作用的分子機(jī)制。

1 腸炎沙門氏菌危害及耐藥性發(fā)展

歐美等國(guó)的食源性疾病多數(shù)由腸炎沙門氏菌引起，常造成數(shù)以千億的損失。據(jù)調(diào)查，僅在美國(guó)，腸道沙門氏菌每年引發(fā)約100 萬例食源性疾病[3]；歐盟成員國(guó)每年感染沙門氏菌病的患者約10～16萬人，沙門氏菌的發(fā)病率與蛋雞中存在的腸炎沙門氏菌顯著相關(guān)，表明雞蛋可能是引發(fā)人類疾病的主要感染源[4-5]。2012 年，Hulaj 等[6]對(duì)科索沃地區(qū)的39 個(gè)蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行抽樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)49%的樣本中均存在沙門氏菌感染，占比最高的血清型是腸炎沙門氏菌；對(duì)所分離菌株的耐藥性分析顯示，所有菌株均對(duì)慶大霉素、氨芐西林、磺胺甲惡唑、土霉素敏感，其中29 株（97%）對(duì)環(huán)丙沙星敏感；所有菌株對(duì)二甲胺四環(huán)素和鄰氯青霉素均表現(xiàn)中度耐藥或耐藥，26株（86%）對(duì)阿莫西林中度耐藥，27 株（90%）對(duì)鏈霉素完全耐藥。Wei 等[7]對(duì)我國(guó)貴州省2011～2016年間發(fā)生的食源性疾病病例進(jìn)行病原菌分離，對(duì)分離得到的16株臨床菌株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有菌株至少對(duì)一種抗生素耐藥性，耐藥率最高的是萘啶酸（98.7%），多數(shù)分離株（92.4%）對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性降低，同時(shí)觀察到細(xì)菌對(duì)第3、4代頭孢菌素耐藥。腸炎沙門氏菌已在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，抗生素可誘發(fā)細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，并且可對(duì)公共衛(wèi)生造成危害。因此，研發(fā)新型抗菌藥物對(duì)當(dāng)前的家禽養(yǎng)殖具有重要意義。

2 噬菌體及其產(chǎn)物

噬菌體是一種細(xì)菌病毒，由蛋白外殼和內(nèi)部核酸構(gòu)成，須寄生在活菌內(nèi)才可完成復(fù)制增殖。1982 年，國(guó)際病毒分類委員會(huì)規(guī)范了噬菌體的分類標(biāo)準(zhǔn)[8]，可根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為有尾噬菌體、無尾噬菌體和絲狀噬菌體。其中，有尾噬菌體數(shù)量最多，常見的T系烈性噬菌體均屬有尾噬菌體；根據(jù)其核酸類型，可分為DNA或RNA[9]，大體上細(xì)分為ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA；根據(jù)其作用特點(diǎn)，可分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體。烈性噬菌體可直接侵入細(xì)菌，在細(xì)菌內(nèi)部完成增殖并裂解宿主菌；溫和性噬菌體通過核酸整合，隨宿主菌共同分裂增殖，在特定的情況下裂解細(xì)胞。

噬菌體對(duì)靶細(xì)菌的裂解主要依靠自身產(chǎn)物-裂解酶。在裂解周期中，噬菌體在細(xì)菌宿主體內(nèi)表達(dá)其裂解基因，形成水解細(xì)菌細(xì)胞壁的裂解酶。裂解酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，與完整的噬菌體相比，可能更具有安全性[10]。裂解酶可直接作用于細(xì)菌，無需經(jīng)歷噬菌體的侵襲過程，但裂解酶的常規(guī)制備方法復(fù)雜，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。因此，通常使用基因重組技術(shù)制備大量目的蛋白。此外，基因重組也能夠優(yōu)化裂解酶的作用特性，利用重組技術(shù)擴(kuò)大裂解酶的裂解譜，進(jìn)而增強(qiáng)裂解效果。

3 噬菌體侵染細(xì)菌的途徑

噬菌體侵染細(xì)菌的途徑即是裂解周期，包括吸附、核酸注射、病毒粒子組裝以及子代病毒的釋放。

（1）吸附：是噬菌體生命周期的關(guān)鍵步驟之一，需要細(xì)菌包膜上的宿主表面蛋白、脂多糖或其他分子（磷壁酸、菌毛、鞭毛）的特異性識(shí)別。細(xì)菌表面受體識(shí)別導(dǎo)致噬菌體粘附于細(xì)菌，允許滲透細(xì)菌包膜及注射病毒遺傳物質(zhì)。

噬菌體吸附通常包括初始接觸、可逆結(jié)合和不可逆附著。初始接觸涉及由布朗運(yùn)動(dòng)、分散、擴(kuò)散或流動(dòng)引起的噬菌體和宿主之間的隨機(jī)碰撞，表明噬菌體與細(xì)菌結(jié)合需要一定的數(shù)量關(guān)系；在可逆結(jié)合中，噬菌體與細(xì)菌表面成分的結(jié)合不是決定性的，噬菌體可從宿主中解吸，這一過程由Garen 等[11]噬菌體洗脫分離試驗(yàn)確定；在不可逆結(jié)合中，噬菌體與細(xì)菌受體的結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行特異性連接，為之后的核酸注射創(chuàng)造條件。

（2）核酸注射：噬菌體將其核酸注射至細(xì)菌內(nèi)部需要一些裂解酶質(zhì)參與。噬菌體依靠其自身的裂解酶可裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，將自身核酸注入細(xì)胞。噬菌體的核酸接管細(xì)菌的合成系統(tǒng)，通過基因表達(dá)以合成噬菌體所需的核酸和蛋白質(zhì)[12]。

（3）病毒粒子組裝：噬菌體基因組指導(dǎo)宿主細(xì)胞合成相應(yīng)的結(jié)構(gòu)蛋白和子代病毒核酸，核酸經(jīng)由機(jī)構(gòu)蛋白包裹，形成頭部-尾絲及尾部的其他部件，頭尾結(jié)合，連接尾絲，組裝得到1個(gè)形狀和大小相同的成熟噬菌體。

（4）子代病毒釋放：子代噬菌體組裝完成，由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外，再次侵染宿主細(xì)胞，開始新一輪的復(fù)制周期。烈性噬菌體以溶解細(xì)胞的形式釋放，通常一個(gè)噬菌體經(jīng)過一輪裂解周期，可產(chǎn)生100～300個(gè)子代噬菌體。溫和性噬菌體通常隨宿主細(xì)胞進(jìn)行同步遺傳復(fù)制，這一過程不會(huì)裂解宿主細(xì)胞。

4 噬菌體于腸炎沙門氏菌的應(yīng)用進(jìn)展

噬菌體的發(fā)展歷史久遠(yuǎn)，但應(yīng)用條件較為苛刻，需要與靶細(xì)菌進(jìn)行特異性識(shí)別；且噬菌體進(jìn)入體內(nèi)的作用機(jī)制尚未得到完全闡釋，可能對(duì)機(jī)體存在潛在威脅。目前，噬菌體重獲關(guān)注，噬菌體的研究與發(fā)展得到極大推動(dòng)，應(yīng)用涉及多個(gè)領(lǐng)域，如疾病防控、環(huán)境消毒以及細(xì)菌檢測(cè)。

4.1 噬菌體的防控效果

有研究表明，家禽長(zhǎng)期使用噬菌體在減少寄生在消化道的沙門氏菌病原體數(shù)量方面具有良好效果。王曦等[13]通過糞便移植與噬菌體聯(lián)合治療，降低了經(jīng)沙門氏菌感染的雛雞死亡率，緩解了雛雞腸道炎癥損傷。Ahmadi等[14]在攻毒前對(duì)鵪鶉進(jìn)行噬菌體灌胃，發(fā)現(xiàn)噬菌體可降低體內(nèi)腸炎沙門氏菌的數(shù)量。Wernicki 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過氣溶膠噴霧消毒和口服接種噬菌體均可減弱腸炎沙門氏菌對(duì)肉雞的感染。腸炎沙門氏菌可通過垂直傳播。因此，被多重耐藥菌污染的雞蛋也是危害人類健康和公共衛(wèi)生安全的潛在隱患。Sonalika等[16]將雞蛋浸泡在菌液中進(jìn)行細(xì)菌接種，發(fā)現(xiàn)在雞蛋表面施用噬菌體可使雞蛋表面的細(xì)菌數(shù)量減少2×106CFU/mL。

4.2 噬菌體的消毒作用

與抗生素相比，噬菌體對(duì)環(huán)境幾乎沒有損害，可考慮使用噬菌體作為環(huán)境消毒劑。于曉妍等[17]研究顯示，經(jīng)大腸桿菌噬菌體噴霧30 min，雞舍內(nèi)消毒區(qū)域的細(xì)菌數(shù)量比對(duì)照組低99%。錢新杰等[18]以大腸桿菌噬菌體對(duì)地面細(xì)菌進(jìn)行噴霧消毒，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)噬菌體PNJ1809-11 處理的地面殘留菌落數(shù)量下降約2.5 個(gè)數(shù)量級(jí)，AB9殺滅效率為99.32%；經(jīng)噬菌體PNJ1809-13處理的地面菌落數(shù)量下降約1個(gè)數(shù)量級(jí)，殺滅效率為91.23%。綜上所述，噬菌體具有作為消毒劑的潛力，可為家禽生產(chǎn)中的沙門氏菌提供新的消毒策略。

4.3 噬菌體的檢測(cè)技術(shù)

噬菌體因?qū)λ拗鞲叨让舾泻吞禺愋詰?yīng)用于細(xì)菌的檢測(cè)。有些測(cè)定方法利用噬菌體裂解檢測(cè)細(xì)菌的胞內(nèi)成分，或以此產(chǎn)生的環(huán)境變化為細(xì)菌存在標(biāo)記；其他方法則通過檢測(cè)噬菌體的繁殖情況，作為目標(biāo)細(xì)菌的存在信號(hào)[19]。

Garrido 等[20]研究表明，建立沙門氏菌噬菌體B_SenS_PVP-SE2 擴(kuò)增與qPCR 結(jié)合的方法檢測(cè)雞樣本，可檢測(cè)到低濃度的活菌，節(jié)省了大量時(shí)間，提高靈敏度和準(zhǔn)確性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，基因工程噬菌體已成為監(jiān)測(cè)和檢測(cè)細(xì)菌病原體的有力工具。這種技術(shù)可應(yīng)用于檢測(cè)污染食品中的細(xì)菌，具有較高的選擇性和靈敏度[21]。Kim等[22]采用完整的luxABCDE操縱子檢測(cè)不同食物基質(zhì)中的沙門氏菌。此方法還可應(yīng)用于沙門氏菌的診斷和快速檢測(cè)。Choi 等[23]利用較高特異性及穩(wěn)定性的KFS-SE2 噬菌體作為生物傳感器的生物受體。此方法也可快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品上的腸炎沙門氏菌。

5 噬菌體的應(yīng)用前景

5.1 噬菌體應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)

（1）高度特異性：噬菌體因具有高度特異性成為替抗藥物。但與抗生素廣譜殺菌不同，噬菌體只靶向作用于腸道中特定的病原菌，對(duì)其他菌株無裂解作用，不會(huì)破壞區(qū)域中的其他微生菌群[24]。噬菌體只在宿主菌中增殖分裂，噬菌體的所有宿主被裂解，噬菌體會(huì)被自動(dòng)清除。

（2）高效性：噬菌體借助宿主細(xì)菌代謝系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自我維持。噬菌體藥物動(dòng)力學(xué)表明，噬菌體經(jīng)歷1個(gè)感染周期可產(chǎn)生200 個(gè)子代噬菌體，當(dāng)完成4 個(gè)感染周期，1 個(gè)噬菌體顆粒可產(chǎn)生數(shù)十億個(gè)子代噬菌體。因此，小劑量的噬菌體制劑即可清除宿主細(xì)菌，而抗生素往往需要多次用藥，維持在一定濃度才能達(dá)到預(yù)期治療效果[25-26]。

（3）適應(yīng)性：抗生素的殺菌成分相對(duì)固定，無法應(yīng)對(duì)細(xì)菌的持續(xù)進(jìn)化，治療耐藥菌存在一定的局限性。噬菌體作為一種活體微生物，可以同細(xì)菌共同進(jìn)化，并且還可以適應(yīng)抗性菌株，防止耐藥菌的生物膜形成或清除預(yù)先形成的生物膜[27]。

5.2 噬菌體應(yīng)用的局限性

（1）作用機(jī)制尚不明確：噬菌體和細(xì)菌之間的分子機(jī)制以及噬菌體在體內(nèi)的行為仍不完全明晰。噬菌體可在宿主體內(nèi)繁殖，根據(jù)所處環(huán)境的變化，也可能發(fā)生變異。這種變異結(jié)果無法判斷。噬菌體藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)仍需進(jìn)一步探索。因此，治療各種類型感染的噬菌體產(chǎn)品的最佳劑型尚未確定。

（2）免疫原性：基于病毒的生物學(xué)特性，盡管噬菌體不會(huì)感染人類細(xì)胞，但宿主的免疫系統(tǒng)可能會(huì)產(chǎn)生針對(duì)噬菌體的抗體，在噬菌體未作用細(xì)菌前將其清除。梁梅等[28]對(duì)噬菌體進(jìn)行免疫原性試驗(yàn)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，噬菌體組中的小鼠血清可產(chǎn)生針對(duì)噬菌體的抗體，表明噬菌體具有一定免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，這是噬菌體用藥需要克服的關(guān)鍵問題[29]。

（3）傳播耐藥基因：耐藥基因通常存在于各種可移動(dòng)基因元件（MGE）當(dāng)中，如質(zhì)粒、基因組島和轉(zhuǎn)座子，而水平基因轉(zhuǎn)移機(jī)制是食源性細(xì)菌病原體的抗生素抗性傳播增加的原因之一[30]。環(huán)境中的噬菌體（如污水、海洋、土壤）攜帶大量抗生素抗性基因ARGs，噬菌體可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將ARGs轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)菌。上述結(jié)果表明，噬菌體在與細(xì)菌相互進(jìn)化的過程中，具有轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的潛力，并且可能在抗生素耐藥傳播中發(fā)揮積極作用。因此，不應(yīng)低估噬菌體對(duì)環(huán)耐藥基因的傳播[31]。

6 展望

腸炎沙門氏菌作為重要的食源性病原菌之一，對(duì)畜禽生產(chǎn)及人類生活具有重要的防護(hù)意義。噬菌體可特異性殺滅腸炎沙門氏菌并中斷其流行傳播，噬菌體分離的蛋白質(zhì)具有巨大的醫(yī)療潛力，可應(yīng)用于環(huán)境消毒、食品保存、癌癥治療、疫苗開發(fā)、生物傳感裝置、治療基因和抗菌劑的靶向遞送等方面。但是，具體的作用機(jī)制仍未完全明晰。隨著科學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，噬菌體將作為一種生物制劑應(yīng)用于畜禽甚至整個(gè)養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)防控，噬菌體技術(shù)的成熟與完善將對(duì)醫(yī)療產(chǎn)生重要的推動(dòng)作用。