于瑞莉，馮永巍，黃麗俊，楊 婷

（無錫市食品安全檢驗檢測中心，國家市場技術創(chuàng)新中心（特殊食品），江蘇 無錫 214000）

特殊食品是指為滿足某些特殊人群的生理需要，或某些疾病患者的營養(yǎng)需要，按特殊配方而專門加工的食品，包括保健食品、嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學用途配方食品（簡稱特醫(yī)食品）和特殊膳食等。在食品原料中，葉酸、生物素和維生素B12（VB12）是常添加的3種水溶性B族維生素，是人體維持正常生理機能的一類重要且典型的微量營養(yǎng)素，在體內不能自身合成，必須通過食物或外界環(huán)境獲取和補充[1]。由于特殊食品針對的人群特殊，其添加量要求嚴格，因此對于這3種水溶性B族維生素的含量測定有非常重要的作用。但由于基質成分復雜，B族維生素添加量較低，且易受光熱分解[2]，使檢測難度大大增加。本文對葉酸、生物素和維生素B12常用的分光光度計法，熒光法、高效液相色譜、液相-質譜聯(lián)用法、微生物法和免疫法進行詳細分析討論，旨在為檢測工作者尋找一種簡便、精準、快速的檢測方法提供指導。

1 性質

葉酸（floic acid，維生素B9），包括天然的葉酸和用于強化食品和膳食補充劑的合成葉酸，其化學名稱是蝶酰谷氨酸，由蝶呤、對氨基苯甲酸和L-谷氨酸組成，對光敏感。葉酸缺乏會使單碳代謝嚴重異常，可導致慢性疾病和發(fā)育障礙，包括神經管缺陷[3]、巨紅細胞型貧血、癌癥及神經障礙等多種疾病。但是過量攝入合成葉酸又會引起并發(fā)癥[4-5]，如干擾人體對鋅的吸收，增加下一代患自閉癥的風險等。一般正常人葉酸的需求量為200～400 μg/d，世界衛(wèi)生組織建議成人至少為200 μg/d，孕婦和母乳為400 μg/d，不同年齡、不同階段的人需求量不同[6]。

生物素（biotin，維生素B7），是合成維生素C的必要物質。含3個不對稱碳原子的雙環(huán)化合物[7]共有8種同分異構體，穩(wěn)定性較好。作為羧化酶、羧基轉移酶、脫羧酶的輔酶參與人體的糖異生、脂肪酸和氨基酸代謝、能量傳遞過程。其長期攝入不足會影響蛋白質及RNA合成，降低身體免疫力[8]。

維生素B12（cobalamin，鈷胺素），是一類含有鈷離子的咕啉類化合物總稱[9]，是唯一含有金屬離子的水溶性維生素，在空氣中不穩(wěn)定，對光敏感。以輔酶形式參與各種代謝過程，在造血和健全神經系統(tǒng)功能方面有重要作用。缺乏維生素B12不僅導致巨幼紅細胞貧血，還會引起心臟病，神經紊亂，老年癡呆和帕金森綜合征等神經系統(tǒng)疾病[10-11]。

國家食品安全監(jiān)督抽檢對特殊食品中3種B族維生素的含量要求非常嚴格（見表1）[12]。由表可見，特殊膳食食品中尤其是孕、乳母營養(yǎng)補充食品、嬰兒配方食品對維生素添加量有嚴格的要求，特殊醫(yī)學用途嬰兒配方奶粉和嬰幼兒配方奶粉對3種B族維生素含量區(qū)間要求更窄，含量更低，需要檢測方法具備更高的靈敏度和更低的檢出限。

2 檢測方法

2.1 比色法

維生素檢測開展初期，比色法有較廣的普適性。葉酸檢測分為直接比色和衍生物比色法兩種。直接比色法是在堿性溶液中將葉酸溶解，測定葉酸的特征峰吸收值，從而確定樣品中葉酸含量。衍生法則需對樣品進行前處理，使用衍生化試劑與葉酸反應，合成其他穩(wěn)定且具有特征吸收峰的物質后再進行紫外測定。常用的衍生試劑有茚三酮、高錳酸鉀、N-(1-N)-二乙二胺等[19]。生物素測定則用無水乙醇提取，在硫酸乙醇溶液中生成橙紅色化合物，在一定范圍內顏色深淺與生物素含量成正比，根據吸光度即可判斷生物素的含量[20]。維生素B12在 278，361和550 nm波長處有最大吸收，可使用紫外-可見光分光光度計法進行含量測定[21]。該方法雖然操作簡單，但易被樣品中其他物質干擾，受儀器分辨率和樣品本底的影響較大，影響測定結果的準確度和精確性，因此不太適宜特殊食品中葉酸、生物素和維生素B12的檢測。

2.2 熒光法

對于自身含有熒光特性或是與標記物結合發(fā)光的 B 族維生素，可使用熒光法測定。生物素和維生素B12不具有熒光特性，關于此方法的研究鮮有報道。只有葉酸結構中的吡嗪嘧啶環(huán)含有特殊的吸收光譜,紫外光可將其轉化為熒光產物，采用熒光法和其他檢測手段相結合的方式進行測定。陳瓊等[22]采用固相萃取-HPLC柱后氧化衍生熒光法測定運動營養(yǎng)食品中葉酸的含量，趙海燕等[23]采用HPLC-柱后光化學衍生-熒光檢測方法，用于強化食品中葉酸測定。具有靈敏度高，重現性強的優(yōu)點，但它的缺點在于前處理復雜，不具備高效快速的特點，且檢出限較低，適用于特殊膳食但不適用于特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品中葉酸的檢測。

2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）已普遍用于特殊膳食中維生素測定。耿瑛等[24]采用鈦膠反相色譜柱，建立了同時測定功能飲料中的生物素、葉酸、維生素B12等5種維生素的HPLC法。孫璐璐等[25]通過固相萃取-HPLC實現了對營養(yǎng)強化餅干中維生素B12含量的快速精確測定，檢出限0.1 mg/kg。

HPLC一般適用于添加形式明確，且含量較高的特殊膳食中維生素的檢測。但李貽[26]用HPLC和HPLC-MS分析嬰幼兒配方乳粉中B12含量，得出結論：HPLC因檢測重復性好，結果準確，適用于維生素B12含量高的樣品，但是靈敏度不高，儀器檢出限較高，對于含量低的樣品不宜準確檢出。所以由于方法的局限性，特醫(yī)食品中葉酸、維生素B12的檢測較少采用HPLC。

2.4 液相色譜串聯(lián)質譜

液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）相對于HPLC，有更強大的組分分離與鑒定能力，也有較低的檢出限；不僅可準確測定維生素含量較高的特殊膳食，也可測定特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品中維生素含量。張辰辰等[27]利用超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）測定特醫(yī)食品中生物素、葉酸、維生素B12等8種維生素，定量限為4～10 μg/100 g，加標回收率達85.52 %～116 %，RSD為0.49 %～4.10 %。陳美君等[28]建立了一種能同時測定嬰幼兒配方奶粉中 11 種 B 族維生素的超高壓液相色譜-串聯(lián)質譜法，采用電噴霧離子源正離子模式，方法線性范圍良好，樣品前處理方法簡單，靈敏度高。盧蘭香等[29]采用免疫親和柱進行凈化，建立了LC-MS測定特醫(yī)食品中生物素的方法。

但是LC-MS/MS的測定與其標準溶液相關性較強，而這3種維生素在特殊食品中的存在形式較復雜。葉酸衍生物種類多，LC-MS/MS測定的只是不同衍生物的含量，盡管Ndawa等[30]將衍生物轉化為5-甲基四氫葉酸或多種純化方式分別測得多種衍生物含量，但是葉酸及其衍生物不穩(wěn)定，且易在提取和測定過程中發(fā)生氧化降解或衍生物間相互轉化，導致難以準確測定葉酸總量。而維生素B12的主要存在形式包括羥基鈷胺素、氰基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素[31]，不同于允許添加到食品中的維生素B12的種類（氰鈷胺、羥鈷胺和鹽酸氰鈷胺）[32]，且維生素B12幾乎都是借助于微生物發(fā)酵獲得，其基質復雜，儀器法難以滿足準確測定要求。生物素有8種同分異構體，陳杰峰等[33]通過同位素內標和LC-MS/MS測定的嬰幼兒配方奶粉中B6和生物素含量，其中生物素質控樣品測定值（每100 g 含0.1906 mg）低于質控樣品特性值區(qū)間（每100 g 含1.346±0.093 mg），且6個實際樣品的檢測結果普遍低于國標法，最高偏差達3.9 %，可見LC-MS/MS并不能準確測定嬰幼兒配方食品中生物素的含量。LC-MS/MS作為更先進的手段，盡管具有較低的檢出限，更高靈敏度，更簡單的操作，但是在特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品葉酸、生物素和維生素B12檢測的準確性和全面性方面還存在缺陷。

2.5 微生物法

目前，傳統(tǒng)微生物法是我國現行檢測標準，同時也是美國官方分析化學家協(xié)會（AOAC）和美國藥典（USP）的推薦方法。我國現行檢測方法為：《GB5009.211-2014 食品安全標準 食品中葉酸的測定》[34]、《GB5009.259-2016食品安全標準 食品中生物素的測定》[35]和《GB5413.14-2010食品安全標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》[36]。

葉酸主要是以葉酸衍生物的形式存在[37]，最主要的天然葉酸形式包括[38]：5-甲酰四氫葉酸、5-甲基四氫葉酸、四氫葉酸和葉酸；不同葉酸衍生物又包含單谷氨酸形式和多聚谷氨酸形式的葉酸，具有生物活性的多達100余種[39-40]。生物素共有8種同分異構體，但只有全順式結構的D-生物素具有生理活性[41]，D-生物素的存在形式又分為游離狀態(tài)與結合狀態(tài)。維生素B12的存在形式也不單一。微生物法利用相應的營養(yǎng)缺陷型菌種對特定維生素有很強的特異性，在一定條件下，其生長和繁殖速度與溶液中維生素的含量成一定對應關系；可測定具有生物活性的維生素，測定結果更準確，范圍廣，靈敏度高，能滿足含量低和基質復雜的特殊食品檢測。

但是國標中傳統(tǒng)微生物法的諸多缺點也限制了該法的實際應用范圍。如葉酸、維生素B12對光敏感，分析過程均需避光操作，對環(huán)境要求高；實驗關鍵點多，且要求平行管之間結果偏差不得超過10 %；由于產品實際含量一般高于標示值，精準把握樣品稀釋倍數，使其落入合適的線性區(qū)間的難度加大，導致對檢驗員的操作水平和檢測經驗要求提高；為了保證測定用菌種的活力需傳代2～3代，萊士曼氏乳酸桿菌活力較差，菌種活化時間需2～4 d，維生素的檢測周期一般需要4～6 d；另外如果保存不當或傳代過多，菌種易變異失去對維生素的特異性，嚴重影響檢測結果。葉酸測定中所使用的鼠李糖乳桿菌只可測定出單尾形式的葉酸或含2～3個谷氨酸尾的葉酸，對長鏈的谷氨酸葉酸衍生物的響應較弱[42]。生物素的8種異構體中只有1種具有較高的生物活性，采用微生物法不能分離并測定出該種異構體的含量。另外，陳緒華等[43]研究發(fā)現，國產培養(yǎng)所含本底較高，標準曲線線性較差。

此外，微生物法實驗過程中需大量的玻璃器皿，所有玻璃器皿及用具均需嚴格清洗、酸泡和干熱滅菌，工作量較大。近年，研究人員也對國標微生物法進行了改進。主要優(yōu)化方向是縮小反應體系，如微孔板式定量檢測試劑盒。涂曉波等[44]對奶粉中生物素、葉酸及維生素B12，利用自主研發(fā)與進口維生素檢測試劑盒進行了對比分析，發(fā)現自主研發(fā)試劑盒操作較簡便。楊小平等[45]采用EP管代替試管，通過等比例縮小反應測定嬰幼兒配方奶粉中葉酸含量，加標回收率為98 %-107.5 %。余文等[46]采用96孔板代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)，酶標儀代替分光光度計，實現了快速檢測。但是也存在檢測結果偏低的情況，另外試劑盒比較昂貴，檢測成本高，普及率較低。諸多問題使微生物法將逐漸被其他簡便、快速、準確的方法替代。

2.6 免疫法

免疫學分析技術是基于免疫學原理設計的對目標樣本進行定性或定量檢測的實驗手段。通過免疫分析技術，可實現對抗原、抗體等免疫相關物質的測定。其中，酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是在免疫酶技術的基礎上發(fā)展的一種新型的免疫測定技術，是目前最具有發(fā)展前景的技術之一，在特殊食品領域已逐步開始應用。李江等[47]采用間接競爭ELISA方法，得出嬰幼兒配方奶粉中維生素B12含量，快速靈敏、準確、操作簡便、無需貴重儀器設備，檢出限3 μg/kg。葉酸測定中，由于單谷氨酸葉酸、多谷氨酸葉酸、葉酸衍生物與葉酸結合蛋白的親和性不相同，會影響測定的靈敏度，楊霈瑤[19]提出了通過制備葉酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的抗體，并在此基礎上利用酶免疫試驗的基本原理，建立一種簡單快速的檢測方法。樂振竅等[48]采用ELISA測定功能食品中維生素B12的含量，結果準確度和精密度與AOAC方法達到同等效果。Kong等[49]開發(fā)了一種間接競爭性酶聯(lián)免疫吸附法檢測不同營養(yǎng)強化中維生素B12的 4 種主要形式（氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺）的方法，其檢測限為0.065 ng/ml，回收率為81 %～122 %。

此外，熒光免疫層析技術是免疫法中的基于抗原抗體特異性免疫反應的另一種新型膜檢測技術。主要基于抗原抗體特異性識別原理和層析反應模式，能快速、準確地測定特殊食品中維生素含量。劉海英[50]對生物素含量的檢測采用熒光微球免疫層析方法，熒光微球等發(fā)射光譜型標記物因信號強度可隨激發(fā)光增強而增強，可有效降低層析方法的檢測限。以EDC/NHS介導的兩步法偶聯(lián)合成適用于免疫層析檢測的熒光微球探針。熒光微球探針粒度均一、化學及光學性質穩(wěn)定。以此建立的以生物素為目的物的免疫層析檢測方法，最終檢測限可達3 ng/ml，遠低于其他檢測方法；靈敏度亦高于微生物法及HPLC，且檢測時間較短，檢測成本低廉。

3 討論

維生素B12、葉酸和生物素的檢測方法正處于優(yōu)化和創(chuàng)新的發(fā)展期，找到適合特殊食品中不同樣品基質的最佳方法是目前研究人員的努力方向。分光光度法雖然操作簡單，但測定結果的準確度低和精確性差，因此不適于檢測特殊食品中3種維生素。熒光法可靠性存在缺陷，需要和其他檢測手段結合，由于生物素和維生素B12無紫外和熒光發(fā)色集團，只適用于特殊膳食中葉酸測定，不適于其他特殊食品的測定；HPLC適用于添加形式明確，且含量較高的特殊膳食中3種維生素檢測，但對于某些基質成分較復雜、含量低于儀器檢出限的特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品，檢測還存在缺陷。LC-MS/MS做為更先進的手段，檢出限低，靈敏度高，操作簡單，但準確性和全面性方面還有不足。微生物法雖然是目前針對特殊食品這3種維生素的首選方法，特異性好、靈敏度較高，但由于操作關鍵點多，微生物生長周期長，工作量大，對環(huán)境、人員、菌種和培養(yǎng)基要求高等問題，應用有限；相比之下，作為目前研究熱點的免疫法而言，有檢驗靈敏度高、檢測限低、特異性好、樣本處理量大、檢驗時間短、準確、操作簡便、無需貴重儀器設備等諸多優(yōu)點，更適用于特殊食品，尤其是特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品的檢測，具有廣泛的開發(fā)空間和應用前景。