肖植文 喻敏 李菲

近年來(lái)，已出現(xiàn)較多急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）治療的新藥，這些新藥給予復(fù)發(fā)/難治性患者獲得再次緩解的機(jī)會(huì)，但在年輕復(fù)發(fā)AML 的預(yù)后評(píng)估中，高危患者占比約為66%，而5 年總生存率 （overall survival，OS）僅為4%[1]，提示有必要探索治療復(fù)發(fā)難治性AML 的其他有效方案。 在其他血液學(xué)腫瘤免疫療法治療成功案例的推動(dòng)下，嵌合抗原受體修飾T 細(xì)胞 （chimeric antigen receptor Tcell，CAR-T）免疫療法已在部分復(fù)發(fā)/難治性AML 患者的治療中得到了應(yīng)用。

1 嵌合抗原受體的基本結(jié)構(gòu)及其作用

嵌合抗原受體 （CARs）是一種人工合成的受體，可以引導(dǎo)淋巴細(xì)胞識(shí)別并消除表達(dá)同源靶向配體的細(xì)胞。CARs 由胞外靶向連接區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)4 個(gè)部分組成。胞外靶向連接區(qū)是CART 細(xì)胞外部，其識(shí)別目標(biāo)抗原并改變CARs 表達(dá)的淋巴細(xì)胞的特異性。胞外靶向連接區(qū)主要是由單克隆抗體的重鏈可變區(qū) （VH）和輕鏈可變區(qū) （VL）通過(guò)連接肽 （linker）連接而成的單鏈可變片段 （single-chain variable fragment，scFv）[2]。鉸鏈區(qū)起著連接CAR 的外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域的作用?？缒^(qū)主要是由Ⅰ型膜蛋白衍生出來(lái)，如CD3、CD4、CD8 或CD28。胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)主要是由1 個(gè)或多個(gè)共刺激因子 （costimulatory molecule，CM）和1 個(gè)激活域組成[3]。常用的共刺激因子是以CD28 為代表的B7 家族和以4-1BB 為代表的腫瘤壞死因子受體家族。其中具有CD28 結(jié)構(gòu)域的CAR-T 細(xì)胞具有更高效、更快速的細(xì)胞毒能力，具有4-1BB 共刺激域的CAR-T 細(xì)胞在患者體內(nèi)保留時(shí)間更長(zhǎng)[4]。

2 CAR-T 治療AML 的臨床應(yīng)用靶點(diǎn)

2.1 CD33-CAR-T

CD33 在幾乎90% 的AML 病例中表達(dá)于白血病細(xì)胞亞群，包括白血病干細(xì)胞，以及一些正常的髓系祖細(xì)胞。CD33 為AML 免疫治療的1 個(gè)具有吸引力的靶點(diǎn)。解放軍總醫(yī)院對(duì)1 例復(fù)發(fā)難治性AML 患者開(kāi)展的臨床試驗(yàn)[5]，在輸注總計(jì)1.12×109CD33-CART 細(xì)胞后，2 周后骨髓原始細(xì)胞明顯減少，由原先＞50%下降至＜6%，卻在第3 周開(kāi)始上升至22%，第5周為27%，第9 周接近70%，疾病逐漸加重，患者直至第13 周死亡。美國(guó)安德森癌癥中心報(bào)道的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中[6]，3 例接受抗CD33-CAR-T 輸注治療的患者中，2 例患者分別發(fā)生3 級(jí)和2 級(jí)細(xì)胞因子釋放綜合征 （cytokine release syndrome，CRS），1 例發(fā)生2 級(jí)免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征 （immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）。最終3 例患者在1 個(gè)月內(nèi)均因疾病進(jìn)展而死亡。由于CD33 不僅在白血病細(xì)胞上表達(dá)，而且在幾乎所有健康的髓細(xì)胞和祖細(xì)胞上表達(dá)，CAR-T 細(xì)胞治療不良反應(yīng) （包括CRS、ICANS）是臨床前實(shí)驗(yàn)和CD33 靶向治療臨床試驗(yàn)中不可回避的問(wèn)題，也是目前臨床應(yīng)用需要克服的難題。Liu 等[7]構(gòu)建出第3 代CD33-CART 在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較長(zhǎng)的持久性及較小的細(xì)胞毒性，但還需更多的臨床前實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其效果。

2.2 CD123-CAR-T

CD123 在A(yíng)ML 中表達(dá)也相當(dāng)普遍，60%～80%的AML 細(xì)胞高表達(dá)CD123，但在正常造血干細(xì)胞中表達(dá)水平較低或不表達(dá)。CD123 也是非常具有吸引力的治療靶點(diǎn)。在CD123 重定向CAR-T 細(xì)胞治療AML 的臨床前研究模型中顯示，抗CD123-CAR-T 會(huì)導(dǎo)致正常造血細(xì)胞顯著減少[8]。Sun 等[9]報(bào)道了單例患者在使用抗CD123-CAR-T 細(xì)胞治療后最終實(shí)現(xiàn)了完全緩解 （complete response，CR）。在輸注后第6 日，患者骨髓造血干細(xì)胞從38% 降至8%，第18 日行異基因造血干細(xì)胞移植，第42 日完成異基因造血干細(xì)胞移植但仍未脫離血小板及紅細(xì)胞輸注，于第56 日死于急性移植物抗宿主?。╝cute graft versus host disease，GVHD）、重癥肺炎、多器官功能衰竭。目前，研究肯定了抗CD123-CAR-T 細(xì)胞在A(yíng)ML 患者中的治療效果，但仍提出了血液學(xué)毒性的問(wèn)題。有研究通過(guò)構(gòu)建以CD28 為共刺激域并結(jié)合zeta 信號(hào)結(jié)構(gòu)域的CD123-CAR-T 具有較好的安全性及有效性[10]。

2.3 CLL-1-CAR-T

C 型凝集素樣分子 （C-type lectin-like molecule-1，CLL-1）是Ⅱ型跨膜糖蛋白，起抑制受體的作用。白血病干細(xì)胞 （leukemic stem cell，LSC）被認(rèn)為是AML治療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因。CLL-1 在LSC 中低表達(dá)及存在個(gè)體差異表明CLL-1 并非1 個(gè)通用的LSC標(biāo)記，但是CLL-1 在正常的造血干細(xì)胞和非造血組織表達(dá)中有限，預(yù)測(cè)CLL-1 將會(huì)是某些亞組患者的較好靶點(diǎn)，需要根據(jù)個(gè)體化的表達(dá)水平來(lái)選用CLL-1 靶點(diǎn)進(jìn)行治療。動(dòng)物模型中顯示，抗CLL-1-CAR-T 細(xì)胞對(duì)CLL-1 陽(yáng)性的AML 動(dòng)物具有治療效應(yīng)，但由于CAR-T 細(xì)胞持久性不足而復(fù)發(fā)[11]。有研究報(bào)道3 例兒童AML 患者接受抗CLL-1-CAR-T 細(xì)胞治療后，均達(dá)到了完全緩解（complete response，CR），并接受了造血干細(xì)胞移植，提示抗CLL-1-CAR-T 細(xì)胞可能能為某些白血病患者提供后續(xù)造血干細(xì)胞移植的機(jī)會(huì)[12]。目前認(rèn)為抗CLL-1-CAR-T 細(xì)胞安全性良好，不具有造血干細(xì)胞靶向的潛在毒性。

2.4 CD19-CAR-T

AML 中CD19的異常表達(dá)通常與t（8;21）（q22;q22）相關(guān)，未出現(xiàn)染色體易位的AML 及混合表型急性白血病也可有CD19 異常表達(dá)，已有臨床前研究報(bào)道抗CD19-CAR-T 細(xì)胞對(duì)CD19+AML 細(xì)胞具有殺傷力和應(yīng)用潛力。有研究報(bào)道2 例t（8;21）CD19+AML 男性患者接受抗CD19-CAR-T 細(xì)胞治療的案例[13]，1 例患者在接受抗CD19-CAR-T 細(xì)胞治療后達(dá)到細(xì)胞形態(tài)學(xué)緩解 （morphological CR,mCR）持續(xù)10 個(gè)月，另1例患者在接受抗CD19-CAR-T 細(xì)胞治療后達(dá)到血液學(xué)緩解 （hematological CR,hCR）和mCR。在接受CD19-CAR-T 細(xì)胞治療后，2 例患者AML 細(xì)胞中CD19+占比分別從40.1% 和22.6% 下降至14.3%和6.5%?；颊咭蚪?jīng)濟(jì)原因拒絕進(jìn)一步治療，最終于抗CD19-CAR-T 細(xì)胞治療后第3 個(gè)月復(fù)發(fā)，于第5 個(gè)月死亡。2 例患者都曾出現(xiàn)短暫的4 級(jí)血細(xì)胞減少，隨后很快恢復(fù)。有研究同樣報(bào)道1 例復(fù)發(fā)難治性AML男性患者[14]，流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)CD19 異常表達(dá)，在接受抗CD19-CAR-T 細(xì)胞治療后第28 日達(dá)到臨床和分子學(xué)緩解，4 個(gè)月后仍持續(xù)緩解。提示CD19-CAR-T 細(xì)胞治療效果尚佳，但由于病例數(shù)較少，還需要更多的臨床試驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

2.5 NKG2D-CAR-T

NKG2D 配體表達(dá)在包括AML 在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，但在正常成人組織中未廣泛表達(dá)。Marofi 等[15]研究顯示7 例接受抗NKG2D-CAR-T 細(xì)胞治療的AML 患者中，2 例患者疾病穩(wěn)定超過(guò)1 年，2 例患者疾病穩(wěn)定6 個(gè)月后進(jìn)展，3 例患者僅改善了癥狀在6個(gè)月之內(nèi)陸續(xù)死亡。在另外一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中[16]，12 例復(fù)發(fā)難治性AML 患者接受抗NKG2D-CAR-T 細(xì)胞治療后，僅2 例患者達(dá)CR 時(shí)間超過(guò)3 個(gè)月，并在之后行異基因造血干細(xì)胞移植，持續(xù)CR 時(shí)間超過(guò)28 個(gè)月，5 例患者在3 個(gè)月之內(nèi)疾病進(jìn)展，3 例患者因其他原因死亡，2 例患者病情穩(wěn)定。由于在A(yíng)ML 患者中NKG2D 配體的表達(dá)差異性較大，抗NKG2D-CAR-T細(xì)胞對(duì)AML 患者治療效果還有待于進(jìn)一步觀(guān)察。

2.6 LewisY

Lewis 抗原在多種上皮來(lái)源的腫瘤中過(guò)度表達(dá)，在早期髓系祖細(xì)胞和相應(yīng)的CD34+白血病細(xì)胞系也有表達(dá)。在一項(xiàng)早期抗LewisY-CAR-T 細(xì)胞治療的Ⅰ期研究中顯示[17]，接受抗LewisY-CAR-T 細(xì)胞治療的4 例AML 患者中，3 例患者在接受CAR-T 細(xì)胞輸注時(shí)有微小殘留病灶 （minimal residual disease，MRD）的依據(jù)，輸注后49 天、5 個(gè)月、23 個(gè)月后疾病進(jìn)展。所有患者均未觀(guān)察到3 級(jí)或4 級(jí)不良反應(yīng)。雖然僅觀(guān)察到有限的療效，但這項(xiàng)研究表明CAR-T 細(xì)胞可以在A(yíng)ML 患者體內(nèi)有治療效果且無(wú)明顯不良反應(yīng)。

2.7 CD38-CAR-T

CD38 在大多數(shù)AML 細(xì)胞上表達(dá)，但在健康的人類(lèi)造血干細(xì)胞上不表達(dá)。因此，CD38 是治療AML的潛在靶點(diǎn)。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)顯示[18]，在6 例異基因造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)且接受多組搶救治療均無(wú)效的CD38+AML 患者中，4 例患者在第4 周達(dá)到了CR，其中1 例CR，3 例伴骨髓恢復(fù)不完全的完全緩解（CR with incomplete count recovery，CRi），1 例患者無(wú)反應(yīng)，1 例疾病進(jìn)展。4 例CR 患者中，其中2 例患者復(fù)發(fā)，1 例于117 日后復(fù)發(fā)，予以抗CD38-CAR-T 細(xì)胞治療后再次CR，1 例患者死亡。6 例患者中位總生存期和無(wú)白血病生存期分別為7.9 個(gè)月和6.4 個(gè)月。

3 CAR-T 治療AML 的潛力靶點(diǎn)

Fms 樣酪氨酸激酶3 （FLT3）是AML 中最常見(jiàn)的基因突變之一，約占AML 病例的30%。Wang 等[19]的研究顯示，抗FLT3-CAR-T 細(xì)胞在體外有很強(qiáng)的FLT3+AML 細(xì)胞殺傷能力，能延長(zhǎng)AML 小鼠的生存期且不會(huì)損傷健康的造血干細(xì)胞。Shrestha 等[20]的研究也顯示了同樣的結(jié)果。CD44 是一種跨膜蛋白，CD44v 是CD44 的一種亞型，僅在上皮細(xì)胞及造血細(xì)胞亞群上表達(dá)。早期一項(xiàng)研究顯示抗CD44v6-CART 在體外及小鼠體內(nèi)對(duì)AML 細(xì)胞均有殺傷效果，而對(duì)造血干細(xì)胞沒(méi)有影響，僅單核細(xì)胞減少[17]。葉酸受體β （folate receptor β,FRβ）表達(dá)于髓系造血細(xì)胞，在70%AML 中表達(dá)。Ghamari 等[21]已經(jīng)證實(shí)葉酸受體β 為AML 治療的潛在靶點(diǎn)，抗FRβ-CAR-T 細(xì)胞在體外及小鼠體內(nèi)均具有抗白血病效果，且未發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞毒性。

4 復(fù)合CAR-T 在A(yíng)ML 中的應(yīng)用

構(gòu)建這種雙CAR 的主要目的是減少由于克隆逃逸丟失一個(gè)靶向抗原而導(dǎo)致的復(fù)發(fā)機(jī)會(huì)。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)CD33-CLL-1 組合靶向是兒童AML 中最有前途的靶向組合[22]。體外實(shí)驗(yàn)顯示，抗CLL-1-CD33 CAR-T 對(duì)CD33 或CLL-1 陽(yáng)性的細(xì)胞株以及AML患者的原發(fā)性白血病樣本具有特異性的抗腫瘤活性。Hazelton 等[23]進(jìn)行的一項(xiàng)首次在人體內(nèi)進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，將抗CLL-1-CD33CAR-T 細(xì)胞用于1 例6歲復(fù)雜核型并對(duì)多種治療耐藥的AML 女性患者，治療安全且耐受性良好，在注射CAR-T 細(xì)胞治療后第19 日骨髓穿刺顯示MRD陰性。在第44 日接受異體干細(xì)胞移植后達(dá)到CR。

基于上述研究數(shù)據(jù)，雙靶點(diǎn)治療策略以防止抗原下調(diào)已被證明是有效的。但無(wú)證據(jù)表明雙靶向CAR會(huì)增加CAR-T 細(xì)胞相關(guān)不良反應(yīng)的臨床發(fā)生率，由于可用數(shù)據(jù)有限，不能排除這種可能性。

5 CAR-T 細(xì)胞治療的不良反應(yīng)

CRS 是CAR-T 細(xì)胞治療最常見(jiàn)的不良反應(yīng)，主要由細(xì)胞因子過(guò)度釋放引起。CRS 的臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱伴疲勞、關(guān)節(jié)痛、僵直等，然后迅速進(jìn)展為低血壓、心動(dòng)過(guò)速、缺氧等。發(fā)熱通常是CRS 的首要和最必須的癥狀。目前，認(rèn)為早期應(yīng)用托珠單抗 （tocilizumab）可以降低嚴(yán)重CRS 的發(fā)生率，而不影響CAR-T細(xì)胞，或是使用大劑量皮質(zhì)類(lèi)固醇激素通過(guò)抑制CART 細(xì)胞和旁路免疫細(xì)胞來(lái)緩解[24]。ICANS 可與CRS同時(shí)發(fā)生，也可獨(dú)立于CRS 發(fā)生?？杀憩F(xiàn)為譫妄、昏迷、癲癇、腦水腫。目前，對(duì)ICANS 發(fā)生機(jī)制了解較少。類(lèi)固醇激素是一線(xiàn)治療，托珠單抗對(duì)血腦屏障穿透力較差，在解決神經(jīng)毒性方面療效較差[25]。

6 結(jié)語(yǔ)

在B 細(xì)胞惡性腫瘤中，CAR-T 細(xì)胞取得較好的療效，但CAR-T 對(duì)AML 的治療價(jià)值仍未確定。尋找合適的具有低非靶向毒性的靶點(diǎn)和減少非靶向毒性是目前應(yīng)用CAR-T 治療AML 面臨的挑戰(zhàn)。在已有的具有低毒性靶點(diǎn)上可進(jìn)行更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步明確治療效果及安全性。在減少非靶向毒性上可以做更多的嘗試，如在CAR 中植入自殺基因、構(gòu)建臨時(shí)表達(dá)的CAR、提高CAR 的親和力與復(fù)合CAR 的選擇。