袁瑋藝，黃 凱，原 宇，鄭芳芳，唐耀松，林小楓，童德文*，杜 謙*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西富強(qiáng)宏圖牧業(yè)有限公司，陜西韓城 715412)

近年來(lái)，陜西省韓城市大規(guī)模引進(jìn)北京鴨良種，建設(shè)了大型規(guī)?；本嗮B(yǎng)殖場(chǎng)，但養(yǎng)殖數(shù)量的增加也伴隨著疾病的發(fā)生和傳播速度增加，給養(yǎng)殖企業(yè)帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)和損失。在規(guī)?；嗮B(yǎng)殖場(chǎng)中鴨大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是常見(jiàn)的致病病原[1]。E.coli主要威脅2周齡～6周齡雛鴨，感染可導(dǎo)致鴨突然發(fā)病，病死率高，常見(jiàn)敗血型鴨大腸桿菌病，剖檢可見(jiàn)由于滲出導(dǎo)致的心包炎、肝周炎、腹膜炎和氣囊炎等，但其病變與RA感染導(dǎo)致的鴨傳染性漿膜炎臨床癥狀相似度較高，需要實(shí)驗(yàn)室分離病原菌鑒別[1-2]。2020年8月，陜西省韓城市某北京鴨養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生一起雛鴨急性死亡疫情，為了能及時(shí)確定病因，以便于后續(xù)有針對(duì)性地防控養(yǎng)殖場(chǎng)流行的鴨病，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的病死雛鴨和病危雛鴨進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)和病原學(xué)檢測(cè)，為本起雛鴨急性死亡疫情的診斷提供依據(jù)，為減少北京鴨養(yǎng)殖企業(yè)的損失提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 陜西省韓城市某北京鴨養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生雛鴨急性死亡，送檢5只病死雛鴨和5只病危雛鴨，剖檢采集雛鴨肝臟、脾臟、肺臟、心臟和腎臟等組織，以及心包和腹腔滲出物。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡～6周齡的昆明系小鼠，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.3 主要試劑 2×TaqMaster Mix(Dye plus)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，南京Vazyme公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000，北京聚合美公司產(chǎn)品；巧克力培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；血瓊脂平板、TSA和抗菌藥物藥敏紙片，湖南比克曼生物科技有限公司產(chǎn)品；TSB，北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；DNA提取液，北京索萊寶公司產(chǎn)品；TRIzol，美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀，Thermo公司產(chǎn)品；紫外凝膠成像系統(tǒng)，上海培清科技有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-7C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢 按常規(guī)方法對(duì)送檢雛鴨進(jìn)行剖檢，觀察主要臟器的病理變化，采集雛鴨肝臟、脾臟、肺臟、心臟和腎臟等組織，以及心包和腹腔滲出物用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 引物合成 參考地方標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和期刊文獻(xiàn)等(表1)合成鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)、鴨大腸埃希氏菌(E.coli)、鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)、鴨腺病毒Ⅰ型(Fowl adenovirus Ⅰ，F(xiàn)AdV Ⅰ)、鴨腺病毒Ⅱ型(FAdV Ⅱ)、鴨甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)、番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duckling parvovirus，MDPV)和禽流感病毒H9(Avian influ-enza virus H9，AIV H9)等病原的檢測(cè)引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 組織DNA提取 將采集的雛鴨組織勻漿后在-80 ℃反復(fù)凍融，離心取上清。部分上清用于DNA的提取，加入10 mg/mL終體積SDS和0.5 mg/μL終濃度蛋白酶K，顛倒混勻1 min，56 ℃水浴30 min。加入等體積DNA提取液，振蕩混勻5 min后，12 000 r/min離心5 min。吸取上清，加入等體積氯仿，混勻5 min后，室溫12 000 r/min離心5 min。吸取上清，加入1/10體積2 mol/L乙酸鈉和2倍體積無(wú)水乙醇，在-80 ℃過(guò)夜。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 mL 750 mL/L乙醇洗滌2次，4 ℃離心棄上清，自然風(fēng)干后加入ddH2O溶解，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 組織cDNA的獲得 取組織凍融離心上清，加入適量TRIzol溶液，劇烈振蕩10 min；加入1/5體積氯仿，充分混勻后作用5 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；吸取適量上清，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫作用10 min，在-80 ℃沉淀30 min以上，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；棄上清，加入750 mL/L乙醇洗滌2次，4 ℃離心棄盡上清，風(fēng)干，加入適量DEPC H2O溶解。將提取的RNA以反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 病原PCR檢測(cè) 對(duì)于不同病原分別以提取的DNA或反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用相應(yīng)特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)菌的培養(yǎng)及鑒定 將采集的心包和腹腔滲出物分別接種TSA/巧克力培養(yǎng)平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)菌藥敏試驗(yàn) 利用K-B法對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將純化培養(yǎng)的菌液均勻涂布于TSA/巧克力培養(yǎng)平板，待表面菌液干燥后加入藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，判定分離菌藥物敏感性。

1.2.8 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 以1×108CFU/mL細(xì)菌培養(yǎng)物，0.2 mL/只腹腔接種試驗(yàn)小鼠，另以無(wú)菌生理鹽水0.2 mL/只注射小鼠作為對(duì)照，每組5只，連續(xù)觀察5 d，記錄小鼠的發(fā)病和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 送檢雛鴨臨床癥狀

5只送檢病危雛鴨精神沉郁、頭頸歪斜、呼吸困難、癱倒無(wú)力、羽毛污穢，泄殖腔周圍有污綠色排泄物(圖1A和圖1B)。5只病死雛鴨頭頸歪斜、羽毛粗亂，部分雛鴨泄殖腔周圍有污物，口腔內(nèi)有黃黑色黏稠物質(zhì)(圖1C和圖1D)。

A.病危雛鴨大體照；B.病危雛鴨頭頸部；C.病死雛鴨大體照；D.病死雛鴨口腔污物

2.2 送檢雛鴨剖檢病理變化

對(duì)雛鴨進(jìn)行剖檢，打開胸腔和腹腔后，病危雛鴨各臟器界限清晰，肝略腫大、部分區(qū)域黃白色，心包有少量漿液性滲出，其余臟器無(wú)明顯變化(圖2A和圖2B)。病死雛鴨臟器粘連，肝腫大、棕紅色，心臟皺縮，肝臟表面和心包內(nèi)有大量易剝離的纖維素性滲出物(圖2C、圖2D和圖2E)。

A.病危雛鴨胸腔和腹腔臟器；B.病危雛鴨各主要臟器；C.病死雛鴨胸腔和腹腔臟器；D.病死雛鴨大量纖維素滲出；E.病死雛鴨肝臟和心臟

2.3 送檢雛鴨常見(jiàn)病原的PCR檢測(cè)

為了確定送檢雛鴨是否感染了常見(jiàn)的病毒，采集10只送檢雛鴨部分組織臟器，分別提取DNA和RNA，以提取的DNA和反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，分別PCR檢測(cè)鴨8種常見(jiàn)病原，結(jié)果顯示，在所有10只雛鴨組織中均未獲得DTMUV、FAdV Ⅰ、FAdV Ⅱ、DHAV、MDPV和AIV H9等病毒以及RA的特異性擴(kuò)增條帶，而10只雛鴨組織中均檢測(cè)到大小為250 bp的E.coli陽(yáng)性條帶(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～10.雛鴨樣品；NC.陰性對(duì)照

2.4 送檢雛鴨滲出物細(xì)菌培養(yǎng)鑒定

將10只送檢雛鴨的肝臟表面和心包滲出物分別接種LB培養(yǎng)平板和TSA/巧克力培養(yǎng)平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，在LB培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)有多量圓形、光滑、半透明灰白色菌落，在TSA/巧克力培養(yǎng)平板生長(zhǎng)有較少表面光滑、圓形半透明的菌落。從LB培養(yǎng)平板隨機(jī)挑取10個(gè)菌落后，利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR(圖4)，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast分析，與E.coli參考菌株的基因序列同源性均達(dá)到99%以上。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～10.菌落

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。本試驗(yàn)分離的E.coli對(duì)氨芐西林、阿莫西林、新霉素、紅霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、多黏菌素B和復(fù)方新諾明等藥物耐藥，而對(duì)慶大霉素、卡那霉素、阿奇霉素、頭孢他啶、頭孢氨芐、氧氟沙星和多西環(huán)素等藥物敏感。

表2 鴨大腸埃希氏菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

小鼠腹腔接種0.2 mL濃度為1×108CFU/mL的分離菌后，接種小鼠全部死亡，分離培養(yǎng)小鼠肝臟病菌，發(fā)現(xiàn)與病死鴨分離的E.coli形態(tài)和培養(yǎng)特性一致，PCR鑒定為E.coli?？瞻讓?duì)照組小鼠全部存活。

3 討論

規(guī)?；唸?chǎng)由于養(yǎng)殖密度大、鴨群生活環(huán)境潮濕、鴨舍衛(wèi)生情況不達(dá)標(biāo)等原因，常見(jiàn)多種病原感染，包括細(xì)菌性病原E.coli和RA[1-2]，病毒性病原DTMUV、FAdV Ⅰ、FAdV Ⅱ、DHAV、MDPV和AIV H9等[3-8]，這些病原往往混合感染，使患病鴨在臨床上表現(xiàn)出復(fù)雜的癥狀和病理變化，給疫病的診斷帶來(lái)一定的困難，造成更嚴(yán)重的損失。在本次北京鴨養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)的病例中，我們首先通過(guò)組織PCR排除了病危雛鴨和病死雛鴨存在常見(jiàn)病毒的感染，推測(cè)其病變可能是由于E.coli或RA感染所致。

E.coli感染導(dǎo)致的鴨大腸桿菌病臨床表現(xiàn)多種多樣，有敗血癥、臍炎、呼吸道型、輸卵管炎、腹水癥、鼻竇炎、腫頭和腹瀉等，其中臨床常見(jiàn)敗血型鴨大腸桿菌病，患病鴨剖檢可見(jiàn)明顯的心包炎、肝周炎、腹膜炎、氣囊炎，組織臟器周圍可見(jiàn)明顯的纖維素或干酪樣滲出物，嚴(yán)重的呈現(xiàn)塊狀，可以從心血、肝臟、脾臟、腦等器官進(jìn)行細(xì)菌分離[9]。但鴨大腸桿菌病的臨床癥狀與鴨傳染性漿膜炎有較高相似性，肉眼往往難以鑒別。鴨傳染性漿膜炎是由RA感染導(dǎo)致的疾病，常表現(xiàn)為精神沉郁、厭食、頭頸歪斜，有神經(jīng)癥狀，病鴨眼眶和鼻孔周圍有黏性分泌物，部分病鴨有呼吸道癥狀、咳嗽和打噴嚏等出現(xiàn)，糞便稀薄呈綠色或是黃綠色，典型病理變化為敗血癥，以及由于漿膜表面纖維素性滲出導(dǎo)致的心包炎和肝周炎等[10]。在本次北京鴨養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)的雛鴨急性死亡病例中，基于臨床癥狀和病理變化難以做出準(zhǔn)確的診斷，還需要借助細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定和動(dòng)物致病性試驗(yàn)進(jìn)行鑒別診斷。本研究首先已通過(guò)PCR檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，不論在病危雛鴨還是病死雛鴨組織樣本中均能檢測(cè)到E.coli。隨后對(duì)雛鴨滲出物中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的菌落主要為E.coli，動(dòng)物致病性試驗(yàn)也證實(shí)分離的E.coli能導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)相同的癥狀。因此，對(duì)于這起雛鴨急性死亡病例的診斷結(jié)果為鴨大腸埃希氏菌感染所致。臨床上對(duì)分離細(xì)菌主要使用抗菌藥物進(jìn)行治療，但抗菌藥物的廣泛使用又造成了耐藥菌株的出現(xiàn)[2，11]。本研究對(duì)分離的E.coli進(jìn)行耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，分離的E.coli菌株主要對(duì)青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類、多肽類和磺胺類抗菌藥物耐藥，而對(duì)頭孢類和四環(huán)素類抗菌藥物較敏感，為本次疫情的臨床合理用藥提供了依據(jù)。

在北京鴨的養(yǎng)殖過(guò)程中，常常因多種病原的混合感染導(dǎo)致出現(xiàn)各種類型的疾病，且這些疾病的臨床癥狀和病理變化相似性較高，往往需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方能確診，在本起疫情的診斷過(guò)程中，通過(guò)病理學(xué)檢測(cè)方法和病原學(xué)檢測(cè)方法，最終確定了為鴨大腸埃希氏菌感染所致，且分離的鴨大腸埃希氏菌具有一定的耐藥性，診斷結(jié)果為陜西省韓城市北京鴨養(yǎng)殖場(chǎng)的疫病防控提供了指導(dǎo)，為企業(yè)減少損失提供了技術(shù)支撐。