阮明月，吳 凱，周占榮，鄧佳玲，韓丙辛，杜守穎，韓 寧

·藥劑與工藝·

聚單寧酸包覆的PLGA納米粒裝載β-欖香烯用于光熱-化療聯(lián)合抗腫瘤的研究

阮明月，吳 凱，周占榮，鄧佳玲，韓丙辛，杜守穎*，韓 寧*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

為了實(shí)現(xiàn)光熱化療聯(lián)合治療，提高抗腫瘤效果，將具有抗腫瘤作用的β-欖香烯（β-elemene，Ele）裝載于聚乳酸羥基乙酸共聚物［poly(,-lactide-co-glycolic acid)，PLGA］納米粒（Ele-PLGA NPs）中，并在載藥納米粒表面進(jìn)一步包覆了聚單寧酸（poly-tannic acid，pTA），制得Ele-PLGA-pTA納米粒（Ele-PLGA-pTA NPs）。首先利用O/W乳化法制備Ele-PLGA NPs，然后加入單寧酸與Fe3+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成pTA分子層附著在Ele-PLGA NPs表面，最終形成Ele-PLGA-pTA NPs，通過(guò)馬爾文激光粒度儀和透射電子顯微鏡對(duì)該系統(tǒng)的粒徑、ζ電位、穩(wěn)定性以及粒子形態(tài)進(jìn)行考察；分別利用HPLC法和BCA試劑盒對(duì)β-欖香烯的載藥量和單寧酸的包覆率進(jìn)行測(cè)定；通過(guò)紅外熱成像儀評(píng)價(jià)PLGA-pTA NPs的光熱升溫效率和光熱穩(wěn)定性；通過(guò)MTT法考察載藥納米粒對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞（Lewis lung cancer cell，LLC）的細(xì)胞毒性；通過(guò)建立小鼠LLC皮下腫瘤模型對(duì)Ele-PLGA-pTA NPs的體內(nèi)光熱-化療聯(lián)合抗腫瘤效果進(jìn)行探究。經(jīng)測(cè)定，Ele-PLGA-pTA NPs對(duì)β-欖香烯的載藥量和單寧酸的包覆率分別為（6.6±0.1）%、（5.4±0.1）%。其形態(tài)呈球形，粒徑為（202.9±2.7）nm，ζ電位為（?37.5±0.2）mV，分散性良好。體外光熱性能考察結(jié)果表明，在近紅外激光（NIR laser）的照射下，PLGA-pTA NPs表現(xiàn)出良好的光熱轉(zhuǎn)換能力和光熱穩(wěn)定性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白載體組（PLGA-pTA NPs）基本沒(méi)有細(xì)胞毒性，與單一化療組（Ele-PLGA-pTA NPs）相比，光熱-化療聯(lián)合組（Ele-PLGA-pTA NPs＋Laser）具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與單純光熱治療組（PLGA-pTA NPs＋Laser）和單一化療組（Ele-PLGA-pTA NPs）對(duì)照組相比，光熱-化療聯(lián)合組（Ele-PLGA-pTA NPs＋Laser）對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果最為顯著（＜0.001）。所制備的Ele-PLGA-pTA NPs能夠?qū)崿F(xiàn)光熱-化療聯(lián)合治療，顯著提高抗腫瘤效果。

β-欖香烯；光熱-化療聯(lián)合治療；聚單寧酸；納米粒；聚乳酸羥基乙酸共聚物；抗腫瘤

β-欖香烯（β-elemene，Ele）是從姜科姜黃屬植物溫郁金Y. H. Chen et C. Ling中提取的廣譜抗腫瘤藥物，不良反應(yīng)小[1]，臨床常應(yīng)用于多種惡性腫瘤的輔助治療[2]。其主要是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等來(lái)發(fā)揮作用。但β-欖香烯由于水溶性差、對(duì)腫瘤的殺傷能力較弱及生物利用度低等缺點(diǎn)，導(dǎo)致其臨床療效不顯著，而且β-欖香烯注射劑在iv時(shí)會(huì)產(chǎn)生靜脈炎和疼痛等不良反應(yīng)[3-4]。因此，需要開(kāi)發(fā)能夠克服以上不足的新型藥物遞送系統(tǒng)，以提高其療效。

近年來(lái)，利用納米粒作為藥物的遞送載體已成為藥劑學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5]。目前，文獻(xiàn)中關(guān)于β-欖香烯的新型給藥系統(tǒng)包括脂質(zhì)體（liposome）、固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles）、微乳（microemulsion）和微囊（microcapsule）等[6-7]。其中，聚合物聚乳酸羥基乙酸共聚物［poly(,-lactide-co-glycolic acid)，PLGA］納米粒（PLGA NPs），由于其良好的生物相容性和生物降解性，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于臨床治療[8]，因此本研究擬利用PLGA NPs作為β-欖香烯的載體進(jìn)行抗腫瘤研究。

光熱療法（photothermal therapy，PTT）是利用光熱材料在近紅外光的照射下，將光能轉(zhuǎn)換為熱能，通過(guò)高溫誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死的治療方法[9]。通常腫瘤細(xì)胞對(duì)高溫較為敏感，當(dāng)腫瘤部位溫度超過(guò)一定數(shù)值（約42 ℃）時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA及蛋白質(zhì)變性和細(xì)胞膜損傷等[10]。通過(guò)光熱材料的局部給藥或近紅外光的局部照射，可以控制光熱療法的溫度和施加部位，從而降低對(duì)周圍正常組織的損傷[11]。常見(jiàn)的光熱材料包括無(wú)機(jī)納米粒，如金納米粒、碳納米粒、黑磷納米粒和硫化銅納米粒，但無(wú)機(jī)材料生物相容性較低，且大多存在降解困難的問(wèn)題[9]，而有機(jī)小分子光敏劑如吲哚箐綠（indocyanine green，ICG）等則存在光熱穩(wěn)定性差、易發(fā)生降解和光漂白現(xiàn)象等問(wèn)題[12]。因此，開(kāi)發(fā)光熱穩(wěn)定性好且生物可降解的光熱劑是光熱療法的關(guān)鍵。

單寧酸是一種來(lái)源于植物的天然多酚類化合物，具有良好的生物相容性和生物降解性，已被FDA接受并廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥中[13]。在中性水溶液中，單寧酸能夠與Fe3+快速而高效地絡(luò)合形成穩(wěn)定的聚單寧酸（poly-tannic acid，pTA）分子層包覆于不同納米粒表面，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚單寧酸具有較強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)化效率，有望成為新型光熱劑，用于實(shí)現(xiàn)光熱療法抗腫瘤。

近年來(lái)，聯(lián)合療法即將不同治療方法結(jié)合，以發(fā)揮聯(lián)合抗腫瘤效果得到了研究人員的廣泛關(guān)注，與單一化療或光熱療法相比，將光熱療法與化療相結(jié)合具有許多優(yōu)勢(shì)[14]。光熱療法能夠克服單一化療作用選擇性低及易產(chǎn)生多藥耐藥性這一問(wèn)題，而化療則能協(xié)助光熱療法徹底清除腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤的復(fù)發(fā)[15]。光熱療法還可以通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境，從而增加載藥納米粒在腫瘤部位的蓄積，增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞膜透過(guò)性以及腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[16-17]。因此本研究擬將β-欖香烯介導(dǎo)的化療與聚單寧酸介導(dǎo)的光熱療法相結(jié)合，以期提高抗腫瘤效果，同時(shí)降低不良反應(yīng)[18]。

本研究將β-欖香烯作為化療藥物裝載于PLGA NPs中，以聚單寧酸作為光熱材料包覆于載藥納米粒表面，從而制得Ele-PLGA-pTA NPs，并對(duì)該納米粒的粒徑、ζ電位、穩(wěn)定性和粒子形態(tài)進(jìn)行了表征，測(cè)定β-欖香烯的載藥量和單寧酸的包覆率，評(píng)價(jià)PLGA-pTA NPs的體外光熱性能，探究Ele-PLGA-pTA NPs對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞（Lewis lung cancer cell，LLC）的光熱-化療聯(lián)合抗腫瘤作用，并對(duì)Ele-PLGA-pTA NPs的體內(nèi)抗腫瘤效果進(jìn)行了考察。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSA 224S型電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司；TGL-16型醫(yī)用離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；S/N 601-0723型馬爾文激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；Clario Star型酶標(biāo)儀，德國(guó)BMG Labtech公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；色譜柱為Diamonsil?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；JEM-2100型透射電子顯微鏡（SEM），日本JEOL公司；Ax5型熱成像儀，美國(guó)FLIR公司；C170型二氧化碳培養(yǎng)箱，德國(guó)Binder公司；CKX41-A22PHP型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Captair Bio 321 Smart型超凈工作臺(tái)，法國(guó)Erlab公司；游標(biāo)卡尺，上海賽拓五金有限公司。

1.2 試劑

β-欖香烯（批號(hào)L02253-180701，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），購(gòu)自上海高朗化工科技有限公司；單寧酸（批號(hào)M61018012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、,-雙(2-羥乙基)甘氨酸（bicine，批號(hào)C10056646，GR）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，AR，批號(hào)C10287792）均購(gòu)自上海麥克林有限公司；二氯甲烷（批號(hào)20201018）購(gòu)自現(xiàn)代東方（北京）科技發(fā)展有限公司；PLGA（型號(hào)DG-75DLG035）購(gòu)自濟(jì)南代鋼生物材料有限公司；三氯化鐵（FeCl3，AR，批號(hào)20140310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)20200911）購(gòu)自天津百倫斯生物技術(shù)有限公司；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC，批號(hào)B80581）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-polyethylene glycol 2000，DSPE-PEG2000，批號(hào)C00486）均購(gòu)自上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司；BCA試劑盒（批號(hào)109012）、MTT（批號(hào)2018092101）、RPMI 1640（批號(hào)12019003）購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)A87F82H）購(gòu)自美國(guó)Gemini生物科技有限公司；抗青霉素（100 U/mL）-抗鏈霉素（100 μg/mL），批號(hào)15140122，購(gòu)自格蘭島生命科技公司；胰蛋白酶（批號(hào)25200056）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；所有其他化學(xué)品均來(lái)自Sigma-Aldrich公司。

1.3 細(xì)胞與動(dòng)物

小鼠LLC細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；SPF級(jí)C57BL/6J雌性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于斯貝福北京生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫（25±1）℃，空氣濕度55%～65%，12 h光暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循北京中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)為BUCM-4-2021110106-4066。

2 方法與結(jié)果

2.1 Ele-PLGA-pTA NPs的制備

采用O/W乳化法以DPPC和DSPE-PEG2000作為乳化劑，制備Ele-PLGA NPs。稱取40 mg PLGA、5 mg β-欖香烯、4 mg DPPC和4 mg DSPE-PEG2000，加入1.5 mL二氯甲烷使其完全溶解，作為有機(jī)相。再加入16 mL去離子水為水相。將混合物用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行探頭超聲（冰水浴，超聲功率200 W，2 s開(kāi)2 s關(guān)，超聲2 min）使其充分乳化，經(jīng)旋蒸去除有機(jī)溶劑后得到白色混懸液，16 000 r/min離心（離心半徑5.9 cm）15 min，洗滌2次，得到Ele-PLGA NPs。將Ele-PLGA NPs分散于bicine緩沖液（10 mmol/L，pH值7.4）中，使納米粒質(zhì)量濃度為2 mg/mL，然后加入一定體積的單寧酸溶液和FeCl3溶液（單寧酸與FeCl3的質(zhì)量比為1∶2），在水浴超聲（冰水浴，超聲功率120 W，2 s開(kāi)2 s關(guān)，超聲2 min）條件下混合，經(jīng)2次離心（轉(zhuǎn)速16 000 r/min，離心半徑5.9 cm，時(shí)間15 min），去除過(guò)量的聚單寧酸，即得Ele-PLGA-pTA NPs。

2.2 納米粒的物理表征

將Ele-PLGA NPs和Ele-PLGA-pTA NPs分別分散于去離子水和PBS溶液（5 mmol/L，pH值7.4）中，利用馬爾文激光粒度儀測(cè)定樣品的平均粒徑、多分散系數(shù)（PDI）及ζ電位。利用TEM觀察納米粒的實(shí)際形態(tài)。結(jié)果見(jiàn)表1和圖1～5。

單寧酸溶液與FeCl3溶液外觀為黃色透明溶液，將二者混合即形成深藍(lán)色的聚單寧酸，證明單寧酸與Fe3+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成了聚單寧酸（圖1）。

所制備的Ele-PLGA NPs混懸液為白色，Ele-PLGA-pTA NPs混懸液為深紫色（圖2），樣品的顏色變化證明了聚單寧酸的包覆。馬爾文激光粒度儀測(cè)定結(jié)果如表1和圖3所示，Ele-PLGA NPs的粒徑為（195.9±3.9）nm，經(jīng)過(guò)聚單寧酸包覆后的Ele-PLGA-pTA NPs的粒徑為（202.9±2.7）nm，粒徑略有增大。PDI值均很小，顯示2種納米粒的分散性良好。Ele-PLGA NPs的ζ電位為（?15.3±0.7）mV，而Ele-PLGA-pTA NPs的ζ電位為（?37.5±0.2）mV（表1和圖4），下降明顯，原因是Ele-PLGA-pTA NPs表面所包覆的聚單寧酸，其結(jié)構(gòu)中存在著大量的酚羥基，使得Ele-PLGA-pTA NPs帶負(fù)電荷。

表1 不同樣品的粒徑、PDI及ζ電位測(cè)定結(jié)果

圖1 單寧酸溶液(a)、FeCl3溶液(b)和聚單寧酸樣品(c)形態(tài)

圖2 Ele-PLGA NPs混懸液(a)和Ele-PLGA-pTA NPs混懸液(b)形態(tài)

圖3 Ele-PLGA NPs和Ele-PLGA-pTA NPs粒徑分布

圖4 Ele-PLGA NPs和Ele-PLGA-pTA NPs ζ電位分布

圖5 Ele-PLGANPs(a)和Ele-PLGA-pTANPs(b)的TEM圖

TEM結(jié)果顯示，Ele-PLGA NPs、Ele-PLGA-pTA NPs均為球形，平均粒徑在100～200 nm。Ele-PLGA NPs表面光滑呈亮白色，而Ele-PLGA-pTA NPs表面有褶皺狀薄膜呈灰色，證明了聚單寧酸的成功包覆（圖5）。

2.3 β-欖香烯載藥量以及單寧酸包覆率的測(cè)定

將Ele-PLGA-pTA NPs分散于1 mL去離子水中，吸取100 μL樣品，加入500 μL乙腈將載藥納米粒溶解，再加入400 μL去離子水使PLGA析出，而β-欖香烯仍溶解于混合溶劑中，離心（轉(zhuǎn)速16 000 r/min，離心半徑5.9 cm，時(shí)間15 min）去除PLGA沉淀，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法學(xué)[19]，采用HPLC法測(cè)定上清液中β-欖香烯的含量。另外吸取800 μL樣品離心，收集沉淀并烘干，采用稱重法測(cè)定樣品的質(zhì)量。計(jì)算β-欖香烯的載藥量。

β-欖香烯載藥量＝β-欖香烯的質(zhì)量/Ele-PLGA-pTA NPs的質(zhì)量

采用BCA試劑盒測(cè)定Ele-PLGA-pTA NPs中單寧酸的含量。將Ele-PLGA-pTA NPs分散于1 mL去離子水中，吸取60 μL樣品，與600 μL BCA工作試劑混合，于室溫下避光反應(yīng)1 h，16 000 r/min離心（離心半徑5.9 cm）15 min，取上清液。利用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液在562 nm下的吸光度（）值。通過(guò)預(yù)先建立的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[20-21]，計(jì)算樣品中單寧酸的質(zhì)量濃度及其質(zhì)量。計(jì)算單寧酸包覆率。

單寧酸包覆率＝單寧酸質(zhì)量/Ele-PLGA-pTA NPs質(zhì)量

結(jié)果測(cè)得β-欖香烯的載藥量為（6.6±0.1）% （＝3），單寧酸的包覆率為（5.4±0.1）%（＝3）。

2.4 體外光熱性能考察

采用可見(jiàn)分光光度計(jì)考察PLGA-pTA NPs的全波長(zhǎng)吸收特征，將PLGA-pTA NPs用去離子水分散（聚單寧酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL），置于石英比色皿中，在300～900 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定PLGA-pTA NPs的全波長(zhǎng)吸收光譜。

采用紅外熱成像儀對(duì)PLGA-pTA NPs的體外升溫能力進(jìn)行考察，吸取1 mL含不同聚單寧酸質(zhì)量濃度（25、50、75、100 μg/mL）的PLGA-pTA NPs混懸液，置于808 nm激光（2.0 W/cm2）下照射7 min，并用紅外攝像機(jī)每隔15 s記錄樣品的實(shí)時(shí)溫度，并利用FLIR工具軟件進(jìn)行分析。

考察PLGA-pTA NPs和游離吲哚箐綠的升溫穩(wěn)定性。將含聚單寧酸質(zhì)量濃度為75 μg/mL的PLGA-pTA NPs混懸液與50 μg/mL的吲哚箐綠溶液分別用808 nm激光（2.0 W/cm2）照射后，關(guān)閉激光光源，待樣品自然冷卻至室溫后，再次打開(kāi)激光進(jìn)行照射，重復(fù)4次，用紅外攝像機(jī)連續(xù)記錄樣品的溫度變化情況，并用FLIR工具軟件進(jìn)行分析。

由圖6-A所知，PLGA-pTA NPs在波長(zhǎng)300～900 nm具有廣泛的吸收，PLGA-pTA NPs在660 nm具有較高的吸收，但是一般激光波長(zhǎng)越長(zhǎng)，組織穿透能力越強(qiáng)[22]，為了實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)的組織穿透能力，實(shí)驗(yàn)選擇808 nm作為激光照射波長(zhǎng)。

由圖6-B可知，在近紅外激光的照射下，PBS組的溫度基本無(wú)變化，而含有PLGA-pTA NPs的樣品則升溫明顯，并且隨著聚單寧酸的質(zhì)量濃度增大，溫度升高幅度越大，說(shuō)明Ele-PLGA NPs的升溫能力具有濃度相關(guān)性。而當(dāng)聚單寧酸的質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，樣品的溫度能夠升高近60 ℃，說(shuō)明聚單寧酸具有很強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)化能力。

由圖6-C可知，在激光的反復(fù)照射下，PLGA-pTA NPs在4次激光“開(kāi)-關(guān)”循環(huán)過(guò)程中所達(dá)到的最高溫度略有下降，表明聚單寧酸具有較高的光熱穩(wěn)定性，不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象。而常見(jiàn)小分子光敏劑吲哚箐綠在第4次激光“開(kāi)-關(guān)”過(guò)程中所達(dá)到的最高溫度發(fā)生明顯下降，表明游離吲哚箐綠光熱穩(wěn)定性差，易發(fā)生光漂白現(xiàn)象。

A-PLGA-pTA NPs的全波長(zhǎng)吸收光譜（聚單寧酸質(zhì)量濃度為2 μg?mL?1） B-含不同質(zhì)量濃度聚單寧酸的PLGA-pTA NPs升溫曲線（808 nm，2.0 W?cm?2） C-PLGA-pTA NPs（聚單寧酸質(zhì)量濃度為75 μg?mL?1）和游離吲哚箐綠（質(zhì)量濃度為50 μg?mL?1）的光熱穩(wěn)定性

2.5 體外光熱細(xì)胞毒性考察

采用MTT法考察Ele-PLGA-pTA NPs對(duì)小鼠LLC細(xì)胞的光熱-化療聯(lián)合抗腫瘤作用。將Ele-PLGA-pTA NPs用培養(yǎng)基稀釋至不同β-欖香烯質(zhì)量濃度（13、20、26、33、39 μg/mL），未載藥的PLGA-pTA NPs也用培養(yǎng)基按照一定比例稀釋，使PLGA-pTA NPs樣品中的聚單寧酸質(zhì)量濃度與Ele-PLGA-pTA NPs樣品中的聚單寧酸質(zhì)量濃度（5.0、7.5、10.0、12.0、15.0 μg/mL）相等。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組（空白載體，PLGA-pTA NPs）、化療組（Ele-PLGA-pTA NPs）和光熱-化療聯(lián)合組（Ele-PLGA-pTA NPs＋Laser）。將小鼠LLC細(xì)胞鋪種于96孔板（1×104個(gè)/孔）中，待細(xì)胞貼壁后，于每孔中加入不同的樣品。待樣品與細(xì)胞共孵育4 h后，將光熱-化療聯(lián)合組的每個(gè)孔置于808 nm激光（2.0 W/cm2）下照射5 min。然后棄去含藥培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h。最后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。未經(jīng)激光照射的對(duì)照組（PLGA-pTA NPs）和化療組（Ele-PLGA-pTA NPs）也作相同的處理。

細(xì)胞存活率＝給藥/對(duì)照

結(jié)果如圖7所示，空白載體組的細(xì)胞存活率略微出現(xiàn)下降，說(shuō)明空白載體在測(cè)試質(zhì)量濃度內(nèi)的細(xì)胞毒很低。對(duì)于單一化療組，隨著β-欖香烯質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸下降，β-欖香烯對(duì)小鼠LLC細(xì)胞的細(xì)胞毒性不斷增強(qiáng)。在相同β-欖香烯質(zhì)量濃度下，與單一化療組相比，光熱-化療聯(lián)合組則表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，在β-欖香烯質(zhì)量濃度為33 μg/mL、聚單寧酸質(zhì)量濃度為12.0 μg/mL，以及β-欖香烯質(zhì)量濃度為39 μg/mL、聚單寧酸質(zhì)量濃度為15.0 μg/mL的條件下，2組之間的差異最為顯著 （＜0.001），光熱-化療聯(lián)合組的細(xì)胞存活率分別為21.6%和8.0%，明顯低于單一化療組（57.9%和45.8%）。結(jié)果表明，將β-欖香烯介導(dǎo)的化療與聚單寧酸介導(dǎo)的光熱療法相結(jié)合，能更有效地殺死腫瘤細(xì)胞。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與化療組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001

2.6 體內(nèi)藥效學(xué)研究

用培養(yǎng)基配制5×106個(gè)/mL的LLC細(xì)胞懸液，皮下接種于小鼠身體右側(cè)（每只0.1 mL），待腫瘤體積生長(zhǎng)至100～200 mm3后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組（＝4），即對(duì)照組、化療組（Ele-PLGA-pTA NPs）、光熱組（PLGA-pTA NPs＋Laser）和光熱-化療聯(lián)合組（Ele-PLGA-pTA NPs＋Laser）。通過(guò)瘤內(nèi)注射給藥，注射體積為50 μL，β-欖香烯給藥劑量為40 mg/kg。給藥后立刻對(duì)光熱組和光熱-化療聯(lián)合組的腫瘤區(qū)域用激光（808 nm、2.0 W/cm2）照射5 min。每3天給藥1次，連續(xù)給藥2次。隔天用天平稱量小鼠體質(zhì)量，并通過(guò)游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、短徑，計(jì)算瘤體積。連續(xù)記錄12 d。待試驗(yàn)結(jié)束后，將各組小鼠脫頸處死，取出各組腫瘤組織并稱定質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率，同時(shí)對(duì)離體腫瘤進(jìn)行拍照。

腫瘤抑制率＝1－實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量

不同給藥組小鼠的腫瘤體積變化結(jié)果如圖8-A所示，與對(duì)照組相比，化療組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)僅表現(xiàn)出輕微的抑制作用，可能的原因?yàn)殡m然經(jīng)瘤內(nèi)注射給藥，藥物全部集中在腫瘤組織，但藥物未能在瘤內(nèi)實(shí)現(xiàn)均勻擴(kuò)散，以及腫瘤細(xì)胞對(duì)β-欖香烯不夠敏感，導(dǎo)致抑瘤效果欠佳。與單一化療組類似，單一光熱組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用也不夠顯著，可能的原因包括①納米粒在瘤內(nèi)分布不均勻；②激光的穿透能力有限，不能深入到腫瘤內(nèi)部。而對(duì)于光熱-化療聯(lián)合組，其抗腫瘤效果最為顯著，可能的原因是聚單寧酸的光熱作用不僅殺死了部分腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還有利于β-欖香烯的釋放和擴(kuò)散，而β-欖香烯則可以作用于深處的腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮其毒性作用。該結(jié)果表明Ele-PLGA-pTA NPs介導(dǎo)的光熱-化療聯(lián)合療法能夠更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)，取得更好的治療效果。

不同給藥組的小鼠在給藥前后體質(zhì)量情況如圖8-B所示，給藥前各組小鼠體質(zhì)量比較，均無(wú)顯著性差異。在給藥后的觀察期間，對(duì)照組小鼠平均體質(zhì)量略有增加，可能是由于腫瘤體積增大所引起的，單獨(dú)化療組與光熱組的小鼠體質(zhì)量在最后2 d略有下降，這與小鼠狀態(tài)不佳有關(guān)。而光熱-化療聯(lián)合組小鼠的體質(zhì)量則基本無(wú)變化，說(shuō)明光熱-化療聯(lián)合治療較為安全，不會(huì)對(duì)小鼠產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)。但由于不同組小鼠的體質(zhì)量存在較大標(biāo)準(zhǔn)差，使得不同組在給藥后的不同天數(shù)，小鼠的平均體質(zhì)量均無(wú)顯著性差異。

A-腫瘤體積生長(zhǎng)曲線 B-體質(zhì)量變化曲線 C-離體腫瘤圖片 與對(duì)照組比較：*P＜0.05

從離體腫瘤組織圖片（圖8-C）可以看出，與其他組相比，光熱-化療聯(lián)合組的腫瘤體積最?。荒[瘤組織稱定質(zhì)量結(jié)果（表2）顯示，對(duì)照組平均瘤質(zhì)量為（1.28±0.47）g，化療組和光熱組的平均瘤質(zhì)量分別為（0.91±0.31）g和（0.75±0.30）g，而光熱-化療組的腫瘤質(zhì)量最輕，僅為（0.36±0.31）g （＜0.01）?；熃M、光熱組和光熱-化療聯(lián)合組的腫瘤抑制率分別為28.9%、41.4%、71.9%。以上結(jié)果表明，將聚單寧酸介導(dǎo)的光熱療法和β-欖香烯介導(dǎo)的化療相結(jié)合能夠顯著提高抗腫瘤效果。

表2 荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率(, n = 4)

與對(duì)照組比較：**＜0.01

**< 0.01control group

3 討論

本研究制備了Ele-PLGA-pTA NPs納米遞送系統(tǒng)，將化療藥物β-欖香烯與光熱材料聚單寧酸相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)化療和光熱療法的聯(lián)合治療提供了思路與借鑒。通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)光熱效應(yīng)研究，評(píng)價(jià)Ele-PLGA-pTA NPs納米遞送系統(tǒng)的光熱-化療聯(lián)合抗腫瘤效果，為化療和光熱療法的聯(lián)合應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

單寧酸含有大量的酚羥基，具有一定的黏附性，可通過(guò)分子間的相互作用如氫鍵、疏水作用和π-π堆積作用附著于基質(zhì)表面，所以在制備Ele-PLGA-pTA NPs時(shí)，首先加入單寧酸溶液，使單寧酸附著于Ele-PLGA NPs表面，再加入Fe3+，使二者迅速絡(luò)合[23]。研究發(fā)現(xiàn)pH（4.0和7.4）對(duì)單寧酸的包覆率影響較小，但在酸性條件下金屬絡(luò)合物可能會(huì)發(fā)生降解[24]，所以聚單寧酸的包覆選擇在中性環(huán)境下進(jìn)行。前期實(shí)驗(yàn)也顯示，F(xiàn)eCl3與單寧酸質(zhì)量比的變化對(duì)單寧酸的包覆率沒(méi)有明顯的影響，但是隨著FeCl3與單寧酸質(zhì)量比的增加，樣品的升溫幅度也顯著增強(qiáng)，可能是與單寧酸絡(luò)合的Fe3+含量增加導(dǎo)致聚單寧酸的近紅外區(qū)域吸收增強(qiáng)有關(guān)[25]。

納米粒經(jīng)過(guò)尾iv后，通過(guò)高通透性和長(zhǎng)滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）到達(dá)腫瘤部位的質(zhì)量濃度比較少，由于聚單寧酸的質(zhì)量濃度會(huì)影響光熱升溫效果[26]，所以實(shí)驗(yàn)選擇采用瘤內(nèi)注射的方式來(lái)保證聚單寧酸的質(zhì)量濃度。

Ele-PLGA-pTA NPs納米遞送系統(tǒng)在光熱-化療聯(lián)合抗腫瘤方面具有一定的應(yīng)用前景，但仍需對(duì)Ele-PLGA-pTA NPs介導(dǎo)的聯(lián)合治療的安全性和有效性進(jìn)行更加全面的考察，并對(duì)其抗腫瘤作用的產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Polytannic acid coated PLGA nanoparticles loaded with β-elemene for combined chemo-photothermal therapy in cancer treatment

RUAN Ming-yue, WU Kai, ZHOU Zhan-rong, DENG Jia-ling, HAN Bing-xin, DU Shou-ying, HAN Ning

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To achieve combined chemo-photothermal therapy for improved anti-tumor efficacy, β-elemene (Ele) with anti-tumor effect was encapsulated into poly(,-lactide-co-glycolic acid) nanoparticles (Ele-PLGA NPs) and coated with a poly-tannic acid (pTA) layer to obtain Ele-PLGA-pTA NPs.Firstly, Ele-PLGA NPs were prepared by an O/W emulsification method, then the following added with tannic acid and Fe3+could coordinate with each other and form a steady pTA layer on the surface of Ele-PLGA NPs to obtain Ele-PLGA-pTA NPs. The prepared Ele-PLGA-pTA NPs were characterized in particle size, ζ potential, stability and morphology through DLS and TEM. The drug loading efficiency of β-elemene and the coating rate of tannic acid were quantified by HPLC and the BCA kit, respectively. In addition, the photothermal effect and photothermal stability of PLGA-pTA NPs were evaluated by an IR camera and analyzed by the FLIR software. The cytotoxicity of Ele-PLGA-pTA NPs on Lewis lung cancer cell (LLC) was investigated by MTT assay. And theanti-tumor efficacy was explored on LLC tumor bearing mice.For the prepared Ele-PLGA-pTA NPs, the drug loading efficiency of β-elemene and the coating rate of tannic acid were (6.6 ± 0.1)% and (5.4 ± 0.1)%, respectively. Ele-PLGA-pTA NPs were spherical in shape, the ζ potential was (?37.5 ± 0.2) mV and the particle size was (202.9 ± 2.7) nm with good dispersibility. PLGA-pTA NPs exhibited high photothermal conversion effficiency and photothermal stability. Compared to single chemotherapy (Ele-PLGA-pTA NPs), the combined chemo-photothermal therapy (Ele-PLGA-pTA NPs + Laser) showed significantly enhanced cytotoxicity, while blank control (PLGA-pTA NPs) almost had no cytotoxicity. Also, the tumor inhibition rate for the combined chemo-photothermal therapy (Ele-PLGA-pTA NPs + Laser) was much higherthan that for single chemotherapy (Ele-PLGA-pTA NPs) or photothermal therapy (PLGA-pTA NPs + Laser) (< 0.001).Ele-PLGA-pTA NPs prepared could achieve combined chemo-photothermal therapy and improve the overall antitumor efficacy.

β-elemene; combined chemo-photothermal therapy; poly-tannic acid;nanoparticles; poly(,-lactide-co-glycolic acid);antitumor

R283.6

A

0253 - 2670(2022)23 - 7353 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.005

2022-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81803737）

阮明月，女，碩士研究生，主要從事納米制劑研究。Tel: 15207224220 E-mail: rmy15207224220@163.com

通信作者：杜守穎，女，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥制劑研究。Tel: 13911053905 E-mail: dusy@bucm.edu.cn

韓 寧，女，博士，主要從事納米制劑研究。Tel: 18500083932 E-mail: hanning1989@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]